专利名称：水稻抗病相关基因及其编码蛋白与获得一种提高水稻广谱抗病性品系的制备方法
技术领域：
本发明涉及水稻基因工程技术领域，具体是从水稻日本睛中克隆出AsMW基因全长cDNA。通过水稻遗传转化，获得AsMW基因过表达转基因植株，分别对转基因植株及非转基因植株进行白叶枯病抗病性分析及水杨酸含量的測定。结果表明《sMW基因与水稻广谱抗病性能显著相关。
背景技术：
水稻不仅是重要的粮食作物，还是植物分子生物学研究领域中的重要的模式生物。在水稻生产过程中，由于受稻瘟病、纹枯病、白叶枯病等病害的影响，一直是粮食生产面临的ー个重要难题。在现行防治条件下，全国平均毎年因各种稻病造成稻谷减产达200亿公斤。目前生产上仍然主要以农药防治为主，但是使用农药防治病害有一定农药残留，影响到粮食安全，并且有些水稻的病毒病，目前没有特效农药防治，病害一旦发生将使水稻减产10%-20%。水稻的病害给生产上帯来巨大的损失，直接影响到国家的粮食安全。因此，研究和防治水稻病害具有十分重要的意义。实践证明培育和利用抗病品种是解决上述问题最经济而有效的方法。传统的抗病育种由于需要抗病种质资源的长期保存、周期性的繁殖和鉴定，必然耗资多、工作量大，而且还不可避免地伴随着部分种植资源的丢失；即使获得新的抗源，植株水平的杂交重组也存在新抗病性状与不良性状同时引入的问题，从而很难摆脱育种周期长、抗性亲本缺乏及效率低的窘境，很难得以推广。而通过基因工程改良的目前往往大多是使用一些专化的抗病基因(R基因)来改良和提高植物的抗病性能。但是这种特异的抗性基因经常会随着病原菌小种的变异而失去抗性。植物在长期进化过程中，为了抵抗病原微生物的侵害，植物体内存在着可诱导的抗病反应，包括SAR (System Acquired Resistance系统获得抗性)和ISR (InducedSystemic Resistance诱导系统性抗性)。SRA途径是目前研究最多的途径。植物病原侵染后，非侵染部位在一段较长时期内都保持着对这种病原及一些其它病原的增强抗性，即系统获得性抗性(systemic acquired Resistance, SAR,)或广谱抗性。控制这种SAR的一个关键基因是(non-expresser of PR genes)。Λ7%/基因编码一个锚定蛋白重复序列蛋白(ankyrin repeat),于1997年在模式生物拟南芥中克隆并报道。ΛΡ/tV正调控拟南芥中的SAR反应，在拟南芥中过量表达#/况2后，可明显增强拟南芥对病原微生物的抗性，而#/况7的缺失会导致PR基因不表达，以及植株SAR抗性的丧失。目前拟南芥中又克隆了MNNPR4等一系列控制植物SAR反应的关键基因。(suppressor of npr-1, constitutive,I)，是ー类TIR-NBS-LRR类型广谱抗病基因，在拟南芥中已经克隆并已报道。#似(modifierof scnl)是SAR信号通路中的另一重要广谱抗性基因，编码ー个含Nup96的核孔蛋白。在
过表达的拟南芥中，植株体内水杨酸的含量明显提高并诱导相应病程相关蛋白PRl和PR2的表达，从而增强植株对各种病原微生物的抗病性能。然而，但目前在水稻中还未见报道本发明发现对于水稻中的^modifier of scnl in rice),与拟南芥中的M0S3相比，具有相似的序列，都含有ー个Nup96的核孔蛋白，控制着物质与信息的出核与入核运输，同时表现出对各种病原菌的广谱抗性。
发明内容
发明目的
本发明利用重叠PCR技术(overlap PCR)首次在水稻日本睛中分离克隆出ー个广谱抗病相关基因OsMOS基因cDNA全长所述基因序列和蛋白序列如序列表SEQ ID NO: I和SEQID NO:2 所示。本发明利用基因工程方法，通过使目的基因过表达，构建了 AsMW过表达载体。提供了一种较佳的实施方案，使所述基因在相关表达载体中高效表达。本发明提供了转化上述表达载体宿主细胞的一套较佳的遗传转化实施方案。本发明涉及克隆及分析ー种OsMOS基因的cDNA全长。该基因提高水稻自由态水杨酸的含量并赋予水稻对白叶枯病引起的病害产生抗性。从而鉴定该基因在抗病反应中的所起的作用，为利用该基因培育水稻广谱抗病性能奠定基础。本发明阐述As#似基因的克隆及功能验证过程。转入植株后，为提高植物广谱抗病性提供了ー种方法。有益效果
本发明的优点
MOS为SAR信号途径中的关键基因，在植株的广谱抗病性中起着十分重要的作用。本发明首次在水稻中报道与拟南芥相关基因OsMOS,并通过重叠PCR克隆出水稻fls#a cDNA全长。将AsMW导入水稻中，使其过表达，得到转基因后代水稻。首次功能验证了 AsMW过表达明显提高了水稻体内自由态水杨酸的含量，在幼叶期及孕穗期对白叶枯病有着明显的抗性。为减少水稻病虫害，提高水稻广谱抗病性，提供ー种新的解决途径。
