专利名称：苏云金芽胞杆菌无芽胞无晶体菌株、其构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及苏云金芽胞杆菌无芽胞无晶体菌株、其构建方法及其应用。
背景技术：
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),革兰氏阳性菌,芽胞杆菌属，其最明显的特征是在芽胞形成的同时会产生具有杀虫作用的伴胞晶体，其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目等农林业害虫具有特异性的杀虫活性[Raymond，B.，P. R. Johnston, C. Nielsen-LeRoux, et al. ,2010. Bacillus thuringiensis an impotentpathogen Trends Microbiol. 18 (5) :p. 189-94],目前成为国际上应用最广泛最成功的生物农药。商品化的苏云金芽胞杆菌制剂产品一般是杀虫晶体蛋白和芽胞的混合物，大型发酵生产，应用叶面喷洒。但是芽胞对高温、低温、化学试剂、辐射、水解酶等不利条件具有很强的抗逆性[Errington, J. ,2003. Regulation of endospore formation in Bacillussubtilis. Nat Rev Microbiol. I (2) :p. 117-26], Bt制剂活芽胞的大量释放可能带来环境生态的潜在危险，所以开发对生态与环境更安全的、新一代灭活的生物农药十分必要。而无芽胞的苏云金芽胞杆菌可以产生晶体，并具有与有芽胞苏云金芽胞杆菌相当的活性，具有一定的应用潜力[Sanchis, V. , M. Gohar, J. Chaufaux, et al. , 1999. Development andfield performance of a broad—spectrum nonviable asporogenic recombinant strainof Bacillus thuringiensis with greater potency and UV resistance. Appl EnvironMicrobiol. 65(9) :p. 4032-9]。研究发现在芽胞的形成过程中，母细胞中4个全局调控因子O E因子、SpoIIID、 oK因子、GerE先后作用，分别在芽胞不同的发育阶段起作用，控制芽胞形成的一系列基因的转录与调控，其中O K因子和O K因子是转录起始因子，gerE基因和spoIIID基因类似，其表达产物为小型序列特异性DNA结合蛋白，主要对Ok因子或0E因子控制转录的相关基因起特异性激活或者抑制的转录调控作用[Wang, L. , J. Perpich, A. Driks,et al. , 2007. Maintaining the transcription factor SpoIIID level late duringsporulation causes spore defects in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 189 (20)p. 7302-9. Eichenberger, P. , M. Fujita, S. T. Jensen, et al. ,2004. The program of genetranscription for a single differentiating cell type during sporulation inBacillus subtilis. PLoS Biol. 2(10) :p. e328]。在 Bt 中 o K 因子对 spoIIID 基因具有正调控作用，同时SpoIIID蛋白对Ok因子的表达具有正调控作用，而oK因子对0￡因子的表达具有负调控作用。重要的是spoIIID基因突变体可以产生伴胞晶体，但不产生芽胞[张茜茜，束长龙，张杰，等.2009.苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株的特点.微生物学报，49(9) :1165-1170]。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体的启动子主要分为以下几种类型1重叠的双启动子BtI和Btll。