专利名称：一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种分离与制备微生态制剂的技术，尤其是一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法。
背景技术：
鱼类肠道正常菌群是肠道微生物的重要组成成分，是各种生命活动影响因素之一，是在与宿主共同进化过程中形成的，以及二者之间相互作用而成的微生态系，与鱼类营养、物质消化吸收、免疫应答、器官的发育及疾病感染有关。肠道菌群跟据其作用可分为固有菌群和非固有菌群，或者分为原籍菌群Autocht honous flora和外籍菌群Allochthonous flora,这种分类只是相对的。红酵母Rhodotorula广泛分布于海洋及淡水环境 中，其富含蛋白质、不饱和脂肪酸、多种B族维生素、消化酶及生长因子，同时也能产生一些保健功能活性物质。更为重要的是，红酵母能合成生产以虾青素为主的类胡萝卜素，是相当优质的微生物饲料。目前人们把海洋红酵母Rhodotorula glutinis作为一种水产养殖的益生菌来应用。红酵母属中有许多种类寄附在鱼、虾和贝类的身体上，与其共生，一般不致病，是鱼、虾、贝的开口饵料。斑马鱼Danio rerio作为一种新型模式生物近年来在研究人类遗传、免疫、及生理方面倍受关注。利用红酵母作为观赏鱼和水产品的饲料添加剂，将在防病治病、提高观赏鱼和水产品养殖生产力方面发挥巨大的潜能，并有利于绿色环保型观赏鱼和水产品的生产。
发明内容
为了有效预防观赏鱼及水产品的疾病，减低水产品死亡率，本发明提供一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法，该方法不仅工艺流程操作简便，成本低廉，而且本方法制备的观赏鱼的养殖用红酵母微生态制剂可以起到有效预防观赏鱼和水产品的疾病，增强抗病力的作用，降低病死率，同时不会造成环境污染和抗生素药物残留的问题。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是该观赏鱼用红酵母微生态制剂的分离、鉴定与制备方法包括以下步骤
(1)红酵母的分离
无菌操作对斑马鱼的体表用75%的酒精消毒，取其肠道中部，置于盛有IOmL的无菌生理盐水的离心管中，剪碎混匀，取适量均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，保持培养基内的温度为恒温25-28°C，培养3天；挑选典型菌落转种到新的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，反复传代2 3次，筛选出目的酵母接种到斜面备用；所述的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基的成分及制备方法为去皮马铃薯190-210g，葡萄糖18-20g及琼脂13. 5-16. 5g，由去离子水定容至990-1010 mL，PH值为7_8，115-126°C条件下灭菌18-22min ；
(2)红酵母的鉴定 Φ生理生化实验酵母菌生化试剂鉴定管购自杭州天和微生物有限公司，酵母糖发酵和碳源同化的实验按常规方法进行，保持培养基内为恒温25-30°C，培养2 5天，观察结果。Φ的聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析
提取酵母菌DNA后，选取26S rDNA Dl /D2区的PCR反应体系进行PCR扩增，将扩增产物送由生工生物工程上海有限公司进行测序，采用BLAST和Clustalxl. 83程序进行26S rDNA序列比对分析，进而构建系统发育树和置信度检测。(3)红酵母微生态制剂的制备方法
Φ菌株提取
取一株(I)中提取的红酵母菌Rhodotorula glutinis，保藏号为MCCC2A00030，在PDA培养基上保持恒温25-30°C培养3天，在发酵培养基中保持恒温25-30°C、190-210 rpm摇床培养4-6天，该菌26 S rDNA的GenBank登陆号是HQ323251 ;所述的发酵培养基为去皮马铃薯 190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白胨 2. 5-3. 5g，KH2PO4 O. 9-1. Ig，MgSO4O. 4-0. 6g，由去离子水定容至990 -1010 mL, PH值为7-8，在115_126°C条件下灭菌18_22min ;
