专利名称：一种禽类精原干细胞的体外培养方法
技术领域：
本发明涉及转基因，动物克隆，珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。
背景技术：
精原干细胞(SSCs)是精子形成的前体细胞，是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞。随着精原干细胞体外培养技术、冻存技术和移植技术的不断发展和成熟，使精原干细胞的应用成为可能。且精原干细胞在人类医学、建立转基因动物模型及濒危动物保护上都有很重要的意义。对精原干细胞的研究逐渐成为干细胞研究领域里的一个热点。由于禽类独特的生殖生理结构和解剖学特点，使得对禽类组织与细胞工程、转基因及动物克隆方面的研究极少。
自1994年Brister和Zimmerman将可育小鼠的精原干细胞移植到不育小鼠的睾丸中并观察到精子产生以及1996年Clonthier将大鼠睾丸生殖细胞移植到免疫缺陷小鼠并产生精子之后，精原细胞逐渐成为一个研究热点。李德雪、尹明等人对小鼠精原干细胞体外培养的条件及分裂增殖的现象进行了研究。精原干细胞的培养条件、鉴定方法和移植技术都在不断的更新和完善。
研究表明，在有饲养层的基础上，以DMEM为基础培养基并加入一些添加剂及某些生长因子对哺乳动物精原干细胞的体外存活、分裂增殖及克隆形成具有良好作用，但对于鸡胚胎精原干细胞的长期培养及建系等方面的研究报道很少，仍没有摸索到最适的体外培养及传代条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽类精原干细胞的体外培养方法，为鸡精原干细胞的体外培养，对鸡精原干细胞长期培养体系及精原干细胞移植、转基因等技术提供必要的基础，给体外研究细胞的发育分化提供较好的材料。
本发明的技术方案是，一种禽类精原干细胞的体外培养方法，其特征在于将鸡胚SSCs接种到鸡胚成纤维(CEF)饲养层上，再使用通过实验摸索出的最适培养液进行培养。所用培养液为在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/L β-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/mlhSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素。
本发明获得禽类精原干细胞长期体外培养的有效方法，为利用鸡精原干细胞进行体外操作和鸡胚胎精原干细胞的进一步建系奠定研究基础。优点如下1、操作简便，可重复性强，可以满足一般利用SSCs进行体外操作的要求。
2、可以在体外对SSCs进行较长时间的培养，使其大量增殖，进行细胞与组织工程操作。
3、所获得的SSCs可进行转基因、动物克隆、嵌合体鸡的制备。
图1为原代SSCs培养48小时形成的集落×200。
图2为原代SSCs培养96小时形成的集落×200。
图3为第2代SSCs培养48小时形成的集落×200。
图4为第2代SSCs的AKP染色×200。
图5为鸡SSCs的SSEA-1染色鉴定×200。
具体实施例方式
实施例步骤1鸡胚胎SSCs的分离取出壳一周内的雏鸡，无菌获取鸡睾丸，用PBS中浸洗三次，在解剖镜下剥去白膜等。加入适量的PBS用力吹打。首先用10倍于组织块体积的胶原酶(1mg/mL)消化，在37℃、5％CO2浓度条件下作用5～8分钟，其作用除去精曲小管的间质细胞和一些血管成分，之后用透明质酸酶(1.5mg/mL)和胰蛋白酶(0.25％)的混合液消化3～5分钟，获取生精上皮上的SSCs和支持细胞，以消化液用量10％的FCS终止消化，未消化的组织成分用350目过滤筛过滤除去。过滤液以1000r/分钟离心8分钟，弃上清，用培养液重新悬浮细胞制成单细胞悬液，进行台盼蓝染色计算活细胞数，调整细胞浓度至104个/ml后接种到长有CEF饲养层的培养瓶中进行培养。
步骤2鸡胚胎SSCs体外培养后的生物学特性检测分别用形态学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色、阶段特异性胚胎表面抗原(SSEA-1)检测鉴定鸡胚胎SSCs。形态学鉴定如图步骤3鸡胚胎SSCs的体外培养制备培养液培养液DMEM高糖培养基，添加10％小牛血清、2％鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/L β-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素。
上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’s medium)，即杜贝克氏改良的恩格氏培养液。
通过对SSCs进行体外原代培养及继代培养，摸索出了适合SSCs在体外长期存活的较好培养体系，在有饲养层存在的条件下，在此培养体系中，SSCs生长良好，贴壁速度快，克隆形成率高，1-4代的SSCs有AKP阳性克隆形成，克隆形成率分别为47％、36％、26％、13％。由此说明，使用CEF饲养层和添别有细胞因子的培养液最适于鸡SSCs的体外培养和增殖，是最佳的培养体。
权利要求
1.一种禽类精原干细胞的体外培养方法，其特征在于将禽类精原干细胞接种到鸡胚成纤维饲养层上，再使用培养液进行培养；所述培养液为在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素。
全文摘要
本发明公开了一种禽类精原干细胞的体外培养方法，涉及转基因，动物克隆，珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。将禽类精原干细胞接种到CEF饲养层上，再使用在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％鸡血清、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10
文档编号C12N5/06GK1935984SQ200610096629
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者李碧春, 魏彩霞, 陈国宏, 孙思宇, 吴信生, 赵文明, 徐琪, 吴洪, 周冠月, 孙国波, 戴建明, 孙鹏翔, 葛剑辉 申请人:扬州大学