专利名称：优先抑制促炎细胞因子的释放的制作方法
相关申请本申请要求在2004年3月15日提出的美国临时申请号60/553,302的优先权，该临时申请的内容通过参考结合于此。
背景技术：
细胞因子是独特的生长因子家族。它们起协调炎症信号传导的内源介质的作用(Romagnani S.，Ann Allergy Asthma Immunol.2000，859-21)。
主要由激活的巨噬细胞产生的促炎细胞因子(Pro-inflammatorycytokines)(例如TNF-α和白细胞介素1β，2，和8)引发对外源病原体的炎症反应。然而，它们的过量生产对活器官有害。抗炎细胞因子(例如白细胞介素4和10)停止或削弱炎症发展以便保持活器官的功能(Taniguchi等，Crit.Care Med.1999，271262-1264；和Kasai等，Res.Commun.Mol.Pathol. Pharmacol.1997，9834-4220)。
通过复杂机制严格调节促炎细胞因子和抗炎细胞因子的生产。两种细胞因子的不平衡生产导致许多疾病，例如关节炎，肾病，骨异常，哮喘，癌症，脓毒病，神经变性，嗜中性牙槽炎，肝炎，局部缺血/再灌注，和炎性肠病(Taniguchi等，Crit.Care Med.1999，271262-1264；和Kasai等，Re，s Commun.Mol.Pathol.Pharmacol.1997，9834-42)。
NF-κB是调节细胞因子释放的转录因子并且在调节炎症反应中发挥关键作用。它是治疗疾病的潜在靶标，所述疾病如类风湿性关节炎，炎性肠病，多发性硬化，银屑病，哮喘，脓毒性休克，自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮)，神经变性，动脉粥样硬化，瘤形成，毛细血管扩张性共济失调，肺病(例如ARDS，系统性炎症反应综合征，呼吸道病毒感染，职业性和环境性肺病，囊性纤维化，特发性肺纤维化，原发性肺动脉高压)，HIV，和流感(Kristman JW.，等.，Chest 2000，1171482-1487；和Baldwin，AS.Jr.，Annu.Rev.Immunol.1996，14649-683)。
发明内容
发明概述本发明基于意外的发现，即相对于抗炎细胞因子，稠合吡唑基化合物优先抑制促炎细胞因子的释放，该化合物还抑制NF-κB的活性。
因此，本发明一方面涉及在受试者中相对于一种或多种抗炎细胞因子的释放，优先抑制四种或更多种促炎细胞因子的释放的方法。该方法包括向受试者施用有效量的一种或多种式(I)的稠合吡唑基化合物 其中A是R或 (也称为“(CH2)nAr3(R5)(R6)”)， 其中R是H，烷基，芳基，环基(cyclyl)，杂芳基，或杂环基；Ar1、Ar2和Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为R’，硝基，卤素，-C(O)-OR’，-C(O)-SR’，-C(O)-NR’R”，-(CH2)mOR’，-(CH2)mSR’，-(CH2)mNR’R”，-(CH2)mCN，-(CH2)mC(O)-OR’，-(CH2)mC(O)H，或者R1和R2一起，R3和R4一起，或R5和R6一起为-O(CH2)mO-，其中R’和R”各自独立地为H，烷基，环基，芳基，杂芳基，杂环基；m为0，1，2，3，4，5，或6；n为1，2，或3。
参照式(I)，稠合吡唑基化合物的一个亚类是其中Ar2是5’-呋喃基和A是(CH2)nAr3(R5)(R6)的那些。在一些化合物中，Ar1是噻吩基或苯基，Ar3是苯基，n是1，或者R3是CH2OH或CO2H并且在呋喃基的2位上被取代。
稠合吡唑基化合物的另一亚类是其中Ar2是5’-呋喃基和A是H的那些。在一些化合物中，R3是CO2CH3并且在呋喃基的2位上被取代，Ar1是苯基，或者R1和R2各自为H。
在上述方法的优选实施方案中，在受试者中相对于两种或多种抗炎细胞因子的释放，稠合吡唑基化合物优先抑制五种或更多种促炎细胞因子的释放。促炎细胞因子可以是白细胞介素1β，白细胞介素6，白细胞介素8，干扰素γ和TNF-α；抗炎细胞因子可以是白细胞介素4和白细胞介素10。
本发明另一方面涉及通过向受试者施用有效量的一种或多种稠合吡唑基化合物来抑制NF-κB活性的方法。
作为相对于抗炎细胞因子优先抑制促炎细胞因子和抑制NF-κB活性的式(I)的化合物，它们有效治疗与促炎和抗炎细胞因子的不平衡生产和过度的NF-κB活性有关的疾病。
本文中术语“烷基”是指直链或支链烃，含有1-10个碳原子。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
术语“芳基”是指6-碳单环、10-碳双环、1，4-碳三环芳环系统，其中每个环可以含有1-4个取代基。芳基的实例包括但不限于苯基，萘基和蒽基。