0菌株活化用牙签从斜面刮取一块菌种接种于PDA液体培养基试管中保持恒温25-300C，培养3天，再将其接种于发酵培养基试管中保持恒温25-30°C，培养3天，接种量为IO6 CFU/ml，反复 3 次；
@菌株扩培将步骤Θ的液体菌种接种于装有发酵培养基的三角瓶中，在恒温25-30°C、200rpm摇床培养5天，接种量为IO6 CFU/ml ；
B菌株收集浓缩在无菌条件下，将步骤 的摇瓶培养菌液用O. 22um微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/ml菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂。其中，上述观赏鱼用红酵母微生态制剂的应用方法发酵完成后，采用65°C以下低温烘干粉碎后加水外喷涂使用；对于即时使用的产品，不必进行烘干处理，这样可以更好地发挥红酵母中营养因子的生理活性，也可以减少因烘干而导致的部分有益微生物的损失；在观赏鱼养殖饲料中微生态制剂的添加量为IO8 109CFU/g。本发明的有益效果是，该方法不仅工艺流程操作简便，成本低廉，对设备要求低，而且本方法制备的观赏鱼的养殖用红酵母微生态制剂可以起到有效预防观赏鱼和水产品的疾病，增强抗病力的作用，降低病死率，同时不会造成环境污染和抗生素药物残留的问题；另外，豆柏中大分子蛋白质分解为小分子的肽类，提高了蛋白质的消化吸收率，并通过微生物转化进一步平衡了氨基酸的营养价值；发酵饲料中补充了由于红酵母菌代谢引入的虾青素，提高了饲料的营养价值。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图I是酵母菌的生理生化特征。注+为阳性，-为阴性(位置变化)。
具体实施例方式(I)酵母菌的分离
无菌操作对斑马鱼的体表用75%的酒精消毒，取其肠道中部，置于盛有IOmL的无菌生理盐水的离心管中，剪碎混匀，取适量均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，保持培养基内的温度为恒温25-28°C，培养3天；挑选典型菌落转种到新的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，反复传代2 3次，筛选出目的酵母，在4°C冰箱内保存备用。将筛选出的酵母菌在平板上四区划线，在25-28°C恒温条件下培养2 3天，观察其菌落形态。该菌株在PDA培养基上培养2天后菌落呈粉红色圆形、表面光滑、隆起、湿润、不透明、边缘整齐；酵母细胞呈椭圆形且较大，大小为4. 0-5. 5X5. 0-7. 5 μ m，进行出芽生殖，载玻片培养未见假菌丝。(2)红酵母的鉴定
Φ生理生化实验
酵母菌生化试剂鉴定管购自杭州天和微生物有限公司，酵母糖发酵和碳源同化实验按常规方法进行，28°C培养2 5天，观察生理生化特征结果。酵母菌生理生化特性鉴定指标有碳源发酵测试、碳源同化和肌醇同化测试。本实验对该株菌分别进行了葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、海藻糖6种碳源的发酵测试。结果显示，该菌株不发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖及海藻糖；同化试验测定结果，见附图I酵母菌的生理生化特征。查阅《酵母菌的特征与鉴定手册》，判断该菌株的形态学和各项生理生化检测结果符合红酵母Rhodotorula的特征,初步确定该菌株为红酵母。Q的聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析
