Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及Lunasin多肽新的生理活性物质的应用，尤其涉及一种Lunasin多肽 在制备具有减肥活性物质方面的应用，特别涉及Lunasin通过PPAR γ通路抑制小鼠前体脂 肪细胞（3T3-L1)分化在制备具有减肥活性物质方面的应用。
【背景技术】
[0002] Lunasin是一种首次从大豆中分离并鉴定得到的含有43个氨基酸的多肽，动物 实验研宄表明Lunasin在胃肠道系统中不会被完全消化降解，而是可以完整地被机体所吸 收。Lunasin被认为是一种全新的、具有癌症预防作用的多肽，Lunasin还可以降低机体血 清总胆固醇水平和LDL-C，具有显著的降脂作用。除此以外，文献报道每天在LDL受体突变 型猪的饮食中添加富集Lunasin大豆提取物可以显著降低其血清FFA水平并提高其瘦素水 平。目前关于Lunasin生物活性的研宄大多集中在以上三个方面，而对其新的活性研宄上 较为匮乏。本发明研宄了 Lunasin对3T3-L1前体脂肪细胞分化的抑制作用，首次发现其潜 在的减肥活性。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质 方面的应用，特别提供一种Lunasin通过PPARy通路抑制小鼠前体脂肪细胞（3T3-L1)分 化在制备具有减肥活性物质方面的应用。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0005] -种Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用。
[0006] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，所述Lunasin是通过 PPARy通路抑制小鼠前体脂肪细胞（3T3-L1)分化而制备的具有减肥活性物质。
[0007] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，所述活性物质包括 Lunasin多肽和常用的制剂辅料。
[0008] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，包括
[0009] 第一步，MTT法检测不同剂量的Lunasin对3T3-L1脂肪细胞活性的影响；
[0010] 或，还包括：
[0011] 第二步，在对脂肪细胞活性无影响剂量下，研宄不同剂量Lunasin对脂肪细胞分 化的抑制作用；
[0012] 然后，
[0013] 第三步，观察细胞内脂滴堆积状况；提取细胞总RNA并进行逆转录，检测PPARy的 mRNA表达。
[0014] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，所述MTT法测定 Lunasin对3T3-L1小鼠前体脂肪细胞活性影响，加入Lunasin浓度为12. 5 μ g/ml-800 μ g/ ml ο
[0015] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，所述Lunasin对 3T3-L1小鼠前体脂肪细胞分化的影响，加入Lunasin浓度为12. 5 μ g/mL-100 μ g/mL。
[0016] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，所述第三步的观察为 油红染色后，观察细胞内脂滴堆积状况；异丙醇提取，测吸光度；提取脂肪细胞总RNA，逆转 录，RT-PCR检测PPAR γ的mRNA表达量，进一步确定其机理。
[0017] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，所述mRNA表达量是以 5 y g/mL罗格列酮作为阳性对照组。
[0018] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，所述MTT法测定 Lunasin对3T3-L1脂肪细胞活性的影响，包括：3T3-L1前体脂肪细胞复苏传代后，以10000 个细胞/ml密度，接种于96孔板，24h后，更换含有12. 5 μ g/mL-100 μ g/mL Lunasin的培养 基，设置无细胞无 lunasin空白组和无 Lunasin阴性对照组；48h后每孔加入20 μ L MTT溶 液（lmg/mL)，37°C厌氧孵化4h，移除MTT后，使用200 μ L DMSO溶解结晶，570nm下测定吸光 度。
