专利名称：一种用于动物精原干细胞体外增殖的培养体系和使用方法
技术领域：
本发明属于涉及一种用于提高动物精原干细胞増殖率的培养体系和使用方法，可使动物精原干细胞在短期内大量増殖。
背景技术：
1971年和1972年，Huckins和Clermont等研究表明，确认SSCs是维持雄性哺乳动物精子发生的唯一成体干细胞，可将基因遗传给下一代。1990年和1991年，Braunhut和Skinner等研究证实睾丸组织液中富含多种生长因子如神经生长因子(NGF)、生精生长因子(SGF)、类胰岛素生长因子I (IGFsl)等。这些生长因子都与生殖细胞的生长及分化有密 切的联系。1991年和1993年，Tajima和Rossi等研究表明，有支持细胞分泌的干细胞生长因子(SCF)可促进生殖细胞的生长和存活。1995年，Griswold等研究表明，在睾丸的发育过程中，精原干细胞(SSCs)的増殖与分化受其所处微环境及支持细胞分泌的生长因子进行调控。2001年和2002年,Svechnikov和Petersen等研究表明睾丸组织中的白细胞介素a (IL-a)可促进生殖细胞、支持细胞和管周细胞的生长。2003年，Falls证实睾丸组织中的神经调节蛋白I(NRGl)可引发多种类型的细胞生长及分化。
发明内容
本发明在的目的在于，提供一种新的用于提高动物精原干细胞増殖率的培养体系，为精原干细胞的稳定和高效增殖提供一套支撑体系。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种用于提高动物精原干细胞増殖率的培养体系，其特征在干，该培养体系由基础培养液和睾丸组织液组成,其中,基础培养液占总培养体系体积的70%，睾丸组织液占总培养体系体积的30% ；所述基础培养液是以4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM/F12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。上述用于提高动物精原干细胞増殖率的培养体系的使用方法，其特征在于I)首先用基础培养液对精原细胞进行培养；2)用差异贴壁法处理精原细胞后，得到的为精原干细胞，然后将精原干细胞接种到支持细胞饲养层上，同时在基础培养液中再加入睾丸组织液继续培养。采用本发明的培养体系，可使动物精原干细胞在短期内大量増殖，可以为珍稀濒危动物和优良家畜遗传资源的保护提供新的途径，通过SSCs的体外培养不仅可用于转基因动物的生产，而且能够重建不育个体精子的发生，治疗雄性动物不育，从而为濒危物种的保护与繁衍提供可靠的实践方案。
图I为传代后第一代精原干细胞的形态学观察在200倍显微镜下的图片；
图2为基础培养液培养的精原干细胞簇在250倍显微镜下的图片。图3为5%睾丸组织液培养的精原干细胞簇在250倍显微镜下的图片。图4为10%睾丸组织液培养的精原干细胞簇在250倍显微镜下的图片。图5为 20%睾丸组织液培养的精原干细胞簇在250倍显微镜下的图片。图6为30%睾丸组织液培养的精原干细胞簇在200倍显微镜下图片。图7为40%睾丸组织液培养的精原干细胞簇在100倍显微镜下的图片。图8为精原干细胞簇碱性磷酸酶(AKP)在200倍显微镜下的染色图片。图9为精原干细胞细胞在200倍显微镜下的免疫化学染色图片。图10为RT-PCR分析结果图片。以下结合附图和实施例对本发明作进ー步的详细说明。
具体实施例方式含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM/F12细胞培养基是ー种商品化的培养基，发明人在上述商品化培养基的基础上，配制了一种用于提高动物精原干细胞増殖率的培养体系，该培养体系由基础培养液和睾丸组织液组成，其中，基础培养液占总培养体系体积的70%，睾丸组织液占总培养体系体积的30% ；基础培养液是以4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM/F12细胞培养基为基础，在其中加入10%体积的胎牛血清和5%的双抗。在体外培养精原干细胞时，以不同浓度的睾丸组织液同时与基础细胞培养液进行配伍，即以4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM/F12细胞培养基为基础，其中加入10%胎牛血清和5%双抗(青霉素(100IU/ml)和链霉素(100mg/ml))。以探索最佳的睾丸组织液的添加剂量，以提高精原干细胞的増殖率。本实验设置了以下培养方案I、对照组基础培养液900 μ 1+含有精原干细胞的基础培养液100 μ I。2、实验组本组共5个处理组组ー基础培养液850 μ 1+含有精原干细胞的基础培养液100 μ 1+5%睾丸组织液50 μ I。组ニ 基础培养液800 μ 1+含有精原干细胞的基础培养液100 μ 1 + 10%睾丸组织液 100 μ I。组三基础培养液700 μ 1+含有精原干细胞的基础培养液100 μ 1+20%睾丸组织液 200 μ I。组四基础培养液600 μ 1+含有精原干细胞的基础培养液100 μ 1+30%睾丸组织液 300 μ I。组五基础培养液500 μ 1+含有精原干细胞的基础培养液100 μ 1+40%睾丸组织液 400 μ I。对照组和实验组培养方式中，对照组不加睾丸组织液。用上述基础培养液对精原细胞进行培养；然后用差异贴壁法处理精原细胞后，得到的为精原干细胞，然后将精原干细胞接种到支持细胞饲养层上，同时在基础培养液中再加入睾丸组织液继续培养。