参照CATB法提取酵母菌DNA后，选取26S rDNA Dl /D2区进行PCR扩增，所用引物为通用引物正向 NL— I: 5 — GCATAT-CAATAAGCGGAGGAAAAG— 3，反向 NL — 4:5 —GGTCCGT-GTTTCAAGACGG — 3，由生工生物工程上海有限公司合成。PCR的反应体系精简为20 uL: DNA 模板 I. 5 uL, 10 X buffer 2 ul, 10mmol/L dNTP O. 5 ul, 10 pmol /I 引物各O. 5 ul，Taq DNA聚合酶O. 5 ul，加无菌水至20 ul，反应条件94°C 5min预变性，95°C 45s变性，60°C 45s退火，72°C Imin延伸，30个循环。扩增产物送由生工生物工程上海有限公司进行测序，测序获得642bp目的片段，已被Genbank所接受，登陆号为HQ323251。采用BLAST和ClustalX程序与Genbank数据库中已收录的酵母26SrDNA D1/D2区序列比对构建系统发育树，并通过1000次的自举分析bootstrap进行置信度检测，结果表明该酵母菌的26SrDNA序列与斯鲁菲亚红酵母Rhodotorula slooffiae, EU583485序列相似性在99%-100%之间，处于同一分支上，亲缘关系最近，据此将该菌鉴定为斯鲁菲亚红酵母 Rhodotorula slooffiae。(3)红酵母菌的安全性实验
将红酵母菌培养，用生理盐水调节菌液的浓度分别为108、109、101(lCFU/ml ;实验开始前24h停止投喂，对观赏用金鱼，体重8-10g/尾，采用注射的方法，剂量为50ul/尾，每组用鱼10尾，以同浓度的的副溶血弧菌和生理盐水做对照，每组设5个重复，记录观察7天累计死亡情况；对成年斑马鱼，体长3-4cm/尾，采用浸泡感染，浸泡时间为15 min，每组用鱼10尾，以同浓度的嗜水气单胞菌和生理盐水做对照，每组设5个重复，连续观察7天记录累计死亡情况。结果表明，注射108、109、101QCFU/ml副溶血弧菌的金鱼全部死亡；浸泡108、109、1010CFU/ml嗜水气单胞菌的斑马鱼的死亡率分别为80%、90%、100%,注射ΙΟ8、109、1010CFU/ml红酵母菌的金鱼、同浓度的菌液浸泡斑马鱼和空白对照组在实验期间采食和生长均正常，无死亡。说明红酵母菌对观赏鱼金鱼和斑马鱼安全无毒，可以作为在观赏鱼养殖中具有安全性和潜在应用价值的外源益生菌使用。(4)红酵母菌微生态制剂的制备方法 Φ菌株提取
取一株(I)中提取的红酵母菌Rhodotorula glutinis，保藏号为CPCC 360002，在PDA培养基上保持恒温25-28°C培养3天，在发酵培养基中保持恒温25-28°C、190-210rpm摇床培养4-6天，该菌26 S rDNA的GenBank登陆号是HQ323251 ;所述的发酵培养基为去皮马铃薯 190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白胨 2. 5-3. 5g，KH2PO4 O. 9-1. Ig，MgSO4O. 4-0. 6g，由去离子水定容至990 -1010 mL, PH值为7. 4，在115_126°C条件下灭菌18_22min ;
0菌株活化用牙签从斜面刮取一块菌种接种于PDA液体培养基试管中保持恒温
25-280C，培养3天，再将其接种于发酵培养基试管中保持恒温25-28°C，培养3天，接种量为IO6 CFU/ml，反复 3 次；
Θ菌株扩培将步骤@的液体菌种接种于装有发酵培养基的三角瓶中，在恒温25-28 V、190-210rpm 摇床培养 4-6 天，接种量为 IO6 CFU/ml ；
&菌株收集浓缩在无菌条件下，将步骤 的摇瓶培养菌液用O. 22um微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/ml菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂。在观赏鱼养殖饲料中的应用
饲料配方将粉碎后的豆柏、猪血粉和麸皮，加上鱼粉四种成分按2:3:3:1的比例混合均匀，维生素和矿物质5%，加适量榆树叶粉或小麦粉水溶液作黏合剂，充分揉合后，制成IOOOg固体发酵基料；另将菌剂配成IO8 CFU/g的制剂，并与KH2PO4 l.Og、MgSO4 O. 5g、Nacllg、蔗糖30g及水混合，制成IOOOg营养补充剂，PH值为6.5;固体和液体两基料按
I.2-2. 2比列混合均匀，40°C条件下发酵2小时，制成固体发酵培养基粉碎再加工成5_的颗粒状，在固定低温风干干燥床上于35— 60°C温度下干燥24— 36小时，即成成品饲料用。发酵完成后，通过血球计数板计算，红酵母菌菌体数量可达到48亿个/克干重，PH值在
