专利名称：稻瘟病菌无毒基因的分子标记方法
(一)技术领域本研究发明了稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)在水稻品种特异无毒基因Avr-Pit、Avr-Pia及寄主种特异无毒基因PRE1的连锁分子标记及染色体定位，属于生物技术领域。专用于稻瘟病菌田间毒性组成及演变规律的监测，同时可用于稻瘟病菌无毒基因的克隆。
(二)技术背景水稻是重要的粮食作物之一，而稻瘟病是世界分布最广、为害最严重的水稻病害之一，已成为水稻高产、稳产的主要障碍因素(Ou S H.1980，Pathogenvariability and host resistance in rice blast disease.Ann Rev Phytopathol.18167-187.)，它造成的危害正严重威胁着人类的粮食安全。防治稻瘟病也同其他水稻病害一样，是通过利用杀菌剂，栽培措施与种植抗病品种相结合的方式进行的，而种植抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的办法之一。然而要卓有成效地开展抗病育种工作，除了必须寻找优良的抗源外，还必须深入研究稻瘟病菌的致病机制以及水稻与稻瘟病菌之间的互作机理等，而且在病原菌与寄主协同进化过程中，病原菌毒力基因组成会随着寄主抗病基因组成的变化而改变，最终导致抗病品种抗性的丧失(Zeigler R S.1998，Recombination in Magnaporthe grisea.Annu RevPhytopathol，36249-275.)。在分子水平上研究这种互作关系，不仅要不断发现和利用新的抗病基因，进行水稻品种抗病基因分析，将多个抗病基因混合使用外，同时也必须对稻瘟病菌群体中的无毒基因进行分析。更多地发掘稻瘟病菌的无毒基因，有助于明确稻瘟病菌与水稻互作的分子机制，此外，近来的研究结果还表明，研究稻瘟病菌的毒性群体结构特征，揭示其变异规律及动态，也可为抗病品种的合理布局和培育抗病品种及病害防治提供理论依据，从而达到长期、有效地控制该病害的目的。
按照传统稻瘟病菌毒性组成(生理小种)鉴定的方法是通过鉴别品种的致病型鉴定划分生理小种来研究稻瘟病菌的群体结构，通过这种方法可了解稻瘟病菌群体中的生理小种组成和优势种群的变化，从而掌握稻瘟病菌的群体结构和遗传变异动态，但划分的生理小种常因鉴别品种而异，且工作量大，结果易受季节限制，环境条件人为因素的影响，难以准确反映稻瘟病菌的群体结构。
随看分子遗传学和分子生物学的发展，DNA水平上的指纹分析技术(如MGR-RFLP，RAPD，rep-PCR)为研究稻瘟病菌群体无毒基因的组成提供了高效、快速的方法，避免了通过鉴别品种的致病型鉴定的大量工作。因此国内外都非常重视稻瘟病菌无毒基因的分子标记筛选工作。目前利用DNA分子标记已鉴定了30多个稻瘟病菌的无毒基因(Dioh W，et al.2000，Mapping of avirulence genes In theRice Blast Fungus，Magnaporthe Grisea with RFLP and RAPD Markers.Mol Plant-MicrobeInteract，13217-227)，并通过图位法克隆了5个无毒基因(Pw11、Pw12、Avr-C039、Avr-Pita和ACE1)，这就为通过分子标记来鉴定毒性组成创造了便捷条件。一些无毒基因连锁的分子标记(尤其是早期定位所用的分子标记)大多是RFLP标记。由于这类标记需要复杂的操作程序、昂贵的生化试剂和大量样本的DNA，不便于无毒基因的毒性组成分析。基于PCR技术的分子标记则更为方便可行，尤其是近年来稻瘟病菌根据最新发表的全基因组序列(http://www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe)获得的SSR标记，SSR(简单序列重复，Simple Sequence Repeats)，又称微卫星标记，是基于PCR的一种新型分子标记，它在遗传分析中表现为共显性，具有较高的多态性，还具有操作简单，经济有效等优点，因而，微卫星标记已在分子生物学、遗传学、育种学等研究领域得到广泛应用(Kaye C.2003.The development of simple sequence repeatmarkers for Magnaporthe grisea and their integration into an established genetic linkage map.Fungal Genetics and Biology，40207-214)。