一种华支睾吸虫特异性ppmp型抗原的制作方法
【专利摘要】本发明一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原，抗原基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，还提供了一种特异性的结合上述华支睾吸虫的特异性抗原的抗体。还提供了一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白，由上述华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码。还提供了这种含有华支睾吸虫的特异性抗原基因的载体。本发明还提供了一种试剂盒。本发明还提供了上述的华支睾吸虫的特异性抗原蛋白、抗体、载体和试剂盒在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。本发明的华支睾吸虫PPMP型抗原具有较高的免疫原性，易制备多/单克隆抗体，可应用于抗原检测等方面，实验证明实验动物（小鼠）对该抗原免疫应答较强。
【专利说明】一种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原
[0001]本申请是申请号为“2010101786846”、申请日为“2010年05月19日”、发明名称为“华支睾吸虫特异性PPMP型抗原及其应用”的分案申请。
【技术领域】:
[0002]本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种华支睾吸虫，具体来说是三种华支睾吸虫的特异性抗原PPMP型抗原及其应用。
【背景技术】:
[0003]华支辜吸虫病(Clonorchiasissinensis)是由华支辜吸虫[Clonorchissinensis, Cs]感染所引起的人兽共患病。该病主要分布于亚洲,如中国、日本、韩国(为韩国主要人体寄生虫)、朝鲜、越南、东南亚等国家。估计全球有3500万人感染。在我国，除新疆、内蒙古、甘肃、青海、西藏、宁夏等省、自治区未见报道外，其余25个省、市、自治区以及台湾省和香港特别行政区都已有该病的流行报道或病例报告。由于移民的流动，以及日益频繁的全球范围的旅游和经济活动，在一些非流行区和发达国家(包括北美和西欧)该病的病例报告也越来越多。
[0004]根据卫生部于2001年6月~2004年底在全国(除台湾、香港、澳门外)进行的人体重要寄生虫病现状调查结果显示，华支睾吸虫感染率比1990年全国寄生虫病分布调查的结果上升了 75%，其中广东、广西、吉林3省(区)分别上升了 182%、164%和630%。估计目前全国华支睾吸虫感染者达1200多万人。华支睾吸虫病是我国少数个别几个呈现上升趋势的寄生虫病之一，该病的防治工作已迫在眉睫。 [0005]在我国南方(如广东、广西)及部分北方地区(如东北3省的朝鲜族居住区)，当地人群有吃生的或未煮熟的淡水鱼肉的习惯，鱼肉中活的囊蝴被摄入人体，引起人的感染。这些地区居民虽知吃“鱼生”会感染本病，但饮食习惯一时难以改变。而且随着生活水平的提高，以往不吃或很少吃“鱼生”的人群也开始吃“鱼生”，现在生鱼片的风味吃法在非流行区，特别是大中城市也很盛行。同时由于市场开放，流行区含华支睾吸虫囊蝴的鱼运往各地，因此城镇居民感染华支睾吸虫的人数有增加的趋势。
[0006]华支睾吸虫成虫寄生于人或其它终宿主的肝胆管内，虫体的分泌/代谢产物及虫体本身的机械刺激，可引起胆管，特别是引起次级胆管的炎症反应，中度感染胆管可出现局限性扩张，胆管上皮增生、管壁增厚、管腔狭窄，如合并细菌感染，可引起胆管炎和胆管肝炎，周围纤维组织增生，晚期可发生肝硬化。有证据表明，华支睾吸虫感染可增加患者患胆管癌(CLG)的风险，华支睾吸虫感染相关性肝胆管肿瘤是华支睾吸虫病流行区一个重要的公共卫生问题。
[0007]为了快速诊断、及时治疗和有效控制华支睾吸虫病，需要特异、灵敏、简便的方法检测人群中华支睾吸虫的感染。
[0008]对于华支睾吸虫病人的诊断，传统的粪便检查仍是目前确诊华支睾吸虫病的主要方法。但由于患者依从性较差，且华支睾吸虫虫卵较小易于漏检，该方法有一定的缺陷。[0009]目前在现场防治工作中较广泛地应用了免疫诊断方法(主要是ELISA法)。但是仍存在一些问题:对健康人有不同程度的假阳性，对华支睾吸虫病人有一定的假阴性，对其它寄生虫(血吸虫、并殖吸虫)感染也有一定的交叉反应。Yong TS应用ELISA方法检测48例华支睾吸虫病人血清抗体，只有75%的阳性反应，但在28例正常对照和16例并殖吸虫病例中，分别出现了 7.1%和37.5%的假阳性。
[0010]已有研究资料表明一些寄生虫的排泄分泌抗原(ESA)或重组的ESA可应用于寄生虫病的血清学诊断。Kim SI用ESA来检测活动性华支睾吸虫病病人血清相应抗体动态反应，发现30kDa和7kDa区带与患者血清呈强阳性反应，而与吡喹酮治疗6个月后的病人血清反应较弱，其中7kDa区带未见与卫氏并殖吸虫病、横川后殖吸虫病、华支睾吸虫病患者痊愈后的血清起交叉反应，特异性比30kDa区带更强，据此认为7kDa抗原可作为活动性华支睾吸虫病的标志性诊断抗原。Min-Ho CHOI对华支睾吸虫的排泄分泌抗原(ESA)检测抗体的ELISA法和成虫粗抗原(CA)检测抗体的ELISA法的诊断价值进行了比较和评估。ESA检测抗体的ELISA法的特异性显著高于用CA检测抗体的ELISA法(前者特异性为93.1%，后者为87.8%)，表明ESA用于检测华支睾吸虫患者血清抗体优于粗抗原。因此，与华支睾吸虫的CA相比，ESA作为华支睾吸虫病的诊断抗原具有更高的特异性和敏感性。然而传统的虫源性抗原制备复杂，质量可控性较低，制备量有限，难以适应大规模查病的需求。
[0011]此外，由于该虫寄生于肝胆管这一特定的部位，决定了宿主血清中的抗原和抗体水平较低，难以检测(也是目前该病缺乏良好诊断试剂的原因)，但在粪样中却有ESA的存在。Yong TS等鉴定了与IgE抗体反应的华支睾吸虫抗原，发现28kDa的抗原与IgE反应最强，该蛋白也存在于粪便排泄物中。Sirisinha S等人用单克隆抗体ELISA (Monoclonalantibody ELISA, McAb-ELISA)检测麝猫后睾吸虫患者粪样中的抗原，能检测的抗原最低量为0.05ng-0.1ngo研究表明，检测患者粪样中的特异抗原，可提供早期诊断、现症患者确诊及疗效考核的依据。