术语“环基”是指饱和和部分不饱和的含有3-12个碳原子的环状烃基。环基的实例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环戊烯基，环己基，环己烯基，环庚基，和环辛基。
术语“杂芳基”是指芳族5-8元单环，8-12元双环，或11-14元三环环系统，含有一个或多个杂原子(如O，N，或S)。杂环基的实例包括吡啶基，呋喃基，咪唑基，苯并咪唑基，嘧啶基，噻吩基，喹啉基，吲哚基，和噻唑基。术语“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。
术语“杂环基”是指非芳族5-8元单环，8-12元双环，或11-14元三环环系统，含有一个或多个杂原子(如O，N，或S)。杂环基的实例包括但不限于哌嗪基，吡咯烷基，二噁烷基，吗啉基，和四氢呋喃基。
本文提及的烷基、环基、杂环基和芳基包括饱和和不饱和的部分。取代基的实例包括但不限于卤素，羟基，酰氨基，氰基，硝基，巯基，烷氧羰基，氨基，羧基，烷磺酰基，烷基羰基，脲基，氨基甲酰基，羧基，硫脲基，氰硫基，亚磺酰氨基，烷基，链烯基，炔基，烷氧基，芳基，杂芳基，环基，杂环基，其中烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基环基和杂环基可以被进一步取代。
以下列举的是可以用于实施本发明方法的稠合吡唑基化合物的实例 化合物1 化合物2 化合物3 化合物4 化合物5 化合物6 化合物7 化合物8 化合物9如果适用的话，上述稠合吡唑基化合物包括化合物本身，以及它们的盐和它们的前药。这种盐例如可以在稠合吡唑基化合物上的带负电的取代基(例如羧酸根(carboxylate))和阳离子之间形成。适当的阳离子包括但不限于钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，和铵阳离子如四甲基铵离子。同样，带正电的取代基(例如铵)可以与带负电的抗衡离子形成盐。适当的抗衡离子包括但不限于氯，溴，碘，硫酸根，硝酸根，磷酸根，或乙酸根。前药的实例包括酯和其它药用衍生物，其在给药于受试者后能够提供上述稠合吡唑基化合物(参见Goodman和Gilman’s，The Pharmacological basisof Therapeutics，8thed.，McGraw-Hill，Int.Ed.1992，“Biotransformation ofDrugs”)。
本发明的其它特征、目的和优势将从说明书和附图
以及从权利要求中变得明显。
发明详述通过本领域技术人员公知的方法可以制备在“发明概述”部分中描述的任何稠合吡唑基化合物(参见例如美国专利号5,574,168和美国专利6,162,819)。它们包括下列合成路线。
首先通过将芳基碳酰氯与另一芳基化合物偶联制备芳基芳基酮。任一芳基化合物任选地是被单取代或多取代。酮然后与芳基烷基肼(或烷基肼，肼)反应，其芳基还可以任选地被单取代或多取代，以形成带有三个(或两个)芳基的腙。腙基团通过亚烷基连接基转化为稠合吡唑基核，另一芳基在吡唑基核的4-C和5-C上稠合，第三个芳基直接与吡唑基核的3-C连接。通过修饰任何芳基上的取代基可以获得稠合吡唑基化合物的衍生物。
用于上述合成路线中的化学物质可以包括例如溶剂，试剂，催化剂，和保护基和脱保护基。上述方法还可以在本文具体描述的步骤之前或之后另外包括如下步骤加入或去除适当的保护基，以便最终允许合成稠合吡唑基化合物。另外，可以以可选择的顺序进行各种合成步骤以便提供所需化合物。用于合成适用的稠合吡唑基化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和脱保护)在本领域已知，包括例如在以下各项中描述的那些及其随后版本R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，3rdEd.，John Wiley & Sons(1999)；L. Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley & Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley & Sons(1995)。
如此合成的稠合吡唑基化合物可以进一步通过快速柱色谱法、高效液相色谱法或结晶纯化。
本发明特征在于一种相对于抗炎细胞因子优先抑制促炎细胞因子的方法。该方法包括向需要其的受试者施用有效量的一种或多种上述稠合吡唑基化合物和药用载体。本文所用的术语“相对于抗炎细胞因子的释放优先抑制促炎细胞因子的释放”是指化合物抑制促炎细胞因子的释放的速率是相同化合物抑制抗炎细胞因子的释放的速率的至少3倍。“有效量”是稠合吡唑基化合物的量，要求它在向需要其的受试者给药后在受试者中赋予上述抑制作用。如本领域技术人员所认识，有效量可以根据给药途径、赋形剂使用、和与其它试剂共同使用的可能性而变化。