SSR标记具有较高的多态性，SSR标记在不同的稻瘟菌组合的遗传图谱中位置相对稳定，因而使得不同实验室完成的图谱间有一定的参考性，使得针对试验要求，快速提高不同位置标记丰度成为可能。另外，随着稻瘟菌基因组序列的公布和不断更新，利用已公布的稻瘟基因组序列搜寻新的微卫星位点并转化为PCR标记变得极为方便，此外由于其操作简单，重复性好，是一种值得推广的标记手段，能大大增加目标染色体区段的PCR标记饱和度，从而加快目的基因的鉴定和克隆工作。
发明内容技术问题 本发明的目的是通过筛选获得与无毒基因Avr-Pit、Avr-Pia及PRE1紧密连锁且不受环境影响的分子标记并进行染色体定位，将分子标记与病菌的毒性组成紧密地联系起来。全面系统的分析我国各大稻区稻瘟病菌的的毒性组成及其变异规律，为不同生态区内抗病品种的推广提供指导，同时作为克隆这3个无毒基因的起点。
技术方案 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit、Avr-Pia及PRE1连锁的分子标记、定位，是通过以下方法获得的1)利用两套亲本Guy11与JS153、CH87与6023(亲本菌株为公知公用，南京农业大学植病系保存菌株，保证20年内对外提供)进行杂交获得有性后代，用亲本及后代菌株在水稻鉴别品种Aichi-asahi、K59和丽江新团黑谷上致病性测定，通过菌株在鉴别品种上的有毒和无毒反应，鉴定出相应的无毒基因Avr-Pia、Avr-Pit及PRE1；2)采用含SSR标记m355-356、SCAR标记S487F/R、m363-364、m677-678的100对SSR分子标记及含RAPD标记S361的228条RAPD引物扩增获得的分子标记结合混合群体分离法(BSA)进行无毒基因连锁标记的筛选。SSR标记的PCR反应程序为10×PCR buffer 2.0μl，MgCl21.5mM，dNTPs，0.1mM，TaqDNA聚合酶1.0U，引物各为0.5μM，模板DNA10ng，加无菌超纯水至20μl。PCR反应参数94℃变性30S；94℃变性30S，53(55)℃退火30S，72℃延伸30S，25个循环；72℃延伸8min；PCR反应在MJ Rsearch PT200热循环仪上进行。扩增产物用3％琼脂糖凝胶电泳，用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相；RAPD反应程序为10×PCR buffer2.5μl，MgCl21.5mM，dNTPs50μM，随机引物0.3μM，模板DNA 10ng，Taq DNA聚合酶1U，加无菌超纯水至25μl，反应加石蜡油覆盖后，在PTC-200型PCR仪上(MJ Research)按以下程序扩增95℃预变性2.5min；并连续进行95℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min 30sec共45个循环；72℃延伸15min。反应结束后每样品取10μl，以1％的琼脂糖凝胶于1×TAE(10mMTris，pH7.8，5mM醋酸钠，0.5mM EDTA)中电泳，然后将扩增产物分别在含有溴化乙锭(0.5μg/ml)的溶液中浸泡10～15min后移至清水中漂洗5～10min，在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相。