[0019] 所述的Lunasin多肽在制备具有减肥活性物质方面的应用，将3T3-L1前体脂肪细 胞以10000个细胞/mL密度接种于12孔板，生长融合后，再培养48h，加诱导液I，所述诱导 液I含10%胎牛血清（FBS)，1%双抗，10 μ g/ml胰岛素，0.5m M异丁甲基黄嘌呤（IBMX)和 0. 1 μ M地塞米松（DEX)的DMEM培养基，培养48h ;更换为诱导液II，所述诱导液II含5 μ g/ ml胰岛素的DMHM培养基，培养48h ;更换为含有12. 5 μ g/mL-100 μ g/ml Lunasin的DMEM 培养基，并以5 μ g/ml罗格列酮作为阳性对照组，不加 lunasin作为空白对照组。
[0020] 本发明以上技术方案具有以下有益效果：
[0021] 1.利用MTT法检测Lunasin对3T3-L1小鼠前体脂肪细胞活性影响，结果表明浓度 低于100 U g/mL情况下，Lunasin对3T3-L1细胞完全无毒性。
[0022] 2. lOOyg/mL~12. 5yg/mL Lunasin均能抑制胰岛素诱导的3T3-L1细胞分化，减 少脂肪内脂滴堆积，并抑制PPAR γ的mRNA表达，呈现剂量依赖性，剂量在50 μ g/mL以上效 果优于5 μ g/mL罗格列酮。以上结果表明Lunasin存在潜在减肥效果。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明制备方法流程图
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] MTT法测定Lunasin对3T3-L1脂肪细胞活性的影响：
[0026] 3T3-L1前体脂肪细胞复苏传代后，以10000个细胞/ml密度，接种于96孔板，24h 后，更换含有800 μ g/mL Lunasin的培养基，设置无细胞无 lunasin空白组和无 Lunasin阴 性对照组。48h后每孔加入20 μ L MTT溶液（lmg/mL)，37°C厌氧孵化4h，移除MTT后，使用 200 yL DMSO(二甲基亚砜）溶解结晶，570nm下测定吸光度。以空白组调零，结果发现，与 阴性对照组相比，加入800 μ g/mL Lunasin后，细胞活性极显著降低。
[0027] 实施例2
[0028] MTT法测定Lunasin对3T3-L1脂肪细胞活性的影响：
[0029] 3T3-L1前体脂肪细胞复苏传代后，以10000个细胞/ml密度，接种于96孔板，24h 后，更换含有400 μ g/mL Lunasin的培养基，设置无细胞无 Iunasin空白组和无 Lunasin阴 性对照组。48h后每孔加入20 μ L MTT溶液（lmg/mL)，37°C厌氧孵化4h，移除MTT后，使用 200 μ L DMSO溶解结晶，570nm下测定吸光度。以空白组调零，结果发现，与阴性对照组相比， 加入400 μ g/mL Lunasin后，细胞活性极显著降低。
[0030] 实施例3
[0031] MTT法测定Lunasin对3T3-L1脂肪细胞活性的影响：
[0032] 3T3-L1前体脂肪细胞复苏传代后，以10000个细胞/ml密度，接种于96孔板，24h 后，更换含有200 μ g/mL Lunasin的培养基，设置无细胞无 Iunasin空白组和无 Lunasin阴 性对照组。48h后每孔加入20 μ L MTT溶液（lmg/mL)，37°C厌氧孵化4h，移除MTT后，使用 200 μ L DMSO溶解结晶，570nm下测定吸光度。以空白组调零，结果发现，与阴性对照组相比， 加入200 μ g/mL Lunasin后，细胞活性显著降低。
[0033] 实施例4
[0034] MTT法测定Lunasin对3T3-L1脂肪细胞活性的影响：
[0035] 3T3-L1前体脂肪细胞复苏传代后，以10000个细胞/ml密度，接种于96孔板，24h 后，更换含有100 μ g/mL Lunasin的培养基，设置无细胞无 Iunasin空白组和无 Lunasin阴 性对照组。48h后每孔加入20 μ L MTT溶液（lmg/mL)，37°C厌氧孵化4h，移除MTT后，使用 200 μ L DMSO溶解结晶，570nm下测定吸光度。以空白组调零，结果发现，与阴性对照组相比， 加入100 μ g/mL Lunasin后，细胞活性无显著差异。
[0036] 实施例5
[0037] MTT法测定Lunasin对3T3-L1脂肪细胞活性的影响：
[0038] 3T3-L1前体脂肪细胞复苏传代后，以10000个细胞/ml密度，接种于96孔板，24h 后，更换含有50 μ g/