BtI是一个强启动子，BtII是一个弱启动子，两个启动子在O K和oK的调控下协同作用起始cryIA基因的转录[Komano, T. , S. Takabe, and H. Sakai,2000. Transcription of the insecticidal crystal protein genes of Bacillusthuringiensis .Biotechnol Annu Rev.5 p. 131-54.Zhang, J. , H.U.Schairer,ff.Schnetter, et al.,1998. Bacilluspopilliae cryl8Aa operon is transcribed bysigmaE and sigmaK forms of RNA polymerase from a single initiation site.Nucleic Acids Res. 26(5) :p. 1288-93]。2非重叠的双启动子。cry4Aa基因具有两个启动子，下游启动子Pl和上游启动子P2的-10区和-35区并未重叠且存在一定距离。Pl 和 P2 分别依赖 O K 和 Ok 两个调控因子[Kant, S.，R. Kapoor, and N. Baner jee，2009.Identification of a catabolite—responsive element necessary for regulation ofthe cry4A gene ofBacillus thuringiensis subsp. israelensis. J Bacteriol. 191(14)p. 4687-92]，此外还受 oH 因子的调控[Poncet, S.，E. Dervyn, A. Klier, et al. , 1997.SpoOA represses transcription of the cry toxin genes in Bacillus thuringiensis.Microbiology. 143 (Pt 8) p. 2743-51] 03单启动子。很多cry基因的启动子都只具有一个BtI类启动子。cry3A基因的启动子是单启动子中比较特别的一个启动子。cry3Aa基因的表达不依赖芽胞形成的特异0因子,但是依赖oA因子[Agaisse,H. and D. Lereclus,1994. Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis cryIIIAtoxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and isincreased in a spoOA mutant. J Bacteriol. 176 (15) :p. 4734-41]。4操纵子中的启动子。cry基因位于操纵子中，基因的表达受操纵子的控制。操纵子中的启动子主要分为操纵子中的单启动子Btl、操纵子中的单启动子Btll、操纵子中的双启动子BtI和BtII和操纵子中的双启动子。cry8E属于操纵子中的双启动子,受0￡和o H因子的调控。苏云金芽胞杆菌因其是优良的生物农药，一直被广泛关注。获得低生态危害的无芽胞无晶体菌株用于对外源Cry蛋白的表达，对提高具有高效杀虫活性的Bt制剂有非常广阔的应用前景，并能有效提高工程菌的田间应用的安全性。
发明内容
本发明的目的之一是在野生菌株HD-73和spoilID无芽胞突变体中分析四种不同转录机制的cry基因启动子(Pcry 1A, Pcry3A, Pcry4A和Pcry8E)的活性，明确spoIIID基因的缺失不影响不同cry基因启动子的转录活性，并同时筛选出在spoIIID无芽胞突变体中活性最强的启动子。目的之二是在spoIIID无芽胞突变体中，比较不同cry基因启动子指导的CrylAc蛋白产量及其生物活性，筛选出能指导产生大量CrylAc蛋白的强启动子。目的之三是构建一株无芽胞无晶体突变株，对其是否适合外源Cry蛋白表达进行评估，以用于研制更为高效广谱并具有安全性的苏云金芽胞杆菌工程菌。无晶体无芽胞spoIIID基因突变体菌株HD__ A SpoIIID，其特征是在无芽胞突变体菌株HD-A SpoIIID中，缺失带有cryIAc基因的pHT73质粒。无晶体无芽胞spoIIID基因突变体菌株HD_-A SpoIIID的构建方法，包括如下步骤(I)将邢-八5口01110菌株接种于8 培养基，421，20017/111111培养48小时，