3)采用混合群体分离法bulked segregation analysis(BSA)(Michelmore，et al.1991.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregationanalysisA rapid method to detect markers in specific genomic regions by usingsegregating population.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.889828-9832.)筛选获得与无毒基因连锁的RAPD标记，将标记片段回收，测序，设计特异引物，转化为更稳定的SCAR标记。SCAR标记的PCR反应程序为DNA 30ng，dNTPs 0.1μM，引物各为0.5μM，1.5UTaq DNA聚合酶，2.5μl10×扩增反应缓冲液，MgCl21.5mM，加无菌超纯水至25μl。反应加石蜡油覆盖后，在PTC-200型PCR仪上(MJResearch)按以下程序扩增95℃预变性2.5min；并连续进行95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min 30sec共35个循环；72℃延伸10min。反应结束后每样品取10μl，以1％的琼脂糖凝胶于1×TAE(10mM Tris，pH7.8，5mM醋酸钠，0.5mM EDTA)中电泳，然后将扩增产物分别在含有溴化乙锭(0.5μg/ml)的溶液中浸泡10～15min后移至清水中漂洗5～10min，在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相。
4)用SSR、RAPD-BSA结合菌株的毒性测定，进行遗传连锁分析，共筛选获得5个紧密连锁的分子标记第1染色体端粒附近的SSR标记m355-356与无毒基因Avr-Pit连锁，遗传距离为2.3cM；定位于第7染色体端粒附近的SCAR标记S487F/R、m363-364与无毒基因Avr-Pia连锁，遗传距离分别为3.5cM和4.6cM；第3染色体的中部的SSR标记m677-678、RAPD标记S361与稻瘟病菌种特异性无毒基因PRE1连锁，遗传距离分别为5.9cM和6.4cM。
本发明不仅可利用该无毒基因的标记作探针，研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示病菌群体毒性组成和变异特点，且作为进一步物理作图法克隆该无毒基因的起点。
有益效果本发明运用SSR、RAPD、SCAR等标记技术，构建并定位了稻瘟菌无毒基因Avr-Pia和Avr-Pit的遗传图谱，获得了与无毒基因紧密连锁的分子标记，迄今为止，关于稻瘟病菌无毒基因Avr-Pia和Avr-Pit及种特异性无毒基因PRE1的分子标记定位国内外尚未见报道。通过获得与稻瘟病菌无毒基因紧密连锁的分子标记，不仅可利用该无毒基因的标记作探针，研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示病菌群体毒性组成和变异特点，且为进一步物理作图法克隆该无毒基因奠定基础。本研究利用分子标记技术，定位了稻瘟病菌的3个无毒基因。
本发明是同时采用两套亲本杂交，获得有性杂交群体开展无毒基因的分子标记筛选，并进行染色体定位，与现有分子标记技术相比，其优点和积极效果表现在(1)标记稳定本发明获得的无毒基因分子标记为SSR标记，且将RAPD转化为更可靠和稳定的SCAR标记，这些连锁的分子标记稳定，不易受反应体系、条件、DNA浓度的影响。
(2)节约时间和成本稻瘟病菌群体毒性组成监测的传统方法是通过鉴别品种的致病型鉴定划分生理小种来研究稻瘟病菌的群体结构，通过这种方法可了解稻瘟病菌群体中的生理小种组成和优势种群的变化，从而掌握稻瘟病菌的群体结构和遗传变异动态，但鉴定受季节的限制、划分的生理小种常因鉴别品种而异，且结果易受环境条件人为因素的影响，准确性低，难以准确反映稻瘟病菌的群体结构。通过本发明筛选出的与无毒基因紧密连锁的分子标记不受环境影响，可以准确地靶定无毒基因，节约大量时间和成本，快速分析田间稻瘟病菌无毒基因的组成、分布及演变规律。
SSR引物、RAPD引物和SCAR引物序列，退火温度及扩增片段。
图1电泳检测由SSR引物m677-678扩增稻瘟病菌亲本菌株及部分杂交后代基因组DNA产物的结果。23泳道和24泳道为亲本菌株，其他泳道为杂交后代；图2 RAPD引物S361对CH87和6023及其有性后代扩增电泳图谱。箭头表示与无毒基因连锁的标记片段；A无毒菌株，V毒性菌株，R重组个体；Mmarker.