本发明特征还在于一种抑制NF-κB的活性的方法。该方法包括向需要其的受试者施用有效量的一种或多种上述稠合吡唑基化合物和药用载体。
为了实施本发明的方法，稠合吡唑基化合物可以口服给药，肠胃外给药，吸入喷雾给药或通过植入贮库给药。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内的、损害部位内的、和颅内注射或输注技术。
用于口服给药的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括但不限于片剂、胶囊、乳剂和含水混悬剂、分散体和溶液。常用片剂载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂如硬脂酸镁，也被典型地加入片剂。对于胶囊剂型的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当口服施用含水混悬剂或乳剂时，活性成分可以悬浮或溶解在组合有乳化剂或悬浮剂的油相中。如果需要，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
按照本领域公知技术，使用适当的分散或湿润剂(如例如吐温80)和混悬剂可以配制无菌注射组合物(例如含水或含油混悬剂)。无菌注射制剂还可以是在非毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如，作为1，3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受载体和溶剂中有甘露醇，水，林格(Ringer)溶液和等渗氯化钠溶液。另外，将无菌固定油常规用作溶剂或混悬介质(例如合成的一或二甘油酯)。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物用于制备注射剂，因为它们是天然药用油，如橄榄油或蓖麻油，特别是以它们聚氧乙烯化的形式。这些油溶液或混悬剂还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂。
使用苯甲醇或其它适当防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或其它本领域已知的加溶剂或分散剂，按照药物制剂领域公知的技术可以制备吸入剂组合物，可以制备成盐水中的溶液。
药物组合物中的载体必须是在与制剂的活性成分相容(优选能够使它稳定)和对治疗的受试者无害的意义上“可接受的”。例如，可以将增溶剂如环糊精(与稠合吡唑基化合物形成特定的更可溶性的复合体)用作传递稠合吡唑基化合物的药用赋形剂。其它载体的实例包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、十二烷基硫酸钠、和D&C Yellow#10。
可以使用适当的体外测定来初步评估稠合吡唑基化合物在人外周血单核白细胞中相对于抗炎细胞因子优先抑制促炎细胞因子和抑制NF-κB的活性方面的功效。还可以按照本领域公知的方法进行体内筛选。例如，将稠合吡唑基化合物施用于动物模型(例如小鼠)和回收血液以评估各种细胞因子的水平。基于这些结果，还可以确定适当的剂量范围和给药途径。
没有进一步的详细阐明，认为以上描述已经充分地能够实施本发明。因此下列具体的实例应当认为仅是举例说明性的，并不是以任何方式限制其余的公开内容。本文引用的所有出版物，包括专利，由此通过参考完整地结合于此。
实施例13-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-1-苄基-吲唑(化合物1)的合成(a)5-甲氧羰基-2-呋喃基苯基酮的合成将无水氯化铁(0.42g，2.6mmol)和苯甲酰氯(29.6g，0.21mol)溶解在CCl4(40mL)中并在10分钟内滴加2-糠酸甲酯(25.2g，0.20mol)。然后在回流下加热反应混合物36小时，在冷却后加入水(120mL)。搅拌混合物1小时，然后允许静置直至它分成两层。用氯仿萃取水层和沉淀。用无水硫酸镁干燥氯仿提取物，然后过滤。减压下去除滤液的溶剂；从异丙醇中重结晶残渣以提供28.4g 5-甲氧羰基-2-呋喃基苯基酮，产率为65.0％。
mp70-73℃。
MS(％)，m/z230(M+)。
IR(KBr)γmax1720，1650cm-1(C＝O)。
1H-NMR(CDCl3，200MHz)δ3.86(3H，s，-CH3)，7.26-7.32(2H，m，H-3’，5’)，7.40-7.65(3H，m，H-3，4，4’)，和8.05-8.10(2H，m，H-2’，6’)。