睾丸组织液现配现用，睾丸组织液的配制方法是，用组织匀浆法进行提取，将无菌处理的健康动物的睾丸组织块一起移入含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM/F12细胞培养基的无菌匀浆器中，匀浆15min，直到看不到组织碎块为止，室温静置20-30min。将上清液移入15ml 一次性塑料离心管中，在4°C、3000rpm条件下离心30min。无菌条件下，将睾丸提取液用0. 22 ii m滤器过滤除菌。实验组中的基础培养液加入量随睾丸组织液加入量的不同而不同。不同浓度的睾丸组织液对精原干细胞促 増殖的影响作用不同，关于睾丸组织液对精原干细胞促増殖的影响见表I和图2、3、4、5、6。精原干细胞的检测方法(I)形态学观察典型特征是链状分布，圆球形、细胞核较大(见图I)。(2)AKP染色其原理是在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，会形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的终产物NBT-formazan (图 T)。(3)细胞免疫化学鉴定⑶9和Protamine I是精原干细胞和精子细胞的表面标记物，抗⑶9和抗Protamine I抗体购买于Sangon和Santa, ニ抗抗体Cy3黄红色标记山羊抗兔购买于Jackson。其实验结果见图8。(4) RT-PCR 鉴定根据 NCBI 发表的关于基因 ^ -actin、Ngn3、c_kit、H2ba、Integrin alpha6、Integrin 0 _l、0ct4的序列信息，采用primer5. 0软件设计引物，并由华大基因公司合成，引物信息如下Ngn3(GenBank No. NM_009719. 6)UpperPrimer :5 ’ -TTGGCACTCAGCAAACAG C_3’； LowerPr imer :5’ -TCCCTTTCCACTAGCACCC-3’，467bp ；0ct4 (GenBank No. NM_013633. 2)UpperPrimer :5’ - C C C C A A T G C C G T G A A G T T - 3 ’ ； LowerPr imer 5’ -GAAAGGTGTCCCTGTAGC C_3’，556bp ；-actin (GenBank No. NM_007393. 3)UpperPrimer :5’ -GCCTTCCTTCTTGGGTAT-S’ ； LowerPr imer 5’ -CCTTCACCGTTCCAGTTT-3’，549bp ；c-kit (GenBank No. Y00864. I)UpperPrimer :5’ - T G T T T G T T A G AG A T C C T G C - 3 ’ ；LowerPrimer 5’ -GAGATTTCCCATCACACTC-3’，141bp ；H2ba (GenBank No. NM_175663. I)UpperPrimer :5’ - C GG T A A A GG G T G C T A C TA T - 3 ’ ；LowerPrimer 5’ -CACTTGTTTCAGCACCTTA-3’，137bp ；Integrin alpha 6(GenBank No. NM_008397. 3)UpperPrimer :5’ -A T G A T G A A A G T C T C G T G C - 3 ’ ； LowerPr imer 5， -CATAGCCAAACGAGGAAG-3，，222bp ；IntegrinP -I (GenBank No. NM_010578. 2)UpperPrimer : 5 ’ -TTGATGAATGAAATG AGGAG-3 ’，Lo w e r Pr i me r :5 ’ -TCCAGATATGCGTTGCTG-3 ’，225bp。电泳图见图 9。表I睾丸组织液体外培养精原干细胞的影响
权利要求
1.一种用于提高动物精原干细胞増殖率的培养体系，其特征在干，该培养体系由基础培养液和睾丸组织液组成，其中，基础培养液占总培养体系体积的70%，睾丸组织液占总培养体系体积的30% ； 所述基础培养液是以4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM/F12细胞培养基为基础，在其中加Λ 10%体积的胎牛血清和5%体积的双抗。
2.权利要求I所述的用于提高动物精原干细胞増殖率的培养体系的使用方法，其特征在于 1)首先用基础培养液对精原细胞进行培养； 2)用差异贴壁法处理精原细胞后，得到的为精原干细胞，然后将精原干细胞接种到支持细胞饲养层上，同时在基础培养液中再加入睾丸组织液继续培养。
全文摘要
本发明公开了一种用于提高动物精原干细胞增殖率的培养体系，该培养体系由基础培养液和睾丸组织液组成，其中，基础培养液占总培养体系体积的70％，睾丸组织液占总培养体系体积的30％；所述基础培养液是以含4mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM/F12细胞培养基为基础，在其中加入10％体积的胎牛血清和5％体积的双抗。采用本发明的培养体系，可使动物精原干细胞在短期内大量增殖，可以为珍稀濒危动物和优良家畜遗传资源的保护提供新的途径。
文档编号C12N5/076GK102643779SQ20121012013
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者侯丽鹏, 凡志国, 张波, 李青旺, 洪洁赟, 王娇, 王春伟, 王鹏, 胡建宏 申请人:西北农林科技大学