图3 SCAR引物S487F/S487R对稻瘟病菌亲本及其有性后代扩增电泳图谱。箭头表示与无毒基因Avr-Pia连锁的标记片段；A无毒菌株，V毒性菌株，R重组个体；M100bp ladder marker；图4无毒基因Avr-Pit和Avr-Pia的部分连锁遗传5稻瘟病菌种特异无毒基因PRE1的部分连锁遗传图五具体实施方式
稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit、Avr-Pia及PRE1连锁的分子标记方法，包括1)利用两套亲本Guy11与JS153、CH87与6023，亲本菌株为公知公用(陈庆河，王源超，郑小波。中国主要稻区稻瘟病菌交配型分布及其育性能力的差异，中国农业科学2004，37(6)840-845)农业部病虫监测与治理重点实验室对外提供，进行杂交获得有性后代，用亲本及后代菌株在水稻鉴别品种Aichi-asahi、K59和丽江新团黑谷(Aichi-asahi、K59和丽江新团黑谷品种均为公知公用，农业部病虫监测与治理重点实验室对外提供，)上致病性测定，方法及品种见参考文献陆凡等。江苏省稻瘟病菌的毒性多样性及水稻品种的抗病性，生物多样性，2001，9(3)201-206，通过菌株在鉴别品种上的有毒和无毒反应，鉴定出相应的无毒基因Avr-Pia、Avr-Pit及PRE1；2)采用含SSR标记m355-356、SCAR标记S487F/R、m363-364、m677-678等的100对SSR分子标记及含RAPD标记S361的228条RAPD引物扩增获得的分子标记结合混合群体分离法(BSA)进行无毒基因连锁标记的筛选。SSR标记的PCR反应程序为10×PCR buffer 2.0μl，MgCl21.5mM，dNTPs，0.1mM，Taq DNA聚合酶1.0U，引物各为0.5μM，模板DNA10ng，加无菌超纯水至20μl。PCR反应参数94℃变性30S；94℃变性30S，53(55)℃退火30S，72℃延伸30S，25个循环；72℃延伸8min；PCR反应在MJ Rsearch PT200热循环仪上进行。扩增产物用3％琼脂糖凝胶电泳，用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相；RAPD反应程序为10×PCRbuffer 2.5μl，MgCl21.5mM，dNTPs50μM，随机引物0.3μM，模板DNA 10ng，Taq DNA聚合酶1U，加无菌超纯水至25μl，反应加石蜡油覆盖后，在PTC-200型PCR仪上(MJ Research)按以下程序扩增95℃预变性2.5min；并连续进行95℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min 30sec共45个循环；72℃延伸15min。反应结束后每样品取10μl，以1％的琼脂糖凝胶于1×TAE(10mM Tris，pH7.8，5mM醋酸钠，0.5mM EDTA)中电泳，然后将扩增产物分别在含有溴化乙锭(0.5μg/ml)的溶液中浸泡10～15min后移至清水中漂洗5～10min，在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相。
3)采用混合群体分离法(BSA)筛选获得与无毒基因连锁的RAPD标记，将标记片段回收，测序，设计特异引物(S487F5’-TGGTATTGTTCGCGTTGATATG-3’；S487RCCCCGATGGTCTAATATACG)，转化为更稳定可靠的SCAR标记。SCAR标记的PCR反应程序为DNA 30ng，dNTPs 0.1μM，引物各为0.5μM，1.5UTaq DNA聚合酶，2.5μl10×扩增反应缓冲液，MgCl21.5mM，加无菌超纯水至25μl。反应加石蜡油覆盖后，在PTC-200型PCR仪上(MJ Research)按以下程序扩增95℃预变性2.5min；并连续进行95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min 30sec共35个循环；72℃延伸10min。反应结束后每样品取10μl，以1％的琼脂糖凝胶于1×TAE(10mM Tris，pH7.8，5mM醋酸钠，0.5mMEDTA)中电泳，然后将扩增产物分别在含有溴化乙锭(0.5μg/ml)的溶液中浸泡10～15min后移至清水中漂洗5～10min，在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相，结果可获得一条306bp的特异片段。
4)共筛选获得5个紧密连锁的分子标记 根据连锁交换规律进行遗传连锁分析，利用群体基因型资料构建稻瘟菌的遗传连锁图谱，所用软件为Mapmaker3.0，最小LOD值设为3，获得遗传距离连锁图谱第1染色体端粒附近的SSR标记m355-356与无毒基因Avr-Pit连锁，遗传距离为2.3cM；定位于第7染色体端粒附近的SCAR标记S487F/R、m363-364与无毒基因Avr-Pia连锁，遗传距离分别为3.5cM和4.6cM；第3染色体的中部的SSR标记m677-678、RAPD标记S361与稻瘟病菌种特异性无毒基因PRE1连锁，遗传距离分别为5.9cM和6.4cM。
SSR引物、RAPD引物和SCAR引物序列，退火温度及扩增片段。
