一种hrma检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法
【专利摘要】本发明公开了一种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法，其特征在于包括以下步骤：根据华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫COX1基因设计引物对；所述引物对的上游引物序列为：5‘-GGTAGGGTGGTTTGAGC-3’，所述引物对的下游引物序列为：5‘-TCATAGTAACCGAGCTAAA-3’；提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用带HRM模块的荧光PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的高分辨率熔解曲线分析同时检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法。
【专利说明】—种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种高分辨率熔解曲线分析(HRMA )检测华支睾吸虫的方法，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]中华支辜吸虫Clonorchis sinensis,简称华支辜吸虫，又称肝吸虫(liverfluke)。成虫寄生于人体的肝胆管内，可引起华支睾吸虫病(Clonorchiasis),又称肝吸虫病，华支睾吸虫为我国最重要的食源性寄生虫。本虫于1874年首次在加尔各答一华侨胆管内发现，1908年才在我国证实该病存在。1975年在我国湖北江陵西汉古尸粪便中发现本虫虫卵，继之又在该县战国楚墓古尸见该虫卵，从而证明华支睾吸虫病在我国至少已有2300年以上历史。华支睾吸虫病主要分布在亚洲，如中国、日本、朝鲜、越南和东南亚国家。在我国除青海、宁夏、内蒙古、西藏等尚未见报道外，其余25个省、市、自治区都有不同程度流行。据1988~1992年全国寄生虫病调查报道，全国平均感染率为0.365%，平均感染率最高为广东省(1.824%)。华支睾吸虫病的流行，除需有适宜的第一、第二中间宿主及终宿主外，还与当地居民饮食习惯等诸多因素密切相关。麝猫后睾吸虫形态、生活史、致病机理都与华支睾吸虫密切相关，是原发性胆管细胞型肝癌的确定致病因素。麝猫后睾吸虫流行的国家(泰国、老挝等)原发性胆管细胞型肝癌的发生率高，泰国胆管细胞型肝癌的发生率最高(87/10 万)。
[0003]高分辨熔解曲线分析(high-resolution melt analysis, HRMA)技术是近几年来在国外兴起的一种用于物种鉴定的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的分子检测技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解曲线分析，即可完成对物种鉴定、基因分型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作`。
[0004]HRMA利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录熔解曲线，从而对样品进行检测。虽然带HRM模块的荧光PCR仪与普通荧光PCR仪购买价格相差不大，但其温度均一性要高很多。如普通定量PCR仪温度均一性±0.250C，温度分辨率为0.1°C，而Rotor-Gene6000温度均一性为±0.01°C，温度分辨率为0.02°C。其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分，加上饱和性染料(LC Green、Eva Green等)的出现，使得HRM这一技术的普及使用成为可能。
[0005]目前，华支睾吸虫的检测方法主要有传统镜检方法和分子检测方法。其中传统方法，存在操作繁琐、难鉴别、易漏检等缺点。分子检测方法中，包括了常规PCR方法，但是常规PCR需要扩增后进行电泳，操作复杂而且极易引起污染。而探针法PCR则存在检测成本很高，试剂保存期短等缺点。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的高分辨率熔解曲线分析同时检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用以下方案:
[0008]一种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0009]A、根据华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫COXl基因设计引物对；所述引物对的上游引物序列为:5 ‘-GGTAGGGTGGTTTGAGC-3’，所述引物对的下游引物序列为:5 ‘-TCATAGTAACCGAGCTAAA-3，；
[0010]B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；
[0011]C、应用带HRM模块的荧光PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱。
[0012]如上所述一种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法，其特征在于步骤B中所述非标记荧光PCR扩增过程是在反应液中进行的，其中制备20 μ L的反应液由以下组分组成:
[0013]
【权利要求】
1.一种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法，其特征在于包括以下步骤: A、根据华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫COXl基因设计引物对；所述引物对的上游引物序列为:5 ‘-GGTAGGGTGGTTTGAGC-3’，所述引物对的下游引物序列为:5 ‘-TCATAGTAACCGAGCTAAA-3，； B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增； C、应用带HRM模块的荧光PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱。
2.根据权利要求1所述一种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法，其特征在于步骤B中所述非标记荧光PCR扩增过程是在反应液中进行的，其中制备20 μ L的反应液由以下组分组成:
3.根据权利要求1或2所述的一种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法，其特征在于步骤B中非标记荧光PCR扩增的扩增反应按以下步骤进行: (1)92°C~96°C预变性 30s ； (2)92°C~96°C变性 10 ~30s, 55_63°C退火 10 ~30s, 72°C 10 ~30s,共进行 40 ~50个循环； (3)72°C延伸 10 ~30s。
4.根据权利要求1所述的一种HRMA检测华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫的方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行:
(1)92°C~96°C 变性 Imin ； (2)40°C复性Imin ； (3)然后初始熔解温度60~65°C，开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测突光信号，15~25次/秒。
【文档编号】C12Q1/68GK103866015SQ201410081323
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】蔡先全 申请人:蔡先全