专利名称：一种用于hPPARγ配体药物筛选细胞模型的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于hPPAR γ配体药物筛选细胞模型的方法。
背景技术：
W ±1 M ^ # ^ S W Y (peroxisome proliferator activated receptors, PPAR γ )属于II型核受体超家族成员，除了具有诱导脂肪细胞分化成熟和调控多种脂肪因子基因表达的功能外，还在抑制炎症反应，抗肝纤维化作用，抗动脉粥样硬化， 诱导肿瘤细胞分化或凋亡，抑制肿瘤的转移及血管生成，改善心功能，保护肾脏，降血脂和降血压，保护神经系统等方面发挥重要的作用，有望成为治疗高血脂、肥胖、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病及恶性肿瘤等疾病的新靶点。在没有PPARY配体存在的情况下，细胞浆内的hPPARY能与维甲酸类受体 (RXRa)形成异二聚体，并招募共抑制蛋白复合体与其结合，进而抑制靶基因的转录，在 hPPAR γ配体与hPPARY结合后，此异二聚体释放共抑制因子，并募集多种共激活因子与其结合，并进入细胞核内，与靶基因启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element, PPRE)结合,启动靶基因的转录。目前用于药物筛选的方法如蛋白质芯片、极化荧光、高内涵筛选、模式生物等均存在各种弊端，如蛋白质芯片在如何提高反应特异性及降低成本等方面还有待改进，尤其是该法所得结果无法反映筛选剂的生物学活性；极化荧光由于某些荧光素半衰期较短，其标记物质起始极化值太高而在应用中受限，而且在标记的物质分子量较大时，极化值容易达到平台期，从而影响实验的精确性；高内涵筛选还处于发展阶段，仍存在诸多待解决的问题，如常用的荧光蛋白灵敏度还有待提高，高内涵药物筛选通量也有待增加等；模式生物的筛选通量还有待提高等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种用于hPPAR γ配体药物筛选细胞模型的方法，以克服蛋白质芯片无法反映筛选剂的生物学活性、极化荧光由于某些荧光素半衰期较短、其标记物质起始极化值太高而在应用中受限等其他药物筛选方法存在的不足。为了解决所述的技术问题，本发明采用以下技术方案它包括以下步骤
第一，用含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基培养细胞，选择其生长旺盛的时期，按8Χ IO4/孔的密度种M孔板；
第二，待细胞汇集至90 95%时，采用Lipofectamine 2000将重组质粒 phPPAR Y-IRES2-EGFP、报告质粒 ptk-PPREX 3_luc 和内部对照质粒 pRL-CMV 按 100:50:1 (0. 5μ g:0. 25μ g:0. 005 μ g)的比例共转染239T细胞，并同时设立空载体pIRES2-EGFP对照组；转染36h后检测转染效率和绿色荧光蛋白GFP的表达情况；
第三，hPPAR γ特异性配体阳性药物罗格列酮干预J93T细胞培养和质粒共转染同第一、二方法；不同之处是转染14 h后，更换新鲜的含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基，将不同浓度的阳性药物罗格列酮加入到各自的转染培养体系中，药物浓度设置为1%。 DMSO, 1(T8 mol/L、1(Γ7 mol/L、1(Γ6 mol/L、1(Γ5 mol/L 和 1(Γ4 mol/L,作为量-效分析研究(罗格列酮是用DMSO溶解为0. 1 mol/L的母液，用时稀释使用，因10_4 mol/L干预组DMSO的体积分数为1%。，故设1%。DMSO为对照组);同时采用10_5 mol/L浓度罗格列酮，加入到各自的转染培养体系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h和48 h进行时-效分析；
