专利名称：稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记及其方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pik-S功能特异性分子标记PiksFNP及其方法与应用。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是对水稻生产危害最严重的病害之一,每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定结果容易造成误差，目标基因的选择效率往往较低。随着分子标记技术的产生以及利用，其方便、直接、不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，而且还大大加快了育种步伐。由于位于第11染色体长臂端上的Pik位点含有5个具有不同抗谱以及小种特异性的等位基因Pik-m、Pik、Pik-p、Pik-h以及Pik_s，因此该位点一直是稻瘟病抗性的研究热门。其中，Pik-m(Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-bindingsite—leucine rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific riceblast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、Pik(Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189:321-334)以及Pik_p(Yuan et al. 2011. The Pik-presistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linkedCC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122:1017-1028)已被成功地鉴定并克隆。研究表明，这3个等位基因的稻瘟病抗性须由2个相邻的NBS-LRR类抗病基因共同介导。同时，在水稻群体中，包含这3个等位基因的基因组区域存在着基因型的分化，即当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时存在时，该基因型被定义为K型；而当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时不存在时，该基因型被定义为N型(基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同)。申请人:在Pik-s的精细定位过程中发现，在包含Pik-s位点的基因组区域中，Pik-s供体品种 Shin 2 (Wang et al. 2009. Characterization of rice blast resistancegenes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus. Phytopathology 99 900-905)与Pik-m，Pik以及Pik-p的供体品种具有相似的基因组结构，即与参考序列日本晴之间存在着大片段的插入/缺失。进一步的功能互补实验结果证明了 Pik-s与Pik-m、Pik、Pik-p是真正的等位基因(申请人未发表数据)。为了加快Pik-s在抗病育种工作中的应用，如在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、抗性基因Pik-s与其他功能基因的聚合育种、以及转基因育种中的应用，开发出准确有效且区别于其它等位基因的Pik-s功能特异性分子标记显得尤其重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP。本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的检测方法。 本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的应用。本发明目的通过以下技术方案实现一种稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP，它由Piks-IFNP、Piks-2FNP 和 Piks-3FNP 组合而成，分别由引物对 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2，SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4以及SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pik-s呈特异性带型的分子标记；所述引物对的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. 1(5’ _3’)GTCCTACGACCTGGATGATG ；SEQ ID NO. 2(5，_3，) CAGAGAAGCGATTGGAGGCA ；SEQ ID NO. 3(5’ _3，) TAGACGAGCAAGTCCCTGA ；SEQ ID NO. 4(5’ _3，) GCAAAGTTTACTCCAATCGC ；SEQ ID NO. 5(5，_3，) TTTCTGGAGGTCAGCCGAT ；SEQ ID NO. 6(5’ -3’ ) CAACCGTTGTTTTGCCTCC ；优选的，所述的水稻品种为Shin 2 ；所述的稻瘟病抗性基因Pik-s包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Piks-I和Piks-2。所述的特异性酶切指的是由引物对SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2扩增得到的PCR产物通过限制性内切酶SphI酶切；由引物对SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4扩增得到的PCR产物通过限制性内切酶Nco I酶切；由引物对SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6扩增得到的PCR产物通过限制性内切酶Spe I酶切。