专利名称：一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济种仿刺参 (Apostichopus japonicus)的EST (Express Sequence Tag，表达序列标签)微卫星标记 筛选开发和应用。
背景技术：
仿刺参为刺参科仿刺参属的动物，俗名刺参。分布于北太平洋区、包括俄罗斯、日 本、朝鲜半岛沿岸以及中国，常见于波流静稳、海草繁茂和无淡水注入的港湾内底质为岩礁 或硬底。仿刺参是食用海参中品质最好，分布最广，产量最大的一种。在我国，仿刺参养殖 业主要分布于辽宁、河北、山东、江苏等地等沿海地区。目前，仿刺参的研究大多是关于仿 刺参常规育种、增养殖等领域，关于分子标记方面的研究比较少。开发遗传标记并用于遗 传图谱构建、品种鉴定、遗传多样性等方面的研究无疑是解决仿刺参养殖过程中出现问题 的一个有效途径之一。随着仿刺参在分子生物学领域的研究工作不断深入，对仿刺参分子标记的需求也 越来越多。遗传改良或品种培育是仿刺参养殖稳定发展的动力，许多研究表明，遗传变异水 平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关，因此，开发仿刺参的分子遗传标记， 检测仿刺参遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子标记辅助选育，对于仿刺参的育种 和增养殖都具有十分重要的意义。EST是指通过从cDNA文库中随机挑取的克隆，进行大规模测序所获得的cDNA的 5’或3’端序列，长度一般为150-500 bp。近年来大量快速增长的EST数据已成为SSR的重 要来源，约有- 5%的EST含有SSR。与gSSR (基因组微卫星)标记相比，从EST序列中 中获得EST-SSR标记更经济，更有特点；由于EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微 卫星标记会直接和功能基因相关，并有可能和一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱 构建以及标记辅助选育都有很高的应用价值；同时，由于不同物种间基因共显性和保守性， 从一种物种中开发的EST-SSR可能同时用于近缘的其他物种研究，从而为比较基因组学、 同源基因克隆提供新的途径。因此，EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、 基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。利用EST微卫星标记，可能把 仿刺参重要经济性状与之关联起来，达到分子标记辅助育种的目的，并可进一步进行仿刺 参功能基因的研究。目前关于仿刺参EST微卫星标记的研究还很少。
发明内容
本发明的目的是为了简便快速的鉴定仿刺参AjElOl遗传标记基因座位的遗传变 异图谱，丰富现有的仿刺参微卫星标记，寻找更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记，提 供了一种仿刺参AjElOl微卫星DNA标记的检测方法。本发明是通过以下方案实现的
一种仿刺参AjElOl微卫星特异性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分别如SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO 2 所示。一种利用仿刺参AjElOl微卫星特异性DNA引物的PCR反应体系，其特征在于所 述的 PCR 体系为10XPCR 缓冲液2. Ομ ;10mM 的 SEQ ID N0:1 禾Π SEQ ID NO :2 引物对 各:0. 2-0. 5 μ 1 ； IOmM dNTP :0. 4-5 μ 1 ；ddH20 :14. 6-15. 9 μ 1 ；5U/y 1 Taq酶:0. 2-0. 3 μ 1 ； IOng 仿刺参 DNA :1-1. 5 μ 1。一种仿刺参AjElOl微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤先 提取仿刺参基因组并稀释备用，再利用仿刺参AjElOl微卫星DNA核心序列(AT) η其中 η=22-24，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1_2所示；然后使用 该引物对仿刺参不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变 性聚丙烯酰胺凝胶检测。利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因 型，从而获得仿刺参在AjElOl遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱(如图1所示)。AjElOl微卫星DNA序列的特异性引物核苷酸序列分别为正链SEQ ID NO 1 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，负链 SEQ ID NO 2 5，-ATGACAAGAAACGGGAGA-3，，退火温度 为 49-55 0C ο其PCR反应加样参数正反向引物各为0. 2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 1.5-2.5 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶，50-100 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul ；使用该引物 的时设置PCR程序参数为94°C预变性2分钟；然后94°C变性30-40秒，45°C _60°C退火30 秒，72°C延伸30秒-1分钟，重复此反应35个循环。PCR产物的检测基因组DNA模板进行PCR扩增，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上电 泳，利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker (上海生工)作为分子量标记， 扩增产物用6%-8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳统进行检测，电压是8V/cm PCR产物中加上变 性Buffer之后95°C变性5分钟，之后立刻置于冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W 恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，约120分钟，电泳完毕之后用EB(终浓度是0. 