第四，对上述共转染239T细胞反应体系更换干预药物，采用PPARa特异性配体 WY14643，用以检测、确定人工模拟hPPARY信号通路的细胞模型反应特异性；
第五，采用相同浓度序列的全反式维甲酸代替PPARy阳性药物罗格列酮，对上述3反应体系进行干预，以了解上述体系是否可通过全反式维甲酸激动。所述的第三至第五步骤均采用双荧光素酶报告基因检测法分别检测萤火虫荧光素酶发光值(F)和内部对照海肾荧光素酶发光值(R)，根据酶比值(F/R值)所得数值分析该模型的可行性。第二步骤中的重组质粒phPPARY-IRES2-EGFP、报告质粒ptk-PPREX 3_luc和内部对照质粒 pRL-CMV 的比例为 0. 5 μ g: 0. 25 μ g:0. 005 μ g。本发明具有的优点为结果显示该细胞模型具有良好的量-效、时-效反应曲线及反应特异性；与其他药物筛选方法相比，本发明具有成本低、反应灵敏、特异性好等优点，是真正意义上的生物活性筛选新体系，另外，该模型可通过F/R值绘制的趋势线比较不同药物之间的半数有效浓度(EC50 )。
图1为细胞转染PhPPAR γ-IRES2-EGFP重组质粒后GFP表达情况(X200) 及流式细胞术检测转染效率结果，细胞转染PhPPAR y -IRES2-EGFP质粒36h后GFP表达情况；
图2为与图IA相应的相差图像；
图3为细胞转染phPPAR γ-IRES2-EGFP重组质粒后GFP表达情况(X 200)及流式细胞术检测转染效率结果，其中对照组GFP阳性率；
图4为细胞转染phPPAR y -IRES2-EGFP重组质粒后GFP表达情况(X 200)及流式细胞术检测转染效率结果，其中PhPPAR y -IRES2-EGFP质粒转染组GFP阳性率；
图5为转染的细胞阳性药物罗格列酮干预后荧光素酶发光比值(F/R值)，不同浓度梯度罗格列酮干预24h后检测F/R值，显示量-效关系；
图6为转染的四31~细胞阳性药物罗格列酮干预后荧光素酶发光比值(F/R值)， 10_5mol/L罗格列酮干预不同时间点检测F/R值，显示时-效关系；
图7为两种不同浓度药物干预hPPARY转染的细胞M h后荧光素酶发光比值(F/ R值)比较，对照组和phPPAR y -IRES2-EGFP质粒转染组分别用WY14643和罗格列酮干预； 图8为两种不同浓度药物干预hPPARY转染的细胞M h后荧光素酶发光比值(F/ R值)比较，对照组和phPPAR y -IRES2-EGFP质粒转染组分别用罗格列酮和全反式维甲酸干预。
具体实施方式
具体实施例方式实施以下步骤
第一，用含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基培养细胞，选择其生长旺盛的时期，按8Χ IO4/孔的密度种M孔板；
第二，待细胞汇集至90 95%时，采用Lipofectamine 2000将重组质粒 phPPAR Y-IRES2-EGFP、报告质粒 ptk-PPREX 3_luc 和内部对照质粒 pRL-CMV 按 100:50:1 (0. 5μ g:0. 25μ g:0. 005 μ g)的比例共转染239T细胞，并同时设立空载体pIRES2-EGFP对照组；转染36h后检测转染效率和绿色荧光蛋白GFP的表达情况；
第三，hPPARy特异性配体阳性药物罗格列酮干预J93T细胞培养和质粒共转染同第一、二方法；不同之处是转染14 h后，更换新鲜的含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基，将不同浓度的阳性药物罗格列酮加入到各自的转染培养体系中，药物浓度设置为1%。 DMSOUO"8 mol/L、l(T7 mol/L、l(T6 mol/L、l(T5 mol/L和 1(Γ4 mol/L，作为量-效分析研究(罗格列酮是用DMSO溶解为0. 1 mol/L的母液，用时稀释使用，因10_4 mol/L干预组DMSO的体积分数为1%。，故设1%。DMSO为对照组)；同时采用10_5 mol/L浓度罗格列酮，加入到各自的转染培养体系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h和48 h进行时-效分析；