图I为转基因植株与对照植株的自由态水杨酸的含量柱状 图2为图2转基因植株与对照植株在幼叶期及孕穗期对白叶枯病的不同抗性，其中A为幼叶期，B为孕穗期；
图3为水稻日本睛RNA的电泳图。
具体实施例方式 实施例I
I.Trizol法提取日本睛总RNA
(1)称取O. Ig 新鲜、幼嫩的日本睛叶片 QOryza. Sati va L. spp. japonica, varnipponbare,AA genome,鉴定人程备久教授)，加液氮迅速研磨，转移到I. 5mL的离心管(液氮预冷)中。并在离心管中加入ImL Trizol，冰上放置IOmin ；
(2)4°C, 13000rpm,离心 20min ；
(3)转移上清于一新管，加入250uL的5MNaCl，250uL氯仿/异戊醇，剧烈震荡15S，冰上放置3 min ；
(4)4°C，13000rpm,15min ；(5)转移清于另ー个新离心管中，加500uL异丙醇混匀，室温放置IOmin；
(6)4°C，13000rpm,15min ；
(7)弃去上清，加入500uL75%こ醇，洗涤；
(8)4°C,7500rpm,5min,倒掉こ醇,倒放在纸上,室温放干；
(9)カロ20 30uL DEPC水，65 °C水浴保温15_30min后，离心；
(10)检测。电泳检测取2μ L DEPC水溶解的RNA，加入I μ L上样缓冲液(O. 25%ニ甲苯青，O. 25%溴酚蓝，30%甘油水溶液)，I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，20分钟后在凝胶成像系统下观察，可见明显的3条带，分别为55，185，285。18 S为28S的两倍亮。并通过NanoDrop检测，Α260/Α280为I. 933，RNA浓度为1779. 40 ng/μ L。表明水稻日本睛RNA提取成功。如图3所示。两步法反转录(promega反转录试剂盒)
(O反转录体系
总 RNA2μ
25mM Mgcl24μ
Reverse Transcription IOX Buffer2
IOmM dNTP Mixture2
Ribonuclease inhibitor (ll^g /l^L)0. 5
Oligo (dT) 15 Primer (0.5Kg/KL)Ι
MMLV Reverse Transcriptase (15u/ )Ι
Nuclease-Free Water7. 5
Total20
(2)小心混匀，42°C温浴40min，然后95°C加热5min，冰上放置5min终止反应，即获得相应的反转录产物cDNA。重叠PCR扩增OsMOS基因
根据AsMW基因中内含子的分布情况，利用引物设计软件设计4对引物(AF，AR，BF,BR)，其中AF含酶切位点及 H I，BR含酶切位点5^ I。AR与BF反向重复。引物序列如下參见SEQ NO :5-8，具体为
AF :5’-cgcGGATCCATGTCTTCCGACCCGGTGTT-3’
AR :5’-AGTATTCATTGTAAAGAGCCAGAGCGTCAT-3’
BF :5’-ATGACGCTCTGGCTCTTTACAATGAATACT-3’
BR :5’-gccGAGCTCTCAGTCCCTGCAAAGTATGT-3
弓丨物AF，AR扩增出OsMOS A段，引物BF，BR扩增出OsMOS B段，然后利用弓丨物AF、BR，通过重叠PCR扩增对As#似基因cDNA全长。段的扩增 (I) PCR反应体系
IOXPCRbuffer5μ
IOmM dNTP5μ
10 μΜ 引物 AFI μ
10 μΜ 引物 ARI μ Pfu polymerase0. 5
cDNA2μ
ddH2035. 5μ
Total50|^L
(2)最佳反应条件为94で预变性 IOmin
94で变性30 s
52 °C退火30 s35个循环
72 °C 延伸3 min
72 °C延伸IOmin
3. 2 OsMOS B段的扩增
(1)PCR反应体系
IOXPCRbuffer5μ
IOmM dNTP5μ
10 μΜ 引物 BFI μ
10 μΜ 引物 BRI μ
Pfu polymeraseO. 5M-L
cDNA2μ
ddH2035. 5μ
Total50M-L
(2)最佳反应条件为94°C预变性IOmin94°C 变性 30 s
58°C退火30 s35个循环
72°C延伸3 min
72°C 延伸IOmin
3. 3 fls#0 cDNA 全长(A 段 + B 段)
(1)PCR反应体系
IOXPCRbuffer5μ
IOmM dNTP5μ
10 μΜ 引物 AFI μ
10 μΜ 引物 BRI μ