6.5左右，发酵物气味略酸，色泽较发酵前明显变浅，呈粉红色。在本实施例中，也可加入嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌代替一定比例的红酵母菌，会使味道更佳。用本发明制备的红酵母菌微生态制剂添加到观赏鱼养殖中，经饲喂实验证明鱼饲料转化率达到2. 56%，成活率达到97. 6%，死亡率降低了 25. 8% ;对其免疫保护率有一定的提高，从生长性能的指标来看，菌剂的添加可改善观赏鱼的生长性能，提高生长速度。
权利要求
1.一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法，该制备方法包括红酵母的分离、红酵母的鉴定及红酵母微生态制剂的制备；其特征是无菌操作对斑马鱼的体表用75%的酒精消毒，取其肠道中部，置于盛有IOmL的无菌生理盐水的离心管中，剪碎混匀，取适量均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，保持培养基内的温度为恒温25-28°C，培养3天；挑选典型菌落转种到新的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，反复传代2 3次，筛选出目的酵母接种到斜面备用；所述的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基的成分及制备方法为去皮马铃薯190-210g，葡萄糖18-20g及琼脂13. 5-16. 5g，由去离子水定容至990-1010 mL, PH值为7-8，115-126°C条件下灭菌18_22min ;红酵母的鉴定包括生理生化实验及26S rDNA的聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析；红酵母微生态制剂的制备方法包括菌株提取、菌株活化、菌株扩培及菌株收集浓缩。
2.根据权利要求I所述的生理生化实验；其特征是酵母糖发酵和碳源同化的实验按常规方法进行，保持培养基内为恒温25-28°C，培养2 5天，观察结果。
3.根据权利要求I所述的26SrDNA的聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析；其特征是提取酵母菌DNA后，选取26S rDNA Dl /D2区的PCR反应体系进行PCR扩增，采用BLAST和Clustalxl. 83程序进行26S rDNA序列比对分析，进而构建系统发育树和置信度检测。
4.根据权利要求I所述的红酵母微生态制剂的制备方法；其特征是①取一株提取的红酵母菌Rhodotorula glutinis，在PDA培养基上保持恒温25-28°C培养3天，在发酵培养基中保持恒温25-28°C、190-210rpm摇床培养4_6天；所述的发酵培养基为去皮马铃薯.190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白胨 2. 5-3. 5g，KH2PO4 O. 9-1. Ig，MgSO4O. 4-0. 6g，由去离子水定容至990-1010 mL, PH值为7. 4，在115_126°C条件下灭菌18_22min ;②用牙签从斜面刮取一块菌种接种于PDA液体培养基试管中保持恒温25-28 °C，培养3天，再将其接种于发酵培养基试管中保持恒温25-28°C，培养3天，接种量为IO6 CFU/ml,反复3次将步骤§的液体菌种接种于装有发酵培养基的三角瓶中，在恒温28°C、200rpm摇床培养5天，接种量为IO6 CFU/ml 在无菌条件下，将步骤'S的摇瓶培养菌液用O. 22um微滤膜过滤浓缩成.500 亿 CFU/ml 菌液。
全文摘要
本发明涉及一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法，该方法包括从斑马鱼的肠道中部分离出红酵母、通过生理生化实验和聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析对红酵母进行鉴定与对红酵母微生态制剂进行制备。该方法不仅工艺流程操作简便，成本低廉，而且本方法制备的观赏鱼的养殖用红酵母微生态制剂可以起到有效预防观赏鱼和水产品的疾病，增强抗病力的作用，降低病死率，同时不会造成环境污染和抗生素药物残留的问题。
文档编号C12R1/645GK102715358SQ201210120200
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者吕爱军, 王艺, 胡宏晓, 胡秀彩 申请人:江苏师范大学