[0012]而诊断抗体或抗原的特性决定着粪样和血清中抗原或血清抗体检测等免疫学方法的诊断效果。同时由于难以取得高纯度的特异抗原或大量的天然抗原，故使用分子生物学技术，构建特异性重组抗原的技术路线是寻找合适抗原的必由之路。
【发明内容】
:
[0013]本发明的目的在于提供三种华支睾吸虫的特异性抗原及其应用，所述的这三种华支睾吸虫的特异性抗原及其应用要解决现有技术诊断华支睾吸虫病的方法特异性和敏感性不高的技术问题。
[0014]本发明提供了一种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID N0:1所示核苷酸序列同源性达90%以上、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID N0:1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
[0015]本发明还提供了一种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白质，由上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列所编码、或者与上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列同源性达90%以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)的核苷酸序列所编码。
[0016]进一步的，上述分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、或者对SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
[0017]进一步的，上述分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、或者对SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
[0018]进一步的，上述分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、或者对SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
[0019]本发明还提供了一种抗体，特异性的结合上述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白。
[0020]进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。
[0021]本发明还提供了一种载体，含有上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs34)。
[0022]本发明还提供了一种宿主细胞，含有上述的载体，或者用上述的所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因(Cs34)转化或转染。
[0023]本发明还提供了一 种疫苗，含有上述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白、或者上述的抗体、或者上述的载体。
[0024]本发明还提供了上述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0025]本发明还提供了上述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0026]本发明还提供了上述的疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0027]本发明还提供了上述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0028]本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs34)蛋白、或者上述的抗体。
[0029]本发明还提供了第二种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs2)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、或者或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列同源性达90%以上的核苷酸序列、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
[0030]本发明还提供了第二种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白，由上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列所编码、或者与上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列同源性达90%以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)的核苷酸序列所编码。
[0031]进一步的，上述的分离的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、或者对SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
[0032]本发明还提供了第二种抗体，特异性的结合上述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白。