b)1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)吲唑的合成将5-甲氧羰基-2-呋喃基苯基酮(5.5g，0.024mol)溶解在甲醇(60mL)中，加入苄基肼(9g，0.07mol)和乙酸(0.5mL)，然后在回流下加热直至反应完成。在冷却后，蒸发溶剂。用氯仿萃取产生的残渣，用稀HCl溶液然后水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥并过滤。去除滤液的溶剂以提供5-甲氧羰基呋喃基苯基酮苯甲酰基腙。
将如此获得的二氯甲烷(100mL)中的腙溶液滴加到Pb(OAc)4(28.2g，0.06mol)在二氯甲烷(400mL)中的溶液。加入后，允许混合物在30±2℃下反应30分钟，然后加入BF3·Et2O(含有47％BF3，122mL)。将混合物在回流下加热30分钟，然后倒入冰水(1000mL)中以终止反应。分离有机层并顺序用水和10％碳酸钠溶液洗涤，然后通过水洗中和。通过无水硫酸镁干燥并真空浓缩成油性粗产物。然后将乙醇加入粗产物，通过冰冻过夜允许混合物沉淀。收集固体沉淀并从乙醇中重结晶，产生3.7g 1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)吲唑，产率为47.0％。
mp117-118℃。
MS(％)，m/z332(M+)。
IR(KBr)γmax1720cm-1(C＝O)。
1H-NMR(CDCl3)δ3.95(3H，s，CH3)，5.66(2H，s，＝NCH2-)，7.02(1H，d，J＝3.5Hz，H-3’)，7.20-7.40(9H.m，H-5，6，7，4’，苯基)，和8.26(1H，dd，J＝8.1，1.5Hz，H-4)。
(c)3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-1-苄基-吲唑的合成首先通过在无水THF(20mL)中搅拌氯化钙(88.8mg，0.8mmol)和硼氢化钠(60mg，1.6mmol)4小时制备硼氢化钙。然后在30±2℃下向硼氢化钙溶液中滴加含有88.0mg 1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-吲唑(0.27mmol)的30mL THF溶液。回流下加热混合物6小时，冷却，淬灭在碎冰中，减压放置以去除THF，过滤获得固体产物。用二氯甲烷萃取固体。将萃取物浓缩成50mL，在加入石油醚后沉淀固体。收集沉淀并通过柱色谱法(硅胶-苯)纯化以获得70.0mg 1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-吲唑，产率为87％。
mp108-109℃。
MS(％)，m/z304(M+)。
IR(KBr)λmax3350cm-1(-OH)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4’)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3’)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H.dd，J＝8.2. 1.0Hz.C4-H)。
实施例21-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-6-氟代吲唑(化合物2)的合成如实施例(a)制备4’-氟苯基5-甲氧羰基-2-呋喃酮(5.96g，24mmol)并用作原材料，按照实施例1(b)的方法获得4.1g 1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-6-氟代吲唑，产率为48.8％。
mp108-109℃。
MS(％)，m/z350(M+)。
IR(KBr)γmax1710cm-1(C＝O)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ3.87(3H，s，-CH3)，5.73(2H，s，＝NCH2-)，7.18-7.37(7H，m，H-5，3’，苯基)，7.45(1H，d，J＝3.5Hz，H-4)，7.77(1H，dd，J＝10.0，1.5Hz，C7-H)，和8.17(1H.dd，J＝8.0，6.3Hz，C4-H)。
实施例31-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-6-氟代吲唑(化合物3)的合成将1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-6-氟代吲唑(93mg，0.27mmol)用作原材料，并按照实施例1(c)所述步骤处理，获得75.0mg 1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-6-氟代吲唑，产率为88.0％。
mp110-112℃。
MS(％)，m/z；322(M+)。
