微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法
【专利说明】
[0001]
技术领域： 本发明涉及鳕鱼深加工技术领域，具体地讲是微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原 多肽的工艺方法。
[0002]
【背景技术】： 鱼品在加工的过程中，必然会产生大量的下脚料，（包括鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨 及其残留鱼肉），其重量约占原料鱼的40%-55%。随着渔业的发展，水产品的综合利用也越 来越引起人们的重视。鱼皮中胶原蛋白的含量最高可达蛋白质总量的80%以上，较鱼体其 它部位高许多。除鸿巢章二等报道用鳕鱼皮制备明胶和酶解法制备蛋白多肽粉外，其它有 关鱼皮胶原蛋白的制备和应用的文献报道较少。
[0003] 目前制备鱼皮多肽多用酶解法，如东方海洋胶原蛋白多肽。但酶解法生产的多肽 产品存在苦味大和口感差等缺点。
[0004]
【发明内容】
： 本发明的目的是克服上述已有技术的不足，而提供微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味 胶原多肽的工艺方法；主要解决现有的酶解法制备鱼皮多肽产品存在苦味大和口感差等问 题。
[0005] 本发明的技术方案是：微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法， 其特殊之处在于，包括如下工艺步骤： a培养基：鳕鱼鱼皮加水，120-150°C高压蒸汽灭菌3s-30min，得基础发酵培养基，备 用； b样品的处理：纳豆、酒曲、醋曲的处理，将纳豆、酒曲、醋曲分别加入无菌生理盐水中， 振荡10-20min，分别10倍梯度稀释，得纳豆、酒曲、醋曲样品稀释液； c蛋白质高效降解菌的分离纯化： 1) 具蛋白酶活性的细菌的分离，分别取稀释度1〇_5~10 _7各种样品稀释液，涂布于脱 脂牛奶培养基上，35-37?培养24-48h ;挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线2-3 次并镜检获得纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用； 2) 具蛋白酶活性的霉菌和酵母菌的分离，分别取稀释度KT3~KT5各种样品稀释液， 分别涂布于马铃薯和YH)培养基上，28-30°C培养2-5d ;挑取单菌落接种于培养基上，经2-3 次平板划线并镜检获得纯种；纯化的菌株分别点种于脱脂牛奶培养基平板上，挑取透明圈 直径与菌落直径之比大的菌落，霉菌接种于马铃薯培养基斜面，酵母菌接种于YH)培养基 斜面，培养后备用； d产脂肪酶细菌的分离纯化：分别取各种样品稀释液，涂布于脂肪酶筛选培养基上， 35-37?培养24-48h;挑取菌落周围具有白色沉淀圈的菌落，经2-3次平板划线并镜检确认 为纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用； e多菌种鳕鱼皮发酵工艺：微生物种子制备，将选取的菌种活化后接种至分别装有相 应液体培养基的容器中，霉菌接种至装有马铃薯液体培养基的容器中，酵母菌接种至装有 YH)液体培养基的容器中，细菌接种至装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的容器中；霉菌和酵 母菌28-30°C，细菌35-37°C，160-210r/min摇床培养，制得种子液；将种子液按照一定的菌 体个数比，接种于基础发酵培养基中，160-210r/min摇床培养30h，测定水解度；所述的种 子液菌体个数比，细菌：霉菌：酵母菌约为2:1:1 ; f水解度的测定：总蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法；可溶性多肽含量的测定采 用福林一酷法；水解度的测定，米用TCA (二氯乙酸）法； 水解度（DH)%=(A-AV〇V^〇,其中％为鱼皮的总蛋白，Λ(为酶解反应前鱼皮蛋白中 的TCA可溶性多肽，％为酶解液中的TCA可溶性多肽。
[0006] 进一步的，所述的基础发酵培养基的料液比（W/V)为1:1. 5,料液比为鱼皮：发酵 液总体积比。
[0007] 进一步的，e步骤所述的种子液接种量为8%。
[0008] 进一步的，e步骤所述的发酵温度为30°C。
[0009] 本发明所述的微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法与已有技 术相比具有突出的实质性特点和显著进步，1、采用微生物发酵鱼皮蛋白制备鱼皮多肽，通 过控制发酵条件可将蛋白质降解成短肽，同时利用微生物使某些苦味物质进行转化，起到 脱苦的作用，可以克服酶解法生产的多肽产品苦味大和口感差等缺点，既可提高鱼皮胶原 蛋白多肽的得率并保证发酵过程中没有有害物质产生，还得到具有更好功能性的蛋白多 肽；2、采用多菌种益生菌发酵，通过不同微生物的相互作用，可将鱼皮中的腥味物质分解， 达到脱腥的目的，这是酶法生产的活性多肽不能达到的；3、利用水产品加工下脚料，提高产 品的附加值，既能减少环境的污染，降低水产加工的成本，又可以促进水产加工废弃物的综 合利用；4、鳕鱼皮的水解度可高达50. 65%。