[0033]进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。
[0034]本发明还提供了第二种载体，含有上述的第二种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs2)。
[0035]进一步的，上述的载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
[0036]本发明还提供了第二种宿主细胞，含有上述的第二种载体，或者用上述的所述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因(Cs2)转化或转染。
[0037]本发明还提供了第二种疫苗，含有上述的第二种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白、或者第二种所述的抗体、或者上述的第二种载体。
[0038]本发明还提供了上述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2)蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0039]本发明还提供了上述的第二种抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0040]本发明还提供了上述的第二种疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0041]本发明还提供了上述的第二种载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0042]本发明还提供了第二种试剂盒，含有上述的第二种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs2 )蛋白、或者上述的第二种抗体。
[0043]本发明还提供了第三种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs3)，所述的抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示、或者或者所述的抗原基因的核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列同源性达90%以上的核苷酸序列、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
[0044]本发明还提供了第三种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白，由上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列所编码、或者与上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列同源性达90%以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的上述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)的核苷酸序列所编码。
[0045]进一步的，上述第三种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、或者对SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
[0046]本发明还提供了第三种抗体，特异性的结合上述的第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白。
[0047]进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。
[0048]本发明还提供了第三种载体，含有上述的第三种华支睾吸虫的特异性抗原基因(Cs3)。[0049]进一步的，上述的第三种载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0050]本发明还提供了第三种宿主细胞，含有上述的第三种载体，或者用上述的第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因(Cs3)转化或转染。
[0051]本发明还提供了第三种疫苗，含有上述的第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs3 )蛋白、或者上述的第三种抗体、或者第三种载体。
[0052]本发明还提供了第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0053]本发明还提供了第三种上述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0054]本发明还提供了第三种上述疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0055]本发明还提供了第三种上述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
[0056]本发明还提供了第三种一种试剂盒，含有上述的第三种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原(Cs3)蛋白、或者上述的第三种抗体。
[0057]本文中的术语“表达载体”，是指本领域中常用的细菌质粒、酵母质粒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体)、在哺乳动物细胞中表达用的载体(逆转录病毒载体、腺病毒载体等)。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。
[0058]本发明的宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于:氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，脂质体包裹、电融合法用于哺乳动物细胞等真核细胞。