IR(KBr)γmax3450cm-1(-OH)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.49(2H，br，-CH2O-)，5.45(1H，br，-OH)，5.88(1H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.2Hz，H-4’)，6.98(1H，d，J＝3.2Hz，H-3’)，7.10-7.18(1H，m，H-7)，7.24-7.36(5H，m，苯基-H)，7.70(1H，dd，J＝10.0，2.0Hz，C5-H)，和8.15(1H，dd，J＝8.5，5.1Hz，H-4)。
实施例41-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-6-甲基吲唑(化合物7)的合成将1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)-6-甲基吲唑(92mg.0.27mmol)用作原材料并按照实施例1(c)所述步骤处理，获得74.0mg 1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-6-甲基吲唑，产率为88％。
mp112-114℃。
MS(％)，m/z318(M+)。
IR(KBr)γmax3400cm-1(-OH)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ2.44(3H，s，-CH3)，4.50(2H，d.J＝5.2Hz，-CH2O-)，5.30(1H，br，-OH)，5.64(2H，s，＝NCH2-)，6.45(1H，d，J＝3.3Hz，H-4’)，6.07(1H，d，J＝3.3Hz，H-3’)，7.08(1H，dd，J＝8.3，1.0Hz，H-5)，7.19-7.36(5H，m，苯基-H)，7.57(1H，d，J＝1.0Hz，H-7)，和7.98(1H，dd，J＝8.3，1.0Hz，H-4)。
实施例51-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)噻吩并[3，2-c]吡唑(化合物6)的合成(a)5-甲氧羰基-2-呋喃基2’-噻吩基酮的合成按照实施例1所述方法让2-噻吩碳酰氯(30.5g，0.21mol)、2-糠酸甲酯(24g，0.19mol)和无水氯化铁(0.42g，2.6mmol)反应，获得28.7g 5-甲氧羰基-2-呋喃基2’-噻吩基酮，产率为63.8％。
mp103-106℃。
MS(％)，m/z236(M+)。
IR(KBr)γmax1720，1620cm-1(C＝O)。
1H-NMR(CDCl3，200MHz)δ3.98(3H，s，-CH3)，7.22-7.31(2H，m，H-3，4)，7.41(1H，d，J＝3.5Hz，H-4’)，7.76(1H，d，J＝3.5Hz，H-3’)，和8.36(1H，d，J＝4.5Hz，H-5)。
(b)1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)噻吩并[3，2-c]吡唑的合成将5-甲氧羰基-2-呋喃基2’-噻吩基酮(5.7g，0.024mol)用作原材料并按照与实施例1所述相同的方法处理，获得1.2g 1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)噻吩并[3，2-c]吡唑，产率为14.8％。
mp142-143℃。
MS(％)，m/z338(M+)。
IR(KBr)γmax1720cm-1(C＝O)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ3.85(3H，s，-CH3)，5.62(2H，s，＝NCH2-)，6.92(1H，d，J＝3.5Hz，H-3’)，7.24(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，7.26-7.35(5H，m，苯基-H)，7.43(1H，d，J＝3.5Hz，H-4’)，和7.77(1H，dd，J＝4.8，1.5Hz，H-5)。
(c)标题化合物的合成按照实施例11所述的方法处理1-苄基-3-(5’-甲氧羰基-2’-呋喃基)噻吩并[3，2-c]吡唑(90mg，0.27mol)，获得63.4mg 1-苄基-3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)噻吩并[3，2-c]吡唑，产率为69.3％。
mp103-104℃。
MS(％)，m/z310(M+)。