(2)再接种于BP培养基，42°C，200r/min培养48小时，(3)再接种于BP培养基，45°C，200r/min培养12小时，(4)取菌液涂布于固体LB培养基，30°C倒置培养48小时，(5)将得到的菌斑用鉴定HD-73野生菌株中的含crylAc基因的大质粒pHT73的引物进行鉴定，选出含有cryIAc基因的pHT73质粒缺失的菌株，命名为HD_ A SpoIIID。
所述含crylAc基因的大质粒pHT73的引物为TlAc3' :5' -ATGGAAAAAGATTTATTTGAAGATG-3'，T1AC5' :5' -CTCTTTATTTTCAATTTTTCGAAGT-3'。其中步骤(I)、⑵接种量为1%。其中步骤(3)接种量为4%。上述菌株HD__ A SpoIIID在表达Cry蛋白和构建工程菌中的应用。所述Cry蛋白为CrylAc蛋白。所述工程菌为HD二 A SpoilIDpHTP lAc、HD二 A SpoIIIDpHTP3Ac、HD二 ASpoIIIDpHTP4A 和 HD二 ASpoIIIDpHTP8E，其结构为在菌株 HD二 A SpoIIID 中分别转有 PcrylA, Pcry3A, Pcry4A 和 Pcry8E 与 crylAc 基因融合的表达载体 pHTPlAc、pHTP3A、PHTP4A 和 pHTP8E。实验表明，无芽胞无晶体突变株HD__ A SpoIIID，适合外源Cry蛋白表达，可用于研制更为高效广谱并具有安全性的苏云金芽胞杆菌工程菌。本发明的技术方案如下将含有四种不同转录机制的cry基因启动子(PcrylA,Pcry3A,Pcry4A和Pcry8E)融合报告基因IacZ的重组质粒pHTPlAc、pHTP3A、pHTP4A和pHTP8E导入spoIIID无芽胞突变体(HD-ASpoIIID)中，通过￠-半乳糖苷酶活性测定，比较四种启动子的活性，筛选出在spoIIID无芽胞突变体中具有高转录活性的启动子。将含有四种cry 基因启动子(PcrylA, Pcry3A, Pcry4A 和 Pcry8E)与 crylAc 基因融合的表达载体pHTPlAc、pHTP3A、pHTP4A和pHTP8E，导入spoIIID无芽胞突变体中，分析不同启动子指导的CrylAc蛋白表达产量及其生物活性，筛选出能指导产生大量CrylAc蛋白的强启动子。通过高温诱变方法在HD- A SpoIIID基础上筛选出缺失crylAc基因的HD^-A SpoIIID无芽胞无晶体突变体，并在该菌株中分析不同启动子指导的CrylAc蛋白表达产量及其生物活性，筛选出在无芽胞无晶体的背景菌株中能指导产生大量CrylAc蛋白的强启动子。以下详述本发明的方案过程I大肠杆菌JMllO热击感受态的制备为了获得含有外源基因的大肠杆菌转化子，制备大肠杆菌的热击转化感受态细胞[Sanbrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning A LaboratoryManual (Cold Spring Harbour Lab. , Cold Spring Harbour, NY)]。米用热击转化的方法转化大肠杆菌受体态细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。2Bt电击感受态的制备为了提高Bt的转化效率，制备Bt的电击转化感受态细胞[Sambrook，J. ,Fritsch,E. F. , and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning A Laboratory Manual(Cold SpringHarbour Lab. ,Cold Spring Harbour, NY)],采用电击转化的方法转化Bt受体菌细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。3四种启动子转录活性比较将重组质粒pHT304PcrylAc、pHT304Pcry3A、pHT304Pcry4A 和 pHT304Pcry8E [杜立新.2011.苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究.