所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的检测方法，通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的等位基因序列与Piks-I及Piks-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-s功能特异性的3个单喊基差异(single nucleotide polymorphism, SNP),再通过设计分别得到 SEQ ID NO. I和 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 以及 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 引物，对水稻DNA扩增，并经特异性酶切之后，分别得到Pik-s功能特异性分子标记Piks-IFNP、Piks-2FNP和Piks-3FNP，优选包括以下步骤(I)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pik-s等位基因的编码区DNA序列；(2)将步骤(I)所获得的序列比对，得到Pik-s抗性基因所特异的3个功能特异性单碱基差异 Piks-ISNP、Piks-2SNP 和 Piks_3SNP ；(3)根据步骤(2)所得到的3个SNP，分别设计出引物对SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 2，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 以及 SEQ ID NO 5 和 SEQ IDNO :6，并用这 3 组引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，分别得到扩增产物A、扩增产物B和扩增产物C ；然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证，分别得到与稻瘟病抗性基因Piks呈特异性带型的核苷酸片段Piks-IFNP、Piks-2FNP和Piks_3FNP ；(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pik-s抗性基因的功能特异性的分子标记PiksFNP (由Piks-IFNP、Piks_2FNP和Piks_3FNP组合而成)。更优选的，步骤(I)所述的水稻品种为Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、肪0、黑交(Heijiao, HJ)以及 Q1063。步骤⑵中所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对；步骤(3)中所述的扩增产物A的大小为124bp，酶切后的大小为103bp ；步骤(3)中所述的扩增产物B的大小为145bp，酶切后的大小为64bp和81bp ；步骤(3)中所述的扩增产物C的大小为139bp，酶切后的大小为119bp ；步骤(3)中所述的引物是根据dCAPS标记原理，在Piks-ISNP位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物Piks-IFNP-F，而在其下游100 200bp处设计功能特异性下游引物Piks-IFNP-R，分别如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示；根据CAPS标记原理，在Piks-2SNP位点的上、下游各IOObp范围内设计功能特异性上、下游引物Piks-2FNP-F及Piks-2FNP-R，分别如 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示；根据 dCAPS 标记原理，在 Piks_3SNP位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物Piks-3FNP-F，而在其下游100 200bp处设计功能特异性下游引物Piks-3FNP-R，分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示；步骤(3)所述的PCR扩增反应，其中Piks-IFNP的PCR扩增反应体系如下
10XPCR Buffer2 μ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μ
Piks-IFNP-F (10 μΜ)0.5 μ
Piks-IFNP-R (10 μΜ)0.5 μ
TaKaRa Taq (5 U/μΙ)0.1 μ
DNA 模板(50ng/pl)Ιμ
ddH20补至 20 μ 扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C 5分钟；10°C保存。
PCR反应结束后，利用限制性内切酶SphI对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系
如下
10 X酶切缓冲液1.2 μ
PCR扩增产物5 μ
Sph I0.25 μ
ddH20补至 12 μ 在37Γ条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为124bp，酶切后所得到的产物大小为103bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因Pik-s的功能特异性分子标记Piks-IFNP。步骤(3)所述的PCR扩增反应，其中Piks_2FNP的PCR扩增反应体系如下
10XPCR Buffer2 μ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μ
Piks-2FNP-F (10 μΜ)0.5 μ
Piks-2FNP-R (10 μΜ)0.5 μ
TaKaRa Taq (5 U/μΙ)0.1 μ
DNA 模板(50ng/pl)Ιμ
ddH20补至 20 μ 扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C5分钟；10°C保存。PCR反应结束后，利用限制性内切酶Nco I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体
系如下
10 X酶切缓冲液1.2 μ
PCR扩增产物5 μ
NcoI0.25 μ
ddH20补至 12 μ 在37°C条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为145bp，酶切后得到的产物大小为64bp和81bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因Pik-s的功能特异性分子标记 Piks-2FNP。步骤(3)所述的PCR扩增反应，其中Piks_3FNP的PCR扩增反应体系如下