IR(KBr)γmax3360cm-1(-OH)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.46(2H，d，J＝5.3Hz，-CH2O-)，5.27(1H，t，J＝5.3Hz，-OH)，5.55(2H，s，＝NCH2-)，6.43(1H，d，J＝3.2Hz，H-4’)，6.64(1H，d，J＝3.2Hz，H-3’)，7.20(1H，d，J＝4.8Hz，H-6)，7.27-7.35(5H，m，苯基-H)，和7.72(1H.d，J＝4.8Hz，H-5)。
实施例6生物学测定体外测定从健康人志愿者获得约450ml血液并用RPMI1640培养基稀释。使用Ficoll梯度(MSL；Eurobio，les Ulis，France)来分离人外周血单核白细胞(PBMC)。血液、RPMI1640培养基和MSL的体积比为2∶4∶1。通过在500g下15℃离心稀释的血液20分钟获得PBMC，用RPMI1640洗涤一次。将细胞沉淀在相同培养基中重悬浮，终浓度为6×106个细胞/ml，所述培养基中补充有5％热失活的正常人血清(来自健康志愿者的血清库)和抗生素(青霉素100UI/ml和链霉素100μg/ml)。将500μl细胞悬浮液等分试样分配至24-孔平板的每孔中，并在加湿的气氛中在5％CO2-95％空气恒温箱中37℃温育。向孔中仅加入来自光滑大肠杆菌0111B4脂多糖(LPS，25μg/ml)或一起加入LPS和化合物1(10μM)。在24小时后，收集上清液，在400g下15℃离心10分钟，贮存在-20℃。使用由R & DSystems(Abingdon，UK)制造的商业试剂盒测定细胞因子。按照制造商的使用说明使用内标测定细胞因子的浓度。
结果显示化合物1抑制促炎细胞因子的释放比抑制抗炎细胞因子的释放有效地多。更具体地，化合物1对TNF-α和白细胞介素1β和8的释放产生大于80％的抑制，和对白细胞介素-2和干扰素-γ的释放产生大于30％的抑制。相比之下，它对抗炎细胞因子(白细胞介素4和10)的释放产生小于10％的抑制。
体内测定用LPS(60mg/kg)腹膜内注射小鼠(25-30g，ICR品系)。它们中大多数用0.5％羧甲基纤维素中的化合物1(10mg/kg)口服治疗，其余的(对照小鼠)用载体口服治疗。对照小鼠在LPS施用后27小时死亡。在LPS施用后不同时间间隔用腹膜内施用戊巴比妥对小鼠实施安乐死。通过标准方法制备肺、脾和肾组织的核提取物。
按照Pan等，J Biomed Sci.2002，9622-630所述方法，通过电泳迁移率变动分析评估NF-κB DNA结合活性。简而言之，将肺组织的核提取物(2μg)与编码κB共有序列(5’-AGT TGA GGG GAT CCC CCC AGGC-3’)的35个碱基对的双链32P-标记的探针在结合缓冲液(10mMTris-HCl，40mM NaCl，10％甘油，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，1％Nonidet P-40，1％脱氧胆酸，3μg/ml聚脱氧肌苷酸脱氧胞苷酸)中一起在室温下温育30分钟。然后将样品装入天然5％聚丙烯酰胺凝胶并通过放射自显影分析。对于竞争性测定，在加入标记探针30分钟前加入20-倍摩尔过量的未标记的共有寡核苷酸。通过使用针对p65抗体的抗体的超迁移分析鉴定NF-κB蛋白质的组分。
还按照制造商的使用说明，使用基于ELISA的Trans-AM NF-κB p65转录因子分析试剂盒(Active Motif Europe，Rixensart，Belgium)评估NF-κBDNA的结合活性。将肺、脾、或肾组织的组织提取物(5μg)加入包被含有NF-κB共有位点的寡核苷酸的96孔板。通过特异性识别活化的NF-κB的抗-p65抗体显示NF-κB与DNA的结合。使用试剂盒提供的NF-κB野生型和突变型共有寡核苷酸，通过竞争实验测定NF-κB激活的特异性。
结果显示NF-κB/DNA复合体的水平在施用LPS以后显著提高，6小时后开始下降，用化合物1处理抑制受LPS诱导的NF-κB/DNA复合体水平的提高。
其它实施方案本说明书中公开的所有特征可以以任何组合组合。本说明书中公开的每个特征可以被用作相同、等价或类似目的的备选特征替代。因此，除非另外特别指出，公开的每个特征仅是一般系列的等价或类似特征的实例。
从上述描述中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围下可以进行本发明的各种变化和改进以便将其适应于各种用途和条件。例如，结构类似于稠合吡唑基化合物的化合物也可以用于实施本发明。因此，其他实施方案也在权利要求范围内。
权利要求