Pfu polymerase0. 5M-L I
A段PCR回收产物WL
B段PCR回收产物WL
ddH2035. 5μ
Total50M-L
(2)最佳反应条件为94°C预变性IOmin94°C 变性 30 s
57°C退火30 s35个循环
72°C延伸5 min72°C 延伸 IOmin
扩增后的产物在含有0.5 Kg/mL溴化こ锭(Ethidium Bromide)的O. 8 %琼脂糖凝胶上电泳。OsMOS A段大小为1475 bp，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No:3 ； OsMOS B段大小为1543 bp，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No:4 -,OsMOS全长为3018 bp，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No: I。
5.PCR扩增片段的纯化
(1)进行琼脂糖凝胶电泳，分离要纯化的片段；
(2)用干净的无菌手术刀切下目的DNA条带放入预称重的I.5 mL eppendorf管；
(3)每O.I g琼脂糖凝胶需加入200 uL SI溶液；
(4)于50で温育，直至琼脂糖完全融解；
(5)每5Ug(不足5 ug，以5 Ug计)DNA需加入5 uL DNA结合液(玻璃粉悬液)，轻轻颠倒混匀，冰上放置10 min ；
(6)室温6000 rpm 离心 20 s ；
(7)弃上清，加700uLこ醇洗液，轻轻抽吸，使玻璃粉悬浮，冰上放置5 min ；
(8)重复(6)、(7)步,6000rpm,离心20 s ;弃上清,小心去除全部残液;
(9)加30 50uL TE，轻轻吹打悬浮玻璃粉，50で温育10 min ；
(10)室温6000rpm离心20 s,吸上清至新的eppendorf管，于4 °C或-20 °C保存备用。
6.过表达载体的构建
将上述纯化的OsMOS基因全长序列，连接到克隆载体pMD18-T Vector (宝生物公司)，再转化到DH5a感受态细胞(宝生物公司)中，挑选阳性菌落接种到5mL含100mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37°C、200rpm的摇床中培养12-16小时，提取质粒，得到含有目的片段的重组质粒，测序验证正确。然后通过及 H !,Sac I分别酶切含有As#似的PMD18阳性克隆以及P1301植物表达载体(本实验室保存，P1301植物表达载体的制备方法參照专利号201110208640. 8)。酶切反应体系为30 μ ，如下所示
权利要求
1.一种水稻抗病相关基因，其特征在于，它具有序列表中SEQ ID N0:1所示的核酸序列或其互补序列。
2.一种水稻抗病相关基因的编码蛋白，SEQ ID N0:2，或相对于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有OsMOS广谱抗病生物活性的蛋白的氨基酸序列。
3.—种表达载体，其特征在于所述载体包含权利要求I所述的全长核酸序列以及与该核酸序列的上游表达调控元件，以组成型启动子CaMV35S启动基因表达，以潮霉素为筛选标记，构建OsMOS基因过表达载体。
4.一种宿主细胞,其特征在于,来自水稻,被权利要求3所述的表达载体转化，并将目的基因整合到其基因组上。
5.获得一种提高水稻广谱抗病性品系的制备方法，其特征在于 (1)将权利要求3所述的表达载体导入4所述植物的细胞内； (2)培养所述植物的细胞以产生再生的植物； (3)使权利要求I所述的一个水稻抗病相关基因在宿主细胞内表达，从而获得广谱抗病性有所提闻的植物品系。
全文摘要
本发明属于水稻基因工程技术领域的利用广谱抗病相关基因OsMOS提高水稻抗病性能的方法。本发明从水稻日本晴中克隆出OsMOS基因全长cDNA，连接到植物载体中,以组成型启动子CaMV35S启动基因的表达，构建OsMOS基因的过表达。利用农杆菌介导的水稻遗传转化，获得转基因植株。通过多重PCR检测筛选标记基因潮霉素及目的基因OsMOS，并对转基因水稻的体内自由态水杨酸(FreeSA)进行测定，白叶枯病抗性接种鉴定。结果表明OsMOS过表达转基因植株FreeSA的含量明显高于对照植株，对白叶枯病具有更高的抗病性。从而提供了一种获得水稻广谱抗病性植株品系的方法。
文档编号C12N15/84GK102628052SQ20121011923
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者吴青青, 周玉琼, 朱苏文, 江海洋, 程备久 申请人:安徽农业大学