河北农业大学博士学位论文]分别电击转化spoIIID无芽胞突变体(HD-A SpoIIID)，获得菌株SpoIIIDPcry lAc、SpoIIIDPcry3Ac、SpoilIDPcry4A 和 SpoilIDPcry8E，将这些菌株接种于 SSM 培养基[Schaeffer, P. , J. Millet, and J. P. Aubert,1965. Catabolic repression of bacterialsporulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 54(3) :p. 704-11],按固定的时间间隔取样，测定样品的P -半乳糖苷酶活性，并与含有这些质粒的野生型HD-73菌株(HDPcrylAc、HDPcry3Ac、HDPcry4A和HDPcry8E)[杜立新.2011.苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控 机制研究.河北农业大学博士学位论文]比较活性(图I)，明确spoIIID基因的缺失对四种启动子活性的影响，筛选出在无芽胞突变体中具有高转录活性的启动子(图2，B)。4无芽胞无晶体突变体HD__ A SpoIIID的构建spoIIID突变体可以形成晶体，但不产生芽胞。其含有HD-73菌株内生质粒pHT73，该质粒含有crylAc基因及其启动子的野生拷贝，为了分析crylAc野生拷贝对不同cry启动子指导crylAc基因表达的影响，在spoIIID突变体基础上通过高温诱变缺失了含有crylAc基因的pHT73大质粒，获得无芽胞无晶体突变体HD_ A SpoIIID，经PCR(图3)和显微镜观察验证突变体的正确性(图4)。5蛋白表达量及生物活性测定将含有四种cry 基因启动子(PcrylA, Pcry3A, Pcry4A 和 Pcry8E)与 crylAc 基因融合的表达载体pHTPlAc、pHTP3A、pHTP4A和pHTP8E [杜立新.2011.苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究.河北农业大学博士学位论文]分别导入HD-A SpoIIID和 HD二 A SpoIIID 菌株，获得菌株 SpoIIIDpHTPIAc、SpoIIIDpHTP3Ac、SpoIIIDpHTP4A、Spo 11 IDpHTP8E、HD 二 ASpoII IDpHTP IAc、HD 二 ASpoII IDpHTP3Ac、HD 二 ASpoII IDpHTP4A 和HD 二 ASpoIIIDpHTP8E。蛋白产量测定利用SSM培养基培养菌株SpoIIIDpHTPlAc、SpoIIIDpHTP3Ac、SpoIIIDpHTP4A、SpoIIIDpHTP8E、HD二 A SpoilIDpHTP lAc、HD二 ASpoIIIDpHTP3Ac、HD 二 A Spoil IDpHTP4A 和 HD 二 A Spoil IDpHTP8E 至细胞完全裂解，采用 Pierce 660nmprotein Assay Kit分别对上样混合液中的总蛋白进行定量。调整上样量使总蛋白含量一致进行点样，利用SDS-PAGE检测各菌株杀虫晶体蛋白的产量(图5、6)。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南[J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁等).北京科学出版社，1992]。杀虫活性测定将SpoIIIDpHTPlAc、SpoIIIDpHTP3Ac、SpoIIIDpHTP4A 和SpoIIIDpHTP8E菌株制成粉剂，对粉剂中蛋白进行定量，然后稀释成不同的浓度，分别混入饲料拌勻，测定对小菜蛾(Plutella xylostella)的活性。
图I :不同启动子在HD-73和HD-poIIID突变株中的转录活性图2 :不同启动子转录活性比较图3 pHT73质粒缺失PCR鉴定图4 :不同菌株显微镜观察结果A HD-73, B HD-A SpoIIID, C :HD二 A SpoIIID图5 HD-A SpoIIID菌株中不同启动子指导的CrylAc蛋白的SDS-PAGE分析图6 :HD__ A SpoIIID菌株中不同启动子指导的CrylAc蛋白的SDS-PAGE分析