10XPCR Buffer2 μ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μ Piks-3FNP-F (10 μΜ)0.5 μ
Piks-3FNP-R(10 μΜ)0.5 μ
TaKaRa Taq (5 U/μΙ)0.1 μ
DNA 模板(50ng/pl)Ιμ
ddH20补至 20 μ 扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C5分钟；10°C保存。PCR反应结束后，利用限制性内切酶Spe I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体
系如下
10 X酶切缓冲液1.2 μ
PCR扩增产物5 μ
Spe I0.25 μ
ddH20补至 12 μ 在3rc条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为139bp，酶切后得到的产物大小为119bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因pik-s的功能特异性分子标记Piks-3FNP。一种稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的应用，包括在水稻种质资源中快速、直接地鉴定该抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明的Pik-s功能特异性选择标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pik-s在水稻种质资源中以及育种后代中的鉴定，特别是等位基因之间的鉴别，且不受环境以及人为因素的影响。因此，能够得到广泛的应用，对降低劳动成本，提高育种工作效率起到积极重要的作用。
图I是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的组成基因之一 Piks-I与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图；黑色星号表示由Piks-IFNP造成的功能特异性氨基酸的改变；黑色三角号表示由Piks-3FNP造成的功能特异性氨基酸的改变。
图2是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的组成基因之一 Piks-2与4个Pik位点等位基因及2个感病等位基因的蛋白质序列比对图；黑色星号表示由Piks-2FNP造成的功能特异性氨基酸的改变。图3是验证图，其中图(A)为Pik-s功能特异性分子标记Piks-IFNP在9个水稻品种中的验证图，其中，泳道I :抗性基因供体品种Shin 2 (Pik-s);泳道2 =IRBLks-S (Pik-s单基因系)；泳道
3:抗性品种 K3 (Pik-h);泳道 4 IRBLkh-K3 (Pik-h 单基因系);泳道 5 =IRBLk-Ka (Pik 单基因系);泳道6 : IRBLkm-TS (Pik-m单基因系);泳道7 :IRBLkp_K60 (Pik-p单基因系);泳道8 IRBL7-M(Pi7 单基因系);泳道9 JRBLl-CL (Pil 单基因系);泳道 M :DNAladder ；图(B)是Pik-s功能特异性分子标记Piks-2FNP在9个水稻品系中的验证及检测图，其中，泳道I :抗性基因供体品种Shin 2 (Pik-s);泳道2 =IRBLks-S (Pik-s单基因系)；泳道 3 :抗性品种 K3 (Pik-h);泳道4 :IRBLkh-K3 :(Pik-h 单基因系);泳道5 =IRBLk-Ka (Pik单基因系);泳道6 :IRBLkm-TS(Pik-m单基因系);泳道7 :IRBLkp_K60 (Pik-p单基因系)；泳道8 IRBL7-M(Pi7单基因系);泳道9 JRBLl-CL (Pil单基因系);泳道M :DNAladder ；图(C)是Pik-s功能特异性分子标记Piks_3FNP在9个水稻品系中的验证及检测图，其中，泳道I :抗性基因供体品种Shin 2 (Pik-s);泳道2 =IRBLks-S (Pik-s单基因系)；泳道 3 :抗性品种 K3 (Pik-h);泳道4 :IRBLkh-K3 :(Pik-h 单基因系);泳道5 =IRBLk-Ka (Pik单基因系);泳道6 :IRBLkm-TS(Pik-m单基因系);泳道7 :IRBLkp_K60 (Pik-p单基因系)；泳道8 IRBL7-M(Pi7单基因系);泳道9 JRBLl-CL (Pil单基因系);泳道M :DNAladder。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I :Pik_s等位基因编码区序列的比对及SNP的鉴定通过常规的PCR扩增(Yuanet al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaportheoryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NB S-LRR genes. TheorAppl Genet 122 :1017-1028 ;Zhai et al. 2011. The isolation and characterizationof Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication.New Phytologist 189 :321-334)、测序(上海英骏生物技术有限公司，广州分公司)，从5个抗病水稻品种[Shin 2 (Pik-s供体品种)，Tsuyuake (Pik-m供体品种)，Kusabue (Pik供体品种)，K60 (Pik-p 供体品种)；Wang et al. 2009. Characterization of rice blastresistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology 99 :900-905]、K3 (Pik_h供体品种；Xu et al. 2008. Efficient authenticfine mapping of the rice blast resistance gene Pik_h in the Pik cluster, usingnew Pik-h-differentiating isolates. Molecular Breeding 22:289-299)以及 2 个K 型感病水稻品种黑交(Heijiao, HJ)和 Q1063(Zhai et al. 2011. The isolation andcharacterization ofPik, a rice blast resistance gene which emerged after ricedomestication. New Phytologist 189:321-334)中获得相应的 Pik_s 等位基因编码区DNA 序列[Pik-s (HQ662329)，Pik-p (HM035369)，Pik (HM048900)，Pik-m (AB462256)，已经公开于 http: //www. ncbi. nlm. nih. govl ;利用多序列比对软件工具(http://multalin.toulouse. inra. fr/multalin/),通过对这些序列翻译后的蛋白质序列比对分析,鉴定到存在于Piks-I基因cDNA第347位点，第782位点以及Piks-2基因cDNA第1301位点的功能特异性SNP。