一种海参多糖和海参胶原蛋白多肽的联合制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种海参多糖和海参胶原蛋白多肽的联合制备方法，属于分离纯化技术领域。
【背景技术】
[0002]海参(sea cucumber,holothurians)在我国约有140多种，其中可供食用者约有40多种，常见的食用海参有:仿刺参、玉足海参、梅花参、前参、黑乳参、花刺参、糙海参、方柱五角瓜参、海地瓜等。海地瓜俗称海茄子，是我国20多种食用海参中的一种，但食用品质较差，是我国大宗低值海参品种，但与花刺参、梅花参等高品质可食用海参营养成分相似。
[0003]体壁是海参的主要食(药)用部位，国内外学者对海参的研究发现，海参体壁营养非常丰富，干海参体壁的有机成分中蛋白质含量接近90%，富含人体所需氨基酸，同时，体壁还含有海参皂苷、多糖、糖蛋白、多种维生素及微量元素，不含胆固醇。国内外已有关于海参的多种活性物质抗癌、抗肿瘤、抗氧化、降血压、免疫调节等作用的报道。
[0004]海参肽是指蛋白酶水解并分离提纯后得到的小分子肽，此外，海参体内还含有神经肽、糖肽以及抗菌肽等多种活性肽。海参肽具有多种功效，如降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗疲劳、抗菌、提高免疫力、延缓衰老和抗氧化等诸多生理功能，对人体生理机能有着其他营养物质不可替代的作用。由于海参肽具有良好的溶解性、稳定性、低粘度性、易消化吸收、无抗原性、食用安全性等特殊的理化性质，因此，海参肽比其他普通海参制品有着更高的生物效价。
[0005]海参多糖是海参干体中除蛋白之外含量最高的有机物，现阶段研究的海参多糖主要分两种:海参硫酸软骨素(SC-CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)。岩藻聚糖硫酸酯是一类主要由岩藻糖及硫酸酯基团组成的多糖类物质，已被证实其具有多种生理活性，包括抗凝血与抗血栓、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降血脂、抗氧化、胃保护作用等。海参岩藻聚糖硫酸酯的结构比同种海参硫酸软骨素的结构要简单，但具有抗破骨类细胞形成、免疫调节、抗氧化等活性较高。
[0006]目前，有采用化学法水解海参蛋白、也有采用酶解法，都是通过一步水解法进行单独海参多肽或者海参多糖的提取，上述方法只能得到一种海参活性物质(或海参多肽或海参多糖)，其它有效的海参活性物质在提取的同时被浪费掉，并且得到的海参多肽为多种分子量混合的物质，因为具有活性的海参肽通常为二肽、三肽等小分子肽，其中的大分子量的海参肽不利于吸收;另外化学法水解海参蛋白在提取海参活性物质的同时容易产生有毒物质。同时，关于海参多糖提取方法的研究报道较多，但利用低值海参联合制备几种分子量的海参多糖和海参蛋白多肽的方法鲜有报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种原料利用率高、生产成本较低的低值海参多糖和海参蛋白多肽的联产制备方法，它是以低值海参海地瓜为原料，主要通过温和的二阶段酶解处理方法，利用超滤膜分离技术分别得到海地瓜多肽混合液和海地瓜多糖混合液。再通过选用截留分子量不同的超滤膜，实现对海地瓜多肽和海地瓜多糖的分级分离，最终得到3种分子量的海地瓜蛋白多肽产品和4种分子量的海地瓜多糖产品。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
具体方法包括如下:
(I)预处理。海地瓜干品用30-50°C清水泡发24-36小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于40-50°C烘箱中烘至恒重，粉碎至60-100目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用。
[0009](2)酶解。海地瓜干粉加入纯净水，料液比为1:30-1:80(W/W)。采用不同的酶和水解条件进行二阶段酶解:用碱调PH至6.8-8.5，加入复合蛋白酶I，温度40-60°C，保温振荡水浴酶解1-4小时；用酸调整pH至4.0-7.0，加入复合蛋白酶Π，温度40-60°C，保温振荡水浴酶解2-5小时。酶解结束后加热灭酶，抽滤除杂，得酶解液待用。
[0010](3)超滤膜分离。将步骤(2)中获得的海地瓜酶解液在优化的超滤条件下，选用截留分子量为1KDa超滤膜进行超滤分离，透过液为海地瓜多肽混合液，截流液为海地瓜多糖混合液。
[0011](4)海地瓜多肽的分级分离。在超滤条件下，选用截留分子量为5 KDa和I KDa的超滤膜，依次对步骤(3)中获得的分子量在10 KDa以下的海地瓜多肽混合液进行超滤分级分离，采用截留液全循环超滤方式，当截留液体积为原始酶解液体积的1/5时，达到超滤终点。依次收集5 KDa截留液、I KDa截留液和I KDa透过液，透析除盐，旋转蒸发后，冷冻干燥得到3个海地瓜多肽产品PlP^P3,其分子质量范围分别是5?10 KDa.l-5 KDa和<1 KDa;所占比例12.46%、P2 为 39.07%、P3 为 48.47%。