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下面所用材料载体和菌株均为公开材料，为市售产品。本申请人的实验室均有保藏，可以对外公开发放。实施例I大肠杆菌JMllO热击感受态的制备及转化挑取单菌落于5ml LB液体培养基，37°C震荡培养过夜；按I %接种量接种于100mlLB 液体培养基中，37°C，220rpm 培养 2-2. 5hr, (OD600 = 0. 5-0. 6) ;4°C，4000rpm 离心 IOmin ；弃上清，向沉淀中加入50ml预冷的0. IM CaCl2悬浮细胞,置于冰上30min ；4°C, 4000rpm离心IOmin,回收细胞；用2-4ml冰预冷的0. IM CaCl2重悬细胞，分装成200 u L/0. 5mL离心管中，于4°C保存，一周内用完。将200 ii L感受态细胞与质粒混匀，冰浴30min，42°C热击
I.5min，冰浴3min，加入800 u L LB培养基，37°C培养60min，取200 y L涂板，37°C培养。实施例2Bt电击感受态的制备挑取单菌落于5ml LB液体培养基，30°C震荡培养过夜。按I %接种量接种于100mlBH 液体培养基中，37°C，220rpm 培养 3-4hr (OD600 = 3 . 0)。4°C，4000rpm 离心 IOmin0 弃上清，加入预冷的超纯水悬浮细胞,4 V，4000rpm离心lOmin，重复两次，弃上清，向沉淀中加A Iml 40% PEG重悬细胞，分装，-70°C保存备用。实施例3四种启动子转录活性比较将重组质粒pHT304PcrylAc、pHT304Pcry3A、pHT304Pcry4A 和 pHT304Pcry8E分别电击转化spoIIID无芽胞突变体(HD-A SpoIIID)，获得菌株SpoIIIDPcry lAc、SpoIIIDPcry3Ac> SpoilIDPcry4A和SpoilIDPcry8E,将这些菌株及野生型对照菌株HDPcry IAc、HDPcry3Ac、HDPcry4A和HDPcry8E过夜活化，接入含有红霉素的SSM培养基中，3 (TC，2 20rpm振荡培养，从Ttl (菌体对数生长期将要结束即将进入稳定期的时间点)取样至T12CTtl后12小时)，每小时取样一次，每次取样2ml，12000Xg离心弃上清，沉淀迅速置于-20°C保存。￠-半乳糖苷酶活性测定向沉淀中加入500 ii L BufferZ(0. 06MNa2HP04 2H20，0. 04M NaH2PO4 H20,0. OlM KC1，0. 001M MgSO4 7H20)和 0. 2g 钢珠，破碎细胞lmin ;4°C，12000Xg离心5min，取20iU上清用于测定蛋白浓度，读取0D595 值；取 IOOiU 上清与 700 u IBufferZ 混合，加入 200 u I 0NPG(4mg/ml)，混匀，37°C 反应，计时直到反应液呈现黄色，加入500 yl，IM Na2CO3，读取0D420值。根据公式计算MillerUnits[Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genetics. New York Cold SpringHarbor Laboratory Press, 352-355]。每组数据进行三次独立重复试验,取平均值。结果表明，crylAc基因启动子(PcrylAc)在野生型菌株HD-73和HD-A SpoIIID菌株中T3开始表达，以后活性显著增强，两者无显著差异(图1，A) ;cry3A基因启动子(Pcry3A)活性从T1到T12在HD-73菌株和HD-A SpoIIID菌株中随着培养时间的延长，活性不断增强，并且cry3A启动子在spoIIID突变体中的活性略高于HD-73菌株中的启动子活性(图1，B) ;cry4A基因启动子(Pcry4A)从T3开始表达，在T5到Tltl之间，cry4a基因启动子在HD-73菌株中的转录活性略高于在SpoIIID突变菌株中的转录活性(图1，C)。cry8E基因启动子(Pcry8E)活性(图1，D)I\到T8上升明显，在T8到T12之间，cry8E基因启动子表达活性稳定在高水平上，并且在HD-73菌株与spoIIID突变株相比，酶活没有显著差异。以上结果说明spoIIID突变对crylAc和cry8E基因启动子转录活性没有显著影响，cry3A启动子转录活性略有提高，而对cry4A基因启动子影响较大。综合分析在HD-73菌株中将各启动子T1到T12的转录活性发现Pcry8E转录活性最高，Pcry4A次之,然后是PcrylAc, Pcry3A转录活性最低(图2，A)。在HD-A SpoIIID菌株中四个启动子的转录活性(图2，B)高低顺序与HD-73野生型菌株中一致。