本发明不仅可利用该无毒基因的标记作探针，研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示病菌群体毒性组成和变异特点，且作为进一步物理作图法克隆该无毒基因的起点。
权利要求
1.稻瘟病菌无毒基因的分子标记方法，其特征在于用标记引物ms355-356，左端引物序列AACCCTCCGTGCACCTTAG右端引物序列GCTTCTTCTCGCTTGCTGTT扩增稻瘟病菌DNA，如果能扩增出292bp的扩增片段，则标志着稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的存在，该无毒基因位于第1染色体端粒附近，利用软件Mapmaker3.0，最小LOD值设为3，获得与标记的遗传距离为2.3cM；或者用标记引物S487F/R，左端引物序列TGGTATTGTTCGCGTTGATATG右端引物序列CCCCGATGGTCTAATATACG扩增稻瘟病菌DNA，如果能扩增出306bp的扩增片段，则标志着稻瘟病菌无毒基因Avr-Pia的存在，该无毒基因位于第7染色体端粒附近，利用软件Mapmaker3.0，最小LOD值设为3，获得与标记的遗传距离为3.5cM；或者用标记引物ms363-364，左端引物序列TCTCGGGAAGCTGATTGAGT右端引物序列CTAACGGCCGGCTAACAAAC扩增稻瘟病菌DNA，如果能扩增出285bp的扩增片段，则标志着稻瘟病菌无毒基因Avr-Pia的存在，该无毒基因位于第7染色体端粒附近，利用软件Mapmaker3.0，最小LOD值设为3，获得与标记的遗传距离为4.6cM；或者用标记引物ms677-678，左端引物序列TCGTGAGGGTTCCTATCTGC右端引物序列GACCTTTATCGGATGCGTGT扩增稻瘟病菌DNA，如果能扩增出255bp的扩增片段，则标志着稻瘟病菌种特异性无毒基因PRE1的存在，该无毒基因位于第3染色体中部，利用软件Mapmaker3.0，最小LOD值设为3，获得与标记的遗传距离为5.9cM；
2.根据权利要求1所述的稻瘟病菌无毒基因的分子标记方法，其分子标记的筛选过程如下1)利用两套亲本Guyll与JS153、CH87与6023进行杂交获得有性后代，用亲本及后代菌株在水稻鉴别品种Aichi-asahi、K59和丽江新团黑谷上致病性测定，通过菌株在鉴别品种上的有毒和无毒反应，根据基因对基因学说关系，当菌株在已知抗性基因的鉴别品种上表现为无毒时，鉴定出该菌株含有该抗病基因对应的无毒基因，鉴定出相应的无毒基因Avr-Pia、Avr-Pit及PRE1；2)用CTAB法提取稻瘟病菌亲本及杂交后代菌株DNA，采用SSR分子标记及RAPD引物扩增获得的分子标记结合混合群体分离法(BSA)对亲本进行多态性筛选，PCR在MJ-200扩增仪上进行，扩增产物在3％琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在杂交后代群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建稻瘟病菌无毒基因的遗传图谱，所用软件为Mapmaker3.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；4)水稻鉴别品种Aichi-asahi、K59和丽江新团黑谷四叶一心苗期接种稻瘟病菌，对稻瘟病菌亲本及其后代菌株进行毒性鉴定，获得亲本及杂交后代毒性表型；5)利用Mapmaker3.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应的稻瘟病菌亲本及杂交后代毒性表型进行连锁分析，最小LOD值设为3，根据连锁交换规律进行遗传连锁分析，获得遗传距离连锁图谱，共筛选获得5个紧密连锁的分子标记第1染色体端粒附近的SSR标记m355-356与无毒基因Avr-Pit连锁，遗传距离为2.3cM；定位于第7染色体端粒附近的SCAR标记S487F/R、m363-364与无毒基因Avr-Pia连锁，遗传距离分别为3.5cM和4.6cM第3染色体的中部的SSR标记m677-678、RAPD标记S361与稻瘟病菌种特异性无毒基因PRE1连锁，遗传距离分别为5.9cM和6.4cM.
全文摘要
本发明稻瘟病菌无毒基因的分子标记方法属于农业生物技术范畴。分子标记技术，对稻瘟病菌两亲本菌株及杂交后代群体鉴定获得的无毒基因进行分子标记。第1染色体端粒附近的SSR标记m355－356与无毒基因Avr－Pit连锁，遗传距离为2.3cM；定位于第7染色体端粒附近的RAPD标记S487与无毒基因Avr－Pia连锁，遗传距离为3.5cM；第3染色体的中部的SSR标记m677－678、RAPD标记S361与稻瘟病菌种特异性无毒基因PRE1连锁，遗传距离分别为5.9cM和6.4cM。本发明不仅可利用该无毒基因的标记作探针，而且为进一步通过物理作图法克隆该无毒基因奠定了基础。
文档编号C12N15/11GK1952177SQ20061009649
公开日2007年4月25日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者郑小波, 王源超, 陈庆河, 张正光 申请人:南京农业大学