[0059]本发明的宿主细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于:裂菌，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱，反向色谱，以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。
[0060]通过对本发明人构建的华支睾吸虫成虫cDNA表达文库，用采自广西壮族自治区的华支睾吸虫病人混合血清，使用免疫筛选法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库。共获得51个阳性克隆，有44个克隆完成测序。发现其中3例蛋白氨基酸序列中含有特异性KPPMPGDRDA或QPPMPGGRDA重复串列序列，因均含有PPMP序列特征，故命名为华支睾吸虫PPMP型抗原。并将含有KPPMPGDRDA重复串列序列的该类抗原称为PPMP I型抗原，含有QPPMPGGRDA重复串列序列的则称为PPMP II型抗原。经同源性比较，本发明的华支睾吸虫PPMP型抗原是迄今为止还没有公开的华支睾吸虫新颖的特异性抗原。但与华支睾吸虫的GRA (富甘氨酸蛋白)、Glycine rich antigen2 (富甘氨酸蛋白2)、PRA (富脯氨酸蛋白)和PRA2 (富脯氨酸蛋白2)等有较高的同源性。通过华支睾吸虫抗原PPMP I型抗原Cs2抗原和PPMP II型抗原Cs3抗原的表达纯化，已进一步建立了高特异性和敏感性的华支睾吸虫病诊断初步方法；并易制备多/单克隆抗体，可应用华支睾吸虫病的科研和防治等不同方面。本发明的试剂盒还可以用来检测华支睾吸虫病。
【专利附图】
【附图说明】:
[0061]图1、图2是华支睾吸虫PPMP型抗原基因Alignment分析结果。图中1_3号序列为本发明人获得的华支睾吸虫PPMP型抗原基因Cs34、Cs2和Cs3的氨基酸序列，GRA为Glycine rich antigen 序列，GRA2 为 Glycine rich antigen2 序列，PRA 为 Proline richantigen序列(注:本发明人对原序列中不正确的编码进行了修正)，PRA2为Proline richantigen2 序列。[0062]图3是将Cs34抗原全长氨基酸序列传送至SignalP 3.0 Server (网址:http://WWW.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),使用神经网络法(NN)进行在线信号肽剪切位点分析图。
[0063]图4将Cs34抗原全长氨基酸序列传送至SignalP 3.0 Server(网址:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),使用隐马可夫模型(HMM)进行在线信号肽剪切位点分析图。
[0064]图5是pBluescript SK_Cs2噬菌粒EcoRI/XhoI双酶切I %的琼脂糖凝胶电泳图，M:DNA Marker ；1:pBluescript SK_Cs2 质粒 EcoRI/XhoI 双酶切结果(755bp)。
[0065]图6是pET28b质粒EcoRI/XhoI双酶切的I %的琼脂糖凝胶电泳图，M =DNAMarker ；I:pET28b 质粒 Ncol/Xhol 双酶切结果。
[0066]图7是pBluescript SK_Cs3噬菌粒和pET28b质粒EcoRI/XhoI双酶切的I %的琼脂糖凝胶电泳图，M:DNA Marker ；1:pET28b 质粒 Ncol/Xhol 双酶切结果。2:pBluescriptSK_Cs3 质粒 EcoRI/XhoI 双酶切结果(1157bp)。
[0067]图8是pET28b_Cs2[BLR(DE3)宿主菌]重组蛋白表达鉴定12%的聚丙烯胺凝胶电泳图，M =Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；N1:pET28b_Cs2 未诱导；1:pET28b_Cs2 诱导；S:诱导上清；P:诱导沉淀。
[0068]图9是pET28b-Cs3[BLR(DE3)pLysS宿主菌]重组蛋白表达鉴定12%的聚丙烯胺凝胶电泳图，M:Protein Marker (FERMENTAS MBI)；N1:pET28b_Cs3 未诱导；1:pET28b_Cs3诱导；S:诱导上清；P:诱导沉淀。
[0069]图10是pET28b_Cs2[BLR(DE3)宿主菌]可溶性蛋白纯化12%聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M:Protein marker ；1:Ni_NTA纯化流出液(含IOmM咪唑);2_3:含20mM咪唑洗漆液管
4、6 ；4-9:含50mM咪唑洗脱液1-6管；9_11:含IOOmM咪唑洗脱液1-3管；12-14:含250mM咪唑洗脱液1-3管，其中，pET28b-Cs2可溶性蛋白集中在含50mM-100mM咪唑的洗脱液中。
[0070]图11是pET28b-CS3[BLR(DE3)pLySS宿主菌]可溶性蛋白纯化12%聚丙烯酰胺凝胶电泳图，M:Protein marker ；1:N1-NTA纯化流出液(含IOmM咪唑)；2_3:含20mM咪唑洗涤液管4、6 ；4-9:含50mM咪唑洗脱液1-6管；10-12:含IOOmM咪唑洗脱液1-3管；13-14:含250mM咪唑洗脱液1-2管，其中，pET28b_Cs3可溶性蛋白集中在含50mM-100mM咪唑的洗脱液中。
[0071]图12是pET28b_CS2可溶性纯化蛋白ELISA法检测各类血清抗体散点图。
[0072]图13是pET28b_CS3可溶性纯化蛋白ELISA法检测各类血清抗体散点图。
[0073]为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了，而这些等价修改，均应属于本发明所限定的范围。
【具体实施方式】:
[0074]以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》，2002年，科学出版社)所述方法进行。
[0075]实施例1华支睾吸虫成虫cDNA文库的构建
[0076]用采自广西壮族自治区的华支睾吸虫囊蝴，通过灌胃法感染猫5只。40天后，检查粪便虫卵，然后剖杀，收集华支睾吸虫成虫，用灭菌的生理盐水冲洗干净，液氮保存。
[0077]利用TRIzol (GIBC0/BRL公司)试剂盒抽提华支睾吸虫成虫(I克华支睾吸虫成虫压积，液氮保存)的总RNA。
[0078]采用mRN A 纯化试剂盒(mRNA Purification Kit, Amersham 公司)，从提取的总 RNA中纯化mRNA。具体步骤见产品说明书。
[0079]华支睾吸虫成虫cDNA文库采用定向克隆法，利用ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene公司)构建。参照试剂盒说明书操作，主要过程包括:
[0080]1.cDNA第一链的合成，应用含有Xho I内切酶位点的多聚T引物，为了使cDNA第一链在合成过程中不受限制性内切酶的破坏，用5 —甲基dCTP替代dNTP中的dCTP，使合成的DNA半甲基化，从而在Xho I消化cDNA时，只有位于多聚T引物内的非甲基化位点可被裂解；
[0081]2.cDNA第二链的合成，由RNase H消化第一链合成产物mRNA_DNA杂合体中的RNA，产生的cDNA片段作为引物在DNA聚合酶I作用下合成第二链；
[0082]3.用Pfu DNA聚合酶将合成的双链cDNA的末端补平，之后在补平的双链DNA的5’端加上含有EcoR I酶切位点的接头(adaptor),并使接头磷酸化；
[0083]4.用限制性内切酶Xho I消化，消化后的双链DNA通过S印harose CL-2B凝胶柱层析，进行分级分离，去除游离接头；
[0084]5.将分离后的DNA片段合并浓缩，连接到Un1-ZAP XR载体上；
[0085]6.最后用包装抽提液(Gigapack III Gold Packing Extract, Stratagene)包装曬菌体蛋白外壳。
[0086]华支睾吸虫成虫cDNA文库构建完成后，进一步对文库容量及插入片段平均长度等进行检测。
[0087]检测计算结果，华支睾吸虫成虫cDNA文库的容量为1.43X 106pfu/ml。
[0088]从文库中随机挑取16个重组克隆进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物鉴定。重组克隆扩增片段长度范围在0.6kb~2kb。平均插入片段长度为1.lkb。
[0089]重组插入率为99.6 %。[0090]实施例2 cDNA文库的免疫筛选
[0091]噬菌体感染:
[0092]取XLl-blue MRF'菌液200 μ I与适量cDNA文库噬菌体液混合(根据文库滴度预先确定，约3000噬菌斑/每板)，37°C温育15分钟后，加入3ml 48°C的上层琼脂(top agar)混匀，立即铺于NZY培养基平板上。室温下凝固10分钟，于42°C孵育。
[0093]融合蛋白的诱导表达:
[0094]观察到噬菌斑出现后(约3.5小时)，用经IPTG(15mM/L)浸泡30分钟的硝酸纤维素膜(Hybond-C extra, Amersham, NC)覆盖平板，于37°C再培育3.5小时；取出平板4°C冷却15分钟，然后用针在膜以及板上做上标记。将膜取下置于TBST中洗3次，每次10分钟，然后浸于NC膜浸在封闭液中，室温,轻微振荡,封闭过夜。
[0095]将NC膜从封闭液中取出，用TBST洗膜2次，每次5分钟。加入华支睾吸虫病人混合血清(采自广西壮族自治区)5ml/膜，室温下轻微振荡3小时。再用TBST洗膜3次，每次10分钟。加入二抗(5ml/膜)即羊抗人碱性磷酸酶结合物(AP-GAH，B10-RAD, I: 3000稀释)室温下反应I小时，用TBST洗膜3次，每次10分钟，用TBS洗膜2次，每次5分钟，洗去残留的 Tween20。
[0096]将NC膜从TBS中取出，用Whatman 3MM的滤纸吸干多余的溶液,放入AP buffer浸泡NC膜3分钟。
[0097]用Color Development Solution 稀释 NBT 至终浓度 0.3mg/ml, BCIP 终浓度为
0.15mg/ml (BCIP应逐滴加入已稀释的NBT中，防止沉淀形成。)，配制成NBT-BCIP显色液。将NC膜浸入NBT-BCIP显色液中，在暗处进行显色反应直到阳性斑点清晰可见。终止显色反应。
[0098]根据NC膜上阳性斑点在原培养板上的相应位置，挑取阳性噬菌斑，再经过复筛、三筛使得阳性噬菌体单克隆化。
[0099]实施例3噬菌体删除环化为pBluescript SK_噬菌粒及提取噬菌粒
[0100]E.coli XLl-blue MRF'于 LB 培养基(含有 IOmM MgS04，0.2%麦芽糖，15 μ g/mlTet)中培养过夜。次日，取培养液100 μ I转接到新的LB培养基中，37°C，200rpm振荡培养约2小时。培养液经2000g，离心10分钟，沉淀细菌，用IOmM MgS04重悬至OD6tltl = 1.0。在细菌培养管中加入200 μ I E.coli XLl-blue MRF'重悬液、50 μ I含有阳性噬菌体的SMbuffer和I μ I辅助噬菌体。将细菌培养管放置于37°C水浴中15分钟。然后加入3ml LB,于37°C振荡培养5小时。取出细菌培养管，在65°C加热20分钟，然后3 000g，离心15分钟，将上清转入一个新离心管中，置于4°C保存。
[0101]SOLR菌于LB培养基(含有IOmM MgS04, 50 μ g/ml Kan)中振荡培养，然后2 000g,离心10分钟，用IOmM MgS04重悬至OD600 = 1.0，在1.5ml Ep离心管中加入200 μ I SOLR和上述制备的上清保存液I μ 1，在37°C温育15分钟，然后取出25 μ I均匀涂布于LB (含100 μ g/ml Amp)琼脂平板上，37°C倒置培养过夜。
[0102]培养基上生长的菌落，即为含华支睾吸虫cDNA插入片段的pBluescript SK_噬菌粒的SOLR菌落。