说明spoIIID基因的缺失不影响四个启动子的活性，因此可以选用无芽胞spoIIID突变株进行Cry蛋白表达，构建更安全的工程菌；Pcry8E转录活性在HD-73菌株和spoIIID突变株都是最高的，因此可以选用Pcry8E启动子构建高效表达载体，获得高效的工程菌株。实施例4无芽胞无晶体突变体HD__ A SpoIIID的构建将HD-A SpoIIID菌株按I %接菌量接于50mLBP培养基，42°C，200r/min培养48小时后，按I %接菌量接于50mL BP培养基，42 0C，200r/min培养48小时之后，按4%接菌量接于50mL BP培养基，45°C，200r/min培养12小时后取菌液涂布于固体LB培养基，30°C倒置培养 48 小时[Perez-Garcia, G. , R. Basurto-Rios, and J. E. Ibarra, 2010. Potentialeffect of a putative sigma (H)-driven promoter on the over expression oftheCrylAc toxin ofBacillus thuringiensis. J Invertebr Pathol. 104(2) :p.140-6]。将得到的菌斑用crylAc引物进行筛选，选出无crylAc的菌斑，用鉴定HD-73野生菌株中的含 crylAc 基因的大质粒 pHT73 的引物进行鉴定[Kronstad, J. ff. and H. R. Whiteley, 1984.Inverted repeat sequences flank a Bacillus thuringiensis crystal protein gene.J Bacteriol. 160(1) :p. 95-102]，选出含有crylAc基因的pHT73质粒缺失的菌株，命名为 HD--ASpoIIID。用特异性鉴定 pHT73 质粒的引物 TlAc5' /TlAc3/ (SEQ ID N01)对HD_- A SpoIIID突变体进行PCR鉴定(图3)，结果表明，对照菌株HD-73和HD- A SpoIIID可扩增出IOObp左右的条带，而HD_-A SpoIIID菌株无IOObp条带，说明该菌株缺失pHT73大质粒。显微镜观察结果表明，对照菌株HD-73中可观察到芽胞与杀虫蛋白晶体(图4，A);HD-A SpoIIID菌株中可观察到杀虫晶体蛋白，而无芽胞(图4，B);而HD_-A SpoIIID菌株中只观察到营养体细胞，芽胞与杀虫晶体蛋白都不存在(图4，C)，说明获得了无晶体、无芽胞spoIIID基因突变体。实施例5蛋白表达量及生物活性测定
将含有四种cry 基因启动子(PcrylA, Pcry3A, Pcry4A 和 Pcry8E)与 crylAc基因融合的表达载体pHTPIAc、pHTP3A、pHTP4A和pHTP8E分别电击转化HD- A SpoIIID和 HD二 A SpoIIID 菌株，获得菌株 SpoIIIDpHTPlAc、SpoIIIDpHTP3Ac、SpoIIIDpHTP4A、SpoilIDpHTP8E、HD二 A SpoIIIDpHTPlAc、HD二 A SpoIIIDpHTP3Ac、HD二 A SpoIIIDpHTP4A 和HD 二 ASpoIIIDpHTP8E。
蛋白产量测定利用SSM培养基培养菌株SpoIIIDpHTPlAc、SpoIIIDpHTP3Ac、SpoIIIDpHTP4A、SpoIIIDpHTP8E、HD二 A SpoilIDpHTP lAc、HD二 ASpoIIIDpHTP3Ac、HD--ASpoIIIDpHTP4A 和HD--A SpoIIIDpHTP8E至细胞完全裂解前，收集菌体将其冻干。将得到的冻干粉用Tris-Hcl缓冲液溶解，破碎90s后，加上样缓冲液，沸水浴lOmin，离心取上清液，采用Pierce 660nm protein Assay Kit分别对上样混合液中的总蛋白进行定量。调整上样量使总蛋白含量一致进行点样，利用SDS-PAGE检测各菌株杀虫晶体蛋白的产量。结果表明(图5)，在HD-ASpoIIID菌株中，总蛋白量相同的条件下，PcrylAC、PCry8E指导的CryIAc蛋白产量较高,Pcry4A次之,Pcry3A指导的CryIAc蛋白产量最低。在HD二 A SpoIIID菌株中，四个启动子指导的CrylAc蛋白产量情况(图6)与HD-A SpoIIID菌株中蛋白表达一致，说明含有crylAc野生拷贝对于分析不同cry类型启动子强弱无显著的影响。