5μ g/ ml)染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析多态性，确定各个个体的基因 型，并进一步得到AjElOl遗传标记基因座位的多态性图谱。本发明适用于仿刺参种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗传学，遗 传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究，进一步用于辅助仿刺参分子遗传育 种和养殖。现有的仿刺参微卫星标记还不够丰富，建立仿刺参遗传连锁图谱，物理图谱，以及 QTL定位需要更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记。与现有技术相比，本发明具有以下 优点
(1)本发明可以简便快速的鉴定仿刺参AjElOl微卫星遗传标记基因座位的遗传变异 图谱，方法简便，所得结果可直观的检测出仿刺参每个个体的基因型。(2)本发明的核心是AjElOl微卫星DNA标记的特异性引物，其核苷酸序列为正 链 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，负链 5，-ATGACAAGAAACGGGAGA-3，，退火温度为 49°C，可在 仿刺参总群检测中呈现高度遗传变异的多态性。(3)本发明主要应用于仿刺参种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗 传学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究。
图1本发明的AjElOl微卫星DNA标记在M尾仿刺参个体中的基因型图谱。
具体实施例方式实施例1
1. 提取仿刺参的DNA
本实验所取的仿刺参材料是随机提取M个DNA样品，从冷冻的肌肉组织中提取DNA。剪 取IOOmg肌肉组织，剪碎后置于0. 7 ml的抽提缓冲液(6 M toea (尿素)，10 mM Tris-HCI. 125 mM NaCI (氯化钠)，1% SDS (十二烷基肌硫酸钠)，10 mM EDTA (乙二胺四乙酸)，pH=7. 5) 中，加入终浓度为0.1 mg/ml的蛋白酶K (20 mg/ml)，37°C消化一夜。用苯酚氯仿(1 1)抽提反应物三次，提取上清液用等体积的氯仿抽提一次。取上清液用异丙醇进行沉淀， 然后溶解于 500 1 μ IXTE (10 mM Tris. HCI, 1 mM EDTA, pH =8.0)中。用 RNase (20 μ g/ml) 37°C处理DNA样品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化用苯酚/氯仿抽 提一次、氯仿抽提一次。然后提取上清液加入两倍体积的无水乙醇和十分之一倍体积的3M NaAc (醋酸钠)，摇勻之后12000rpm离心收集DNA，再用70%乙醇洗涤两次，待乙醇完全 蒸发之后，加入50 μ 1 IXTE于一 20°C保存待用。2. PCR 扩增
PCR的反应条件是50ng仿刺参基因组DNA，引物SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 2各 1μ M、0. 2mMdNTP、lXPCR buffer、1. 5mM 的 Mg2 +、0· 5UTaq 酶。PCR 的反应程序是 94°C变 性10分钟之后进入循环，94°C变性30秒，Tm50°C退火30秒，72°C延伸1分钟，反应进行35 个循环。4°C保存PCR产物。3. 电泳检测
PCR扩增产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压是8V/cm，电泳完毕之后用EB (终浓 度是0. 5 μ g/ml)染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果(如图1所示)。该试验结果说明AjElOl是一个多态性丰富的标记可以用于群体遗传学的分析， 并且特异性很好。实施例2
微卫星位点的筛选及其多态标记的确定 1. 微卫星位点的来源和微卫星序列的筛选
从NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)数据库搜集并下载(以FASTA格式)已有的 EST序列，利用SSmumter软件逐一查找分析所得的5736个序列，对2 — 6个碱基重复单 元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离。采用软件DNAstar中的kqMan对含有微 卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。2. 微卫星标记引物的设计
在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件I^rimer Premier 5. 0和DNAstar中的 Primerselect设计引物；引物要求满足以下条件(1)引物长度为17 — 25bp ;(2)GC含量 要求大于40%; (3)退火温度大于40°C; (4)预期的PCR产物长度为100 — 300bp。设计的 引物为正链 5，-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3，，负链 5' -ATGACAAGAAACGGGAGA-3，。3. 引物的优化对AjElOl Tm值进行优化(50°C)。扩增反应分别用MJ-100 PCR仪，PCR程序为94°C 变性2分钟之后进入循环，94°C变性30或者40秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒到1分 钟不等，反应进行35个循环。反应体系为20 μ 1 其中含有正反向引物0.2 μ M、0. 2mMdNTP (四种脱氧核苷酸的混合物)、1 XPCR buffer、1.5 mM的Mg2 +、0. 6UTaq酶，模板量分别是 50ng。模板是随机的5个仿刺参样本。扩增得到的产物用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳一银 染检测，选取无或杂带少、特异性产物较高的PCR对应的温度作为最佳的退火温度，对应的 最佳Mg2+的浓度是2. OmM。10XPCR buffer 含有 100 mM Tris-HCL (三羟基甲基氨基甲烷一盐酸 pH9. 0)，500 mM KCL (氯化钾 ρΗ9· 0)，1% Triton X-100 (曲拉通 X-100)