在Piks-I基因第347位点，Piks-I编码的第116位点氨基酸为精氨酸(R)，而Pikp-UPikh-I及Pikl-63编码的则为组氨酸(H)，因此，该位点可以将Piks-I与等位基因Pikp-I、Pikh-I及Pikl-63区分开(图I)。而在Piks-I基因第782位点，Piks-I编码的第264位点氨基酸为丙氨酸(A)，而等位基因Pikml-TS和Pik-I编码的则为缬氨酸(V)，因此，该位点可以将Piks-I与Pikml-TS及Pik-I区分开(图I)。而在Piks-2基因第1301位点，Piks-2编码的第434位点氨基酸为丝氨酸(S)，而等位基因Pikh_2和Pikp-2编码的则为苏氨酸(T)，因此，该位点可以将Piks-2与Pikh-2和Pikp-2区分开(图2)。以上3个功能特异性SNP位点的组合使用则可以将Pik-s与Pik-p、Pikm-TS、Pik、Pikh、及Pik_63等其他稻瘟病抗性基因区分开。实施例2 =Pik-S功能特异性分子标记及其引物设计与检测根据dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences ；Neff etal.2002. Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis.Trends in Genetics 18 :613-615)及CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences ；Konieczny and Ausubel,2002. A procedure for mapping Arabidopsis mutations usingco-dominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J 4 :403_410)标记的设计原理，根据dCAPS标记原理，在Piks-ISNP位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物Piks-IFNP-F，而在其下游100 200bp处设计功能特异性下游引物Piks-IFNP-R，分别如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示；根据CAPS标记原理，在Piks_2SNP位点的上、下游各IOObp范围内设计功能特异性上、下游引物Piks-2FNP-F及Piks_2FNP_R，分别如SEQ IDNO. 3和SEQ ID NO. 4所示；根据dCAPS标记原理，在Piks_3SNP位点设计带有错配碱基的功能特异性上游引物Piks-3FNP-F，而在其下游100 200bp处设计功能特异性下游引物Piks-3FNP-R，分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。通过这3组引物对携带有Pik-s基因以及其他等位基因的品种DNA模板进行扩增，分别得到扩增产物A、扩增产物B和扩增产物C ;然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证，分别得到与稻瘟病抗性基因Piks呈特异性带型的核苷酸片段Piks-IFNP、Piks-2FNP和Piks_3FNP。
Piks-IFNP的PCR扩增反应体系如下IOXPCR Buffer2 μ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μ
Piks-IFNP-F (10 μΜ)0.5 μ
Piks-IFNP-R (10 μΜ)0.5 μ
TaKaRa Taq (5υ/μ1)0.1 μ
DNA 模板(50ng/pl)Ιμ
ddH20补至 20 μ 扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C5分钟；10°C保存。PCR反应结束后，利用限制性内切酶SphI对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系
如下
10 X酶切缓冲液1.2 μ
PCR扩增产物5 μ
Sph I0.25 μ
ddH20补至 12 μ 在37Γ条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为124bp，酶切后所得到的产物大小为103bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因Pik-s的功能特异性分子标记Piks-IFNP。步骤3)所述的PCR扩增反应，其中Piks_2FNP的PCR扩增反应体系如下IOXPCR Buffer2 μ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μ
Piks-2FNP-F (10 μΜ)0.5 μ
Piks-2FNP-R (10 μΜ)0.5 μ
TaKaRa Taq (5υ/μ1)0.1 μ
DNA 模板(50ng/pl)Ιμ
ddH20补至 20 μ 扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C5分钟；10°C保存。PCR反应结束后，利用限制性内切酶Nco I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体
系如下
10 X酶切缓冲液1.2 μ
PCR扩增产物5 μ
NcoI0.25 μ