[0103]使用AxyPr印质粒DNA小量试剂盒[爱思进生物技术(杭州)有限公司]提取pBluescript SK_ 卩遼菌粒。[0104]实施例4华支睾吸虫PPMP型抗原基因的分离
[0105]筛选获得的阳性克隆,经删除环化为pBluescript SK_质粒。由上海Invitrogen公司测序，共得到3个华支睾吸虫PPMP型抗原基因的部分mRNA(cDNA)序列。分别是华支睾吸虫Cs34、Cs2和Cs3基因，插入片段长度分别为1044、734和1136个碱基。
[0106]华支睾吸虫Cs34基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO:1所示。
[0107]华支睾吸虫Cs2基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO:2所示。
[0108]华支睾吸虫Cs3基因的mRNA(cDNA)序列如SEQ ID NO:3所示。
[0109]Cs34、Cs2和Cs3克隆中插入的cDNA片段推导的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示，Cs34、Cs2和Cs3蛋白分别含265、157和284个氨基酸。
[0110]华支睾吸虫Cs34基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0111]华支睾吸虫Cs2基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0112]华支睾吸虫Cs3基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0113]实施例5华支睾吸虫Cs34抗原同源性比较
[0114]使用Blastp对GenBank中nr库进行同源性比较,结果如下:
[0115]
【权利要求】
1.一种华支睾吸虫特异性PPMP型抗原，其特征在于:所述的抗原基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示、或者所述的抗原基因核苷酸序列与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列同源性达90%以上、或者其部分经过取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
2.一种分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于:由权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码、或者与权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列同源性达90%以上的核苷酸序列所编码、或者由部分经过取代、缺失或者添加后的权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因的核苷酸序列所编码。
3.如权利要求2所述的分离的华支睾吸虫特异性PPMP型抗原蛋白，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示、或者对SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸后的由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
4.一种抗体，其特征在于:特异性的结合权利要求2所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求3所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白。
5.如权利要求4所述的一种抗体，其特征在于:所述的抗体为单克隆抗体。
6.一种载体，其特征在于:含有权利要求1所述的一种华支睾吸虫的特异性抗原基因。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0:10所示。
8.一种宿主细胞，其特征在于:含有权利要求6所述的载体，或者所述的细胞用权利要求I所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原基因转化或转染。
9.一种疫苗，其特征在于:含有权利要求2所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求3所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求4所述的抗体、或者权利要求6所述的载体。
10.权利要求2或者权利要求3所述的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
11.权利要求4所述的抗体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
12.权利要求5所述的载体在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
13.权利要求9所述的疫苗在制备治疗、诊断或者预防华支睾吸虫病的药物中的应用。
14.一种试剂盒，其特征在于:含有权利要求2所述的一种分离的华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求3所述的分离的一种华支睾吸虫的特异性PPMP型抗原蛋白、或者权利要求4所述的抗体。
【文档编号】A61K39/00GK103897051SQ201410068195
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2010年5月19日 优先权日:2010年5月19日
【发明者】许学年, 周岩, 董玉婷, 包意芳, 徐斌, 冯正 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所