4. 微卫星位点的确定
AjElOl用50°C和Mg2+ 2. OmM选取20个个体检测这些微卫星标记的多态性。PCR的反 应程序是94°C变性10分钟之后进入循环，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒， 反应进行35个循环。反应体系为20 μ 1 其中含有正反向引物0. 2 μ Μ、0· 2mMdNTP、1 XPCR buffer、1. 5mM的Mg2 +、Taq酶，模板量分别是lOOng。PCR扩增产物用8%的聚丙烯酰胺电 泳，电压是1 一 8V/cm，电泳完毕之后用EB (溴化乙锭，终浓度0. 5 μ g/ml)染色30分钟， 然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性，最后筛选出1个位点作为仿 刺参微卫星标记，标记的具体信息如表一。表一.开发获得的1个仿刺参(Apostichopus japonicus)的EST-SSR标记
权利要求
1.一种仿刺参AjElOl微卫星特异性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分别如SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 2 所示。
2.一种利用如权利要求1所述DNA引物的PCR反应体系，其特征在于所述的PCR体系 为10 XPCR 缓冲液2. Ομ ； IOmM 的 SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2 引物对各0. 2-0. 5μ1 ； IOmM dNTP :0. 4_5μ1 ；ddH20 :14. 6-15. 9μ1 ；5υ/μ1 Taq 酶0. 2-0. 3μ1 ；IOng 仿刺参 DNA 1-1. 5μ1。
3.一种仿刺参AjElOl微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤先 提取仿刺参基因组并稀释备用，再利用仿刺参AjElOl微卫星DNA核心序列(AT) η其中 η=22-24，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1_2所示；然后使用 该引物对仿刺参不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变 性聚丙烯酰胺凝胶检测。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于其PCR反应加样参数为正反向引物SEQ ID NO :1-2各为0.2 uM, 0. 2 mM dNTP, IXPCR 缓冲液，1. 5-2. 5 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶， 50-100 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul ；使用该引物的时设置PCR程序参数为94°C预 变性2分钟；然后94°C变性30-40秒，45°C -60°C退火30秒，72°C延伸30秒-1分钟，重复 此反应35个循环。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于对PCR产物的检测基因组DNA模板进行 PCR扩增，其产物在69Γ8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，干燥后在扫描保存图片，分析多态性， 得到各个个体的基因型，并进一步确定AjElOl遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于在PCR产物的检测中利用长度差异为50 bp的DNA梯型及PBR322标记作为电泳的分子量标记；电泳的电压为1 一 8V/cm。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于PCR扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳-银染系统进行检测PCR产物中加上变性缓冲液之后95°C变性5分钟，之后立刻置于 冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W恒功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，120分钟 后，用终浓度0. 5μ g/ml的溴化乙锭染色30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结
全文摘要
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及仿刺参的EST微卫星标记筛选开发和应用。本发明提供了一种仿刺参AjE101微卫星特异性DNA引物，一种利用上述引物的PCR反应体系以及一种仿刺参AjE101微卫星DNA标记的检测方法，包括先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用仿刺参AjE101微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物，然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对产物进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得仿刺参多态性遗传变异图谱。本发明主要应用于仿刺参种质资源和遗传多样性分析，分子群体遗传学，遗传图谱的构建，功能基因的研究。
文档编号C12Q1/68GK102140522SQ20111002833
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者任春华, 夏建军, 王艳红, 胡超群 申请人:中国科学院南海海洋研究所