[0012](5)海地瓜多糖的分级分离。在超滤条件下，选用截留分子量为10 KDaUOO KDa和200 KDa的超滤膜对步骤(3)获得的海地瓜多糖混合液进行截留液全循环超滤，当截留液体积为原始酶解液体积的1/5时，达到超滤终点。依次收集10 KDa透过液、100 KDa透过液、200KDa透过液和200 KDa截留液，透析除盐，旋转蒸发后，冷冻干燥得到4个海地瓜多糖产品G1、G2、G3和G4，其分子质量范围分别是<10 KDa^lO-1OO KDa^ 100-200 KDa和>200 KDa，所占比例:Gi 为 3.67%、G2 为 19.36%、G353.09%、G4 为 23.88%。
[0013]在步骤(2)中，所用的复合蛋白酶I为:胰蛋白酶和碱性蛋白酶，两者重量比为2:1，复合蛋白酶I的添加量为原料重量的0.2-3%。所用的复合蛋白酶Π为:木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，三者的重量比为3:1:1,复合蛋白酶Π的添加量为原料重量的0.5-4%。
[0014]在步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中，所述的超滤条件:操作压力为0.05-1.0 MPa，操作温度为25-45°C。
[0015]在步骤(4)、步骤(5)中，所述的旋转蒸发温度为40_60°C.由于本发明根据低值海参海地瓜所含胶原蛋白和多糖等的特性，改变传统的分别提取提取的方法，采用不同的水解酶和水解条件对海地瓜进行二阶段酶解，选用不同截留分子量的超滤膜，对不同分子量的海参多肽和多糖逐步分级分离，实现了不同分子量的海参多肽和多糖产品联合制备。1、本发明利用低值海参海地瓜为原料，提高了原料利用价值。2、本发明通过联产方法使海地瓜中不同分子量的海参多肽和多糖产品可以联合制备，减少提取过程废弃物的排放，降低生产成本。3、本发明制备的多种不同分子量的海参多肽和多糖产品可以满足不同需求，应用范围广。
【具体实施方式】
[0016]本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
[0017]实施例1
(I)预处理。海地瓜干品用30°c清水泡发24小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于40°C烘箱中烘至恒重，粉碎至60目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用。
[0018](2)酶解。将10g海地瓜干粉加入500g纯净水，料液比为1:50(W/W)，用碱调pH至7.5，加入0.6g胰蛋白酶和0.3g碱性蛋白酶，在45°C，保温振荡水浴酶解4小时；用酸调整pH至6.5，加入0.3g木瓜蛋白酶、0.1g中性蛋白酶和0.1g胃蛋白酶在45°C，保温振荡水浴酶解5小时。酶解结束后加热灭酶(100°C，1min)，抽滤除杂，得酶解液470ml待用。
[0019](3)超滤膜分离。将步骤(2)中获得的470ml海地瓜酶解液用截留分子量为1KDa超滤膜进行超滤分离，超滤条件:操作压力为0.2 MPa，操作温度为35°C。得到:375 ml透过液，此为海地瓜多肽混合液；95ml截流液，此为海地瓜多糖混合液。
[0020](4)海地瓜多肽的分级分离。选用截留分子量为5 KDa和I KDa的超滤膜，依次对步骤(3)中获得的375 ml分子量在10 KDa以下的海地瓜多肽混合液进行超滤分级分离，超滤条件:操作压力为0.2 MPa，操作温度为35°C。采用截留液全循环超滤方式，当截留液体积为原始酶解液体积的1/5时，达到超滤终点。依次收集5 KDa截留液75ml、I KDa截留液60ml和IKDa透过液240ml。透析除盐，40°C旋转蒸发后，冷冻干燥得到3个海地瓜多肽产品，其分子质量5-10 KDa的多肽7.23g、l-5 KDa的多肽22.87g、小于I KDa多肽28.50g;海参多肽的总量58.60g，各分子质量多肽所占比例:5-10 KDa的多肽12.34%、1-5 KDa的多肽39.03%、小于IKDa多肽48.63%。
[0021 ] (5 )海地瓜多糖的分级分离。将对步骤(3)中截留的95ml分子量在10 KDa以上的海地瓜多糖混合液，用纯净水定容至300ml，选用截留分子量为200 KDa.lOO KDa和10 KDa的超滤膜对海地瓜多糖混合液进行截留液全循环超滤，超滤条件:操作压力为0.2 MPa，操作温度为35°C。当截留液体积为多糖混合液体积的1/5时，达到超滤终点。依次收集200KDa截留液60ml、100 KDa截留液48ml、10 KDa截留液40ml和10 KDa透过液152ml。透析除盐，50°C旋转蒸发后冷冻干燥得到4个海地瓜多糖产品，其分子质量大于200 KDa的多糖2.75g，100-200 KDa的多糖6.llg，10-100 KDa的多糖2.23g，小于1KDa的多糖0.42g;海参多糖的总量
11.51g，各分子质量多糖所占比例:大于200 KDa的多糖23.89%，100-200 KDa的多糖53.08%，10-100 KDa的多糖 19.37%，小于1KDa的多糖3.65%。
[0022]实施例2
(I)预处理。海地瓜干品用50°C清水泡发36小时，洗净体表与体内的泥沙、淤泥，切碎成块状，置于50°C烘箱中烘至恒重，粉碎至100目颗粒，制成海地瓜干粉，密封干燥保存备用。
[0023](2)酶解。将10g海地瓜干粉加入600g纯净水，料液比为1:60(W/W)，用碱调pH至8.0，加入0.8g胰蛋白酶和0.4g碱性蛋白酶，在50°