ddH20补至 12 μ 在37Γ条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为145bp，酶切后得到的产物大小为64bp和81bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因Pik-s的功能特异性分子标记 Piks-2FNP。步骤3)所述的PCR扩增反应，其中Piks_3FNP的PCR扩增反应体系如下IOXPCR Buffer2 μ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μ Piks-3FNP-F (10 μΜ)0.5 μ Piks-3FNP-R (10 μΜ)0.5 μ
TaKaRa Taq (5υ/μ1)0.1 μ
DNA 模板(50ng/pl)Ιμ
ddH20补至 20 μ 扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C5分钟；10°C保存。 PCR反应结束后，利用限制性内切酶Spe I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体
系如下
10 X酶切缓冲液1.2 μ
PCR扩增产物5 μ
Spe I0.25 μ
ddH20补至 12 μ 在37Γ条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2小时30分钟。扩增所得到的PCR产物大小为139bp，酶切后得到的产物大小为119bp，前者(不能被酶切)即为抗性基因Pik-s的功能特异性分子标记Piks-3FNP。实施例3 :抗性基因Pik-s功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的应用采集含有不同的稻瘟病抗性基因的9个水稻品系，分别为Shin 2(Pik_s供体品种；ffang et al. 2009. Characterization of rice blast resistance genes in thePik cluster and fine mapping of the Pik-p locus. Phytopathology 99:900-905)；K3 (Pik-h 供体品种；Xu et al. 2008. Efficient authentic fine mapping of the riceblast resistance gene Pik_h in the Pik cluster,using new Pik-h-differentiatingisolates. Molecular Breeding 22:289-299) ;IRBLkh_K3，IRBLk-Ka, IRBLkm-TS,IRBLkp-K60, IRBL7-M，IRBL I-CL, IRBLks-S[Kobayashi et al. 2007. Developmentof newsets of international standard differential varieties for blast resistance inrice (Oryza sativa L.). JARQ 41:31-37]的基因组DNA，并以此为模板，利用实施例2中描述的Piks-IFNP、Piks-2FNP和Piks_3FNP的PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pik-S功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。电泳结果分别如图3A、图3B和图3C所示。如
的那样，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pik-s功能特异性分子标记可在鉴别Pik-s基因与其他稻瘟病抗性基因得到应用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。权利要求
1.一种稻瘟病抗性基因Pik-S功能特异性分子标记PiksFNP，其特征在于它由Piks-IFNP, Piks-2FNP 和 Piks_3FNP 组合而成；分别通过引物对 SEQ ID NO. I 和 SEQ IDNO. 2，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4，以及 SEQ ID NO. 5 和 SEQID NO. 6，分别从水稻总 DNA 中扩增出来核苷酸序列Piks-lFNP、Piks-2FNP和Piks_3FNP，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pik-s呈特异性带型的分子标记；所述引物对 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4，以及 SEQ IDNO. 5和SEQ ID NO. 6的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I :5’ -GTCCTACGACCTGGATGATG-3’ ；SEQ ID NO. 2 :5’ -CAGAGAAGCGATTGGAGGCA-3’ ； SEQ ID NO. 3 :5’ -TAGACGAGCAAGTCCCTGA-3’ ；SEQ ID NO. 4 :5’ -GCAAAGTTTACTCCAATCGC-3’ ；SEQ ID NO. 5 :5’ -TTTCTGGAGGTCAGCCGAT-3’ ；SEQ ID NO. 6 :5’ -CAACCGTTGTTTTGCCTCC-3’。
2.根据权利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP，其特征在于所述的水稻为水稻品种Shin 2。
3.根据权利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP，其特征在于所述稻瘟病抗性基因Pik-s包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Piks-I和Piks-2。
4.根据权利要求I 3任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的检测方法，其特征在于通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的等位基因序列与Piks-I及Piks-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-s功能特异性的3个单碱基差异，再通过设计分别得到SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4，以及 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6，对水稻 DNA扩增，分别得到Pik-s功能特异性分子标记Piks-lFNP、Piks-2FNP和Piks_3FNP，组合得到稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP。