杀虫活性测定将SpoIIIDpHTPlAc、SpoIIIDpHTP3Ac、SpoilIDpHTP4A 和SpoIIIDpHTP8E菌株制成粉剂，对粉剂中蛋白进行定量，然后稀释成不同的浓度，分别混 入饲料拌勻，测定对小菜蛾(Plutella xylostella)的活性。结果表明(表1)，四个菌株对小菜蛾活性由高到低分别是SpoIIIDpHTPlAc、SpoilIDpHTP8E、SpoilIDpHTP4A和SpoilIDpHTP3Ac。与不同启动子指导的蛋白产量的分析结果一致。综合CrylAc蛋白量表达结果(图5)说明crylAc基因启动子指导自身基因表达，得到最高的CrylAc蛋白产量。而cry8E基因启动子指导的CrylAc蛋白产量接近crylAc基因启动子。表3HD- A SpoIIID菌株对小菜蛾生物活性测定
权利要求
1.无晶体无芽胞菌株HD_-A SpoIIID,其特征是在无芽胞突变体菌株HD- A Sp0IIID中，缺失带有cryIAc基因的pHT73质粒。
2.权利要求I所述的无晶体无芽胞菌株HD_-ASpoIIID的构建方法，包括如下步骤 (1)将HD-ASpoIIID菌株接种于BP培养基，42°C，200r/min培养48小时， (2)再接种于BP培养基，420C，200r/min培养48小时， (3)再接种于BP培养基，450C，200r/min培养12小时， (4)取菌液涂布于固体LB培养基，30°C倒置培养48小时， (5)用得到的菌斑鉴定HD-73野生菌株中的含crylAc基因的大质粒pHT73的引物进行鉴定，选出含 有cryIAc基因的pHT73质粒缺失的菌株，命名为HD二 A SpoIIID。
3.根据权利要求2所述的构建方法，所述含crylAc基因的大质粒pHT73的引物为TlAc3' :5' -ATGGAAAAAGATTTATTTGAAGATG-3'，T1AC5' :5' -CTCTTTATTTTCAATTTTTCGAAGT-3'。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其中步骤(I)、(2)接种量为I%。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其中步骤(3)接种量为4%。
6.权利要求I所述的无晶体无芽胞菌株HD_-A SpoIIID在表达Cry蛋白和构建工程菌中的应用。
7.权利要求6所述的应用，所述Cry蛋白为CrylAc蛋白、Cry3Ac蛋白、Cry4A蛋白、Cry8E蛋白。
8.权利要求6所述的应用，所述工程菌为HD_-A SpoIIIDpHTPIAc、HD二 ASpoIIIDpHTP3Ac、HD二 ASpoIIIDpHTP4A 和 HD二 ASpoIIIDpHTP8E，其结构为在菌株HD-- A SpoIIID 中分别转有启动子 PcrylA, Pcry3A, Pcry4A 和 Pcry8E 与 crylAc 基因融合的表达载体 pHTPlAc、pHTP3A、pHTP4A 和 pHTP8E。
全文摘要
本发明涉及“苏云金芽胞杆菌无芽胞无晶体菌株、其构建方法及其应用”属于生物技术领域。本发明通过比较苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)四种不同转录机制的cry基因启动子(PcrylA、Pry3A、Pcry4A和Pcry8E)在无芽胞突变体HD-ΔSpoIIID中的转录活性，筛选出了在此菌株适合表达外源基因的高活性启动子cry8E基因的启动子，为构建高效表达体系奠定了基础，同时也为新农药的开发提供了表达元件。在此基础上，通过高温诱导的方法构建了一个无芽胞，无晶体的突变株HD-ΔSpoIIID，在该菌株中比较了四种不同转录机制的cry基因启动子指导的Cry1Ac的蛋白表达量，与HD-ΔSpoIIID中的蛋白表达情况一致，说明无芽胞菌株HD-ΔSpoIIID和无芽胞无晶体菌株HD-ΔSpoIIID都是可以用于分析外源cry基因表达的遗传材料。
文档编号C12N1/21GK102634472SQ20121011983
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月21日 优先权日2012年4月21日
发明者宋福平, 张 杰, 彭琦, 束长龙, 梁影屏, 黄大昉 申请人:中国农业科学院植物保护研究所