第四，对上述共转染239T细胞反应体系更换干预药物，采用PPARa特异性配体 WY14643，用以检测、确定人工模拟hPPARy信号通路的细胞模型反应特异性；
第五，采用相同浓度序列的全反式维甲酸代替PPARy阳性药物罗格列酮，对上述3反应体系进行干预，以了解上述体系是否可通过全反式维甲酸激动。步骤3飞均采用双荧光素酶报告基因检测法分别检测萤火虫荧光素酶发光值(F) 和内部对照海肾荧光素酶发光值(R)，根据酶比值(F/R值)所得数值分析该模型的可行性。
权利要求
1.一种用于hPPAR γ配体药物筛选细胞模型的方法，其特征在于它包括以下步骤 第一，用含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基培养细胞，选择其生长旺盛的时期，按8Χ IO4/孔的密度种M孔板；第二，待细胞汇集至90 95%时，采用Lipofectamine 2000将重组质粒 phPPAR Y-IRES2-EGFP、报告质粒 ptk-PPREX 3_luc 和内部对照质粒 pRL-CMV 按 100:50:1 的比例共转染239T细胞，并同时设立空载体pIRES2-EGFP对照组；转染36h后检测转染效率和绿色荧光蛋白GFP的表达情况；第三，hPPARy特异性配体阳性药物罗格列酮干预J93T细胞培养和质粒共转染同第一、二方法；转染14 h后，更换新鲜的含质量分数为10% FBS的HG-DMEM培养基，将不同浓度的阳性药物罗格列酮加入到各自的转染培养体系中，药物浓度设置为1%。DMSOUO-8 mol/ L、Kr7 mol/L、Kr6 mol/L、1(Γ5 mol/L和 1(Γ4 mol/L,作为量-效分析研究；同时采用 1(T5 mol/ L浓度罗格列酮，加入到各自的转染培养体系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h和48 h进行时-效分析；第四，对上述共转染239T细胞反应体系更换干预药物，采用PPARa特异性配体 WY14643，用以检测、确定人工模拟hPPARy信号通路的细胞模型反应特异性；第五，采用相同浓度序列的全反式维甲酸代替PPAR γ阳性药物罗格列酮，对上述3反应体系进行干预，以了解上述体系是否可通过全反式维甲酸激动。
2.根据权利要求1所述的用于hPPARY配体药物筛选细胞模型的方法，其特征在于 第三至第五步骤均采用双荧光素酶报告基因检测法分别检测萤火虫荧光素酶发光值和内部对照海肾荧光素酶发光值，根据酶比值所得数值分析该模型的可行性。
3.根据权利要求1所述的用于hPPARY配体药物细胞模型的方法，其特征在于第二步骤中的重组质粒phPPARY-IRES2-EGFP、报告质粒ptk-PPREX3_luc和内部对照质粒 pRL-CMV 的比例为 0. 5μ g: 0. 25μ g:0. 005μ g。
全文摘要
本发明公开了一种用于hPPARγ配体药物细胞模型的方法，它包括以下步骤第一，用含质量分数为10%FBS的HG-DMEM培养基培养293T细胞；第二，待细胞汇集至90~95%时，采用Lipofectamine2000将重组质粒、报告质粒和内部对照质粒按100:50:1的比例共转染239T细胞，并设立空对照组；转染36h后检测转染效率和绿色荧光蛋白GFP的表达情况；第三，hPPARγ特异性配体阳性药物罗格列酮干预；第四，对上述共转染293T细胞反应体系更换干预药物，采用PPARα特异性配体WY14643；第五，采用相同浓度序列的全反式维甲酸代替PPARγ阳性药物罗格列酮，对上述共转染293T细胞反应体系进行干预。本发明具有结果显示该细胞模型具有良好的量-效、时-效反应曲线及反应特异性；且成本低、反应灵敏、特异性好等优点，是真正意义上的生物活性筛选新体系，另外，该模型可通过F/R值绘制的趋势线比较不同药物之间的半数有效浓度(EC50)。
文档编号C12N15/85GK102229957SQ201110028679
公开日2011年11月2日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者章涛 申请人:遵义医学院附属医院