5.根据权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的方法，其特征在于包含了以下步骤 (1)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pik-s等位基因的编码区DNA序列； (2)将步骤⑴所获得的序列比对，得到Pik-s抗性基因所特异的3个功能特异性单碱基差异 Piks-ISNP、Piks-2SNP 和 Piks_3SNP ； (3)根据步骤(2)所得到的3个SNP，分别设计出引物对SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4以及SEQ ID NO 5和SEQ IDNO :6，并用这3组引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，分别得到扩增产物A、扩增产物B和扩增产物C ;然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证，分别得到与稻瘟病抗性基因Piks呈特异性带型的核苷酸片段 Piks-IFNP、Piks-2FNP 和 Piks_3FNP ； (4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pik-s抗性基因的功能特异性的分子标记PiksFNP，该分子标记PiksFNP由Piks-IFNP、Piks_2FNP和Piks-3FNP组合而成。
6.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的检测方法，其特征在于 步骤I)所述的水稻品种为Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交以及Q1063。
7.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的检测方法，其特征在于 步骤(3)中所述的PCR扩增反应，Piks-IFNP的扩增反应体系为IOXPCR buffer 2 μ 1,2. 5mM dNTP I. 6μ IUOyM SEQ ID NO. I :0. 5 μ I、10 μ M SEQID NO. 20. 5 μ I、5U/ μ I TaKaRa Taq O. I μ I、50ng/ μ I DNA 模板 I μ I, ddH20 补至 20 μ I ; 温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C 5分钟；10°C保存； 对于Piks-IFNP，步骤(3)中所述的酶切的反应体系如下IOXbuffer 11. 2 μ 1，PCR 产物 5 μ 1，SphIO. 25 μ 1，ddH20 补至 12μ I ； 步骤⑶中所述的PCR扩增反应，Piks-2FNP的扩增反应体系为10XPCR buffer 2 μ 1,2. 5mM dNTP I. 6μ IUOyM SEQ ID NO. 3 :0. 5 μ I、10 μ M SEQID NO. 40. 5 μ I、5U/ μ I TaKaRa Taq O. I μ I、50ng/ μ I DNA 模板 I μ I, ddH20 补至 20 μ I ; 温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C 5分钟；10°C保存； 对于Piks-2FNP，步骤(3)中所述的酶切的反应体系如下IOX 酶切缓冲液 I. 2 μ 1，PCR 产物 5 μ 1，NcoIO. 25 μ I, ddH20 补至 12μ I ； 步骤⑶中所述的PCR扩增反应，Piks-3FNP的扩增反应体系为10XPCR buffer 2 μ 1,2. 5mM dNTP I. 6μ IUOyM SEQ ID NO. 5 :0. 5 μ I、10 μ M SEQID NO. 60. 5 μ I、5U/ μ I TaKaRa Taq O. I μ I、50ng/ μ I DNA 模板 I μ I, ddH20 补至 20 μ I ; 温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C 5分钟；10°C保存； 对于Piks-3FNP，步骤(3)中所述的酶切的反应体系如下IOX 酶切缓冲液 I. 2 μ 1，PCR 产物 5 μ 1，SpeIO. 25 μ I, ddH20 补至 12 μ I。
8.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pi7功能特异性分子标记的方法，其特征在于 步骤(3)中所述的扩增产物A的大小为124bp，酶切后的大小为103bp ； 步骤(3)中所述的扩增产物B的大小为145bp，酶切后的大小为64bp和81bp ； 步骤⑶中所述的扩增产物C的大小为139bp，酶切后的大小为119bp。
9.权利要求I 3任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP的应用，其特征在于利用所述的瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记PiksFNP在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中进行应用。
全文摘要
本发明公开一种稻瘟病抗性基因Pik-s功能特异性分子标记及其方法与应用。该分子标记由Piks-1FNP、Piks-2FNP和Piks-3FNP组成，分别由引物对SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik-s的等位基因序列与Piks-1及Piks-2序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-s功能特异性的3个单碱基差异，再通过设计，得到前述引物，对水稻DNA扩增，分别得到Pik-s功能特异性分子标记Piks-1FNP、Piks-2FNP和Piks-3FNP。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。
文档编号C12N15/11GK102653760SQ201210118460
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月20日 优先权日2012年4月20日
发明者林菲, 潘庆华, 王玲, 翟纯, 陈彩霞 申请人:华南农业大学