1.在受试者中相对于一种或多种抗炎细胞因子的释放，优先抑制四种或更多种促炎细胞因子的释放的方法，该方法包含向受试者施用有效量的下式的化合物 其中A是R或 其中R是H，烷基，芳基，环基，杂芳基，或杂环基；Ar1、Ar2和Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为R’，硝基，卤素，-C(O)-OR’，-C(O)-SR’，-C(O)-NR’R”，-(CH2)mOR’，-(CH2)mSR’，-(CH2)mNR’R”，-(CH2)mCN，-(CH2)mC(O)-OR’，-(CH2)mC(O)H，或者R1和R2一起，R3和R4一起，或R5和R6一起为-O(CH2)mO-，其中R’和R”各自独立地为H，烷基，环基，芳基，杂芳基，杂环基；m为0，1，2，3，4，5，或6；n为1，2，或3。
2.权利要求1的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
3.权利要求2的方法，其中A是
4.权利要求3的方法，其中R5和R6各自为H，Ar3是苯基，n为1。
5.权利要求4的方法，其中R3是CH2OH并且在呋喃基的2位上被取代，R4是H。
6.权利要求5的方法，其中Ar1是苯基。
7.权利要求5的方法，其中Ar1是噻吩基。
8.权利要求4的方法，其中R3是CO2H并且在呋喃基的2位上被取代，R4是H。
9.权利要求2的方法，其中A是H。
10.权利要求9的方法，其中R3是CO2CH3并且在呋喃基的2位上被取代，R4是H。
11.在受试者中相对于两种抗炎细胞因子的释放，优先抑制五种或更多种促炎细胞因子的释放的方法，该方法包含向受试者施用有效量的下式的化合物 其中A是R或 其中R是H，烷基，芳基，环基，杂芳基，或杂环基；Ar1、Ar2和Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为R’，硝基，卤素，-C(O)-OR’，-C(O)-SR’，-C(O)-NR’R”，-(CH2)mOR’，-(CH2)mSR’，-(CH2)mNR’R”，-(CH2)mCN，-(CH2)mC(O)-OR’，-(CH2)mC(O)H，或者R1和R2一起，R3和R4一起，或R5和R6一起为-O(CH2)mO-，其中R’和R”各自独立地为H，烷基，环基，芳基，杂芳基，杂环基；m为0，1，2，3，4，5，或6；n为1，2，或3。
12.权利要求11的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
13.权利要求12的方法，其中A是
14.权利要求13的方法，其中R5和R6各自为H，Ar3是苯基，n为1。
15.权利要求14的方法，其中R3是CH2OH并且在呋喃基的2位上被取代，R4是H。
16.权利要求15的方法，其中Ar1是苯基。
17.权利要求15的方法，其中Ar1是噻吩基。
18.权利要求14的方法，其中R3是CO2H并且在呋喃基的2位上被取代，R4是H。
19.权利要求12的方法，其中A是H。
20.权利要求19的方法，其中R3是CO2CH3并且在呋喃基的2位上被取代，R4是H。
21.权利要求15的方法，其中所述五种促炎细胞因子是白细胞介素1β，白细胞介素6，白细胞介素8，干扰素γ和TNF-α；和两种抗炎细胞因子是白细胞介素4和白细胞介素10。
22.权利要求21的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
23.一种抑制受试者内NF-κB的活性的方法，该方法包含向受试者施用有效量的下式的化合物 其中A是R或 其中R是H，烷基，芳基，环基，杂芳基，或杂环基；Ar1、Ar2和Ar3各自独立地为苯基，噻吩基，呋喃基或吡咯基；R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地为R’，硝基，卤素，-C(O)-OR’，-C(O)-SR’，-C(O)-NR’R”，-(CH2)mOR’，-(CH2)mSR’，-(CH2)mNR’R”，-(CH2)mCN，-(CH2)mC(O)-OR’，-(CH2)mC(O)H，或者R1和R2一起，R3和R4一起，或R5和R6一起为-O(CH2)mO-，其中R’和R”各自独立地为H，烷基，环基，芳基，杂芳基，杂环基；m为0，1，2，3，4，5，或6；n为1，2，或3。
24.权利要求23的方法，其中Ar2是5’-呋喃基。
25.权利要求24的方法，其中A是
26.权利要求25的方法，其中R5和R6各自为H，Ar3是苯基，n为1。
27.权利要求26的方法，其中Ar1是苯基。
28.权利要求26的方法，其中Ar1是噻吩基。
29.权利要求23的方法，其中A是H。
全文摘要
一种使用式(I)的稠合吡唑基化合物，相对于抗炎细胞因子的释放优先抑制促炎细胞因子释放的方法A是R或其中R是H，烷基，芳基，环基，杂芳基，或杂环基；Ar
文档编号A61P25/00GK1679552SQ20051006404
公开日2005年10月12日 申请日期2005年3月15日 优先权日2004年3月15日
发明者邓哲明, 顾记华, 潘秀玲, 郭盛助, 李芳裕 申请人:永信药品工业股份有限公司