[0010]
【具体实施方式】： 为了更好地理解与实施，下面结合实施例详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本 发明，并非用于限制本发明的范围。
[0011] 分离微生物用培养基的制备： 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏38，蛋白胨1(^，似(：15 8，蒸馏水100〇1^，？!17.2~7.4， 琼脂20g，121°C高压蒸汽灭菌20min ; 马铃薯培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000 mL，琼脂20g，pH自然，121°C高压 蒸汽灭菌20min ; YH)培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水lOOOmL，121°C 高压蒸汽灭菌20min ; 脱脂牛奶培养基：A.牛奶5 g，蒸馏水50 mL;B.琼脂2g，蒸馏水50mL;将A、B分别 115°C高压蒸汽灭菌30min，冷却至60°C混匀后倒平板； 脂肪酶筛选培养基：蛋白胨5g，CaCl2 O.lg，酵母膏lg，Tween-80 10mL，琼脂20g，蒸馏 水lOOOmL，121°C高压蒸汽灭菌20 min。
[0012] 实施例1，微生物混合发酵鳕鱼皮制备无腥味胶原多肽的工艺方法，步骤如下： 1、 基础发酵培养基：鳕鱼鱼皮l〇〇g，蒸馏水50mL，121°C高压蒸汽灭菌20min，得基础发 酵培养基，备用； 2、 样品的处理：纳豆、酒曲、醋曲的处理，分别取市售纳豆、酒曲、醋曲lg，并分别加入 99mL无菌生理盐水中，振荡15min，分别10倍梯度稀释，得纳豆、酒曲、醋曲的样品稀释液； 3、 蛋白质高效降解菌的分离纯化：1)具蛋白酶活性的细菌的分离，分别取KT5~KT7 各种样品稀释液1〇〇μL，涂布于脱脂牛奶培养基上，36°C培养36h ;挑取透明圈直径与菌落 直径之比大的单菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基上平板划线，重复2-3次平板划线并镜检确 定为纯种，挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用；2)具蛋白酶活性的霉 菌和酵母菌的分离，分别取1〇_ 3~10_5各种样品稀释液ιοομ L，分别涂布于马铃薯和Yro培 养基上，29°C培养3. 5d ;挑取单菌落，经2-3次平板划线并镜检确认为纯种；纯化的菌株分 别点种于脱脂牛奶培养基平板上，挑取透明圈直径与菌落直径之比大的单菌落，霉菌接种 于马铃薯培养基斜面，酵母菌接种于Yro培养基斜面，培养后备用； 4、 产脂肪酶细菌的分离纯化：分别取KT5~KT7各种样品稀释液?οομL，涂布于脂肪酶 筛选培养基上，36°C培养36h;挑取菌落周围具有白色沉淀圈的单菌落，经2-3次平板划线 并镜检确认为纯种，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面，培养后备用； 5、 多菌种鳕鱼皮发酵工艺：微生物种子制备，将选取的菌种活化后接种至装有IOOmL 相应液体培养基的500mL的三角瓶中，霉菌接种至装有马铃薯液体培养基的三角瓶中，酵 母菌接种至装有YH)液体培养基的三角瓶中，细菌接种至装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的 三角瓶中；霉菌和酵母菌29°C，180r/min摇床培养，细菌36°C，180r/min摇床培养，分别制 得种子液；将各菌株的种子液按照一定的菌体个数比，细菌：霉菌：酵母菌约为2:1:1，接种 量8%，接种于基础发酵培养基中，基础发酵培养基的料液比（w/v)为1:1. 5,180r/min摇床 培养30h，发酵温度为30°C，测定水解度； 6、 水解度的测定：总蛋白含量的测定，采用微量凯氏定氮法；可溶性多肽含量的测定 米用福林一酷法；水解度的测定，米用TCA (二氯乙酸）法； 水解度（〇Η)%=(Α-Λ(ν〇%-Λ〇,其中％为鱼皮的总蛋白，Λ(为酶解反应前鱼皮蛋白中 的TCA可溶性多肽，％为酶解液中的TCA可溶性多肽。
[0013] 关于上述实施例1的具蛋白酶和脂肪酶活性菌株的分离和纯化：从纳豆、酒曲和 醋曲中共分离到170株具有蛋白酶和脂肪酶活力的微生物，其中细菌25株，霉菌25株，酵 母菌120株。其中细菌BN IV-1，JF0Y3;黑曲菌Η-2;酵母菌JM白，具有较高产酶活性，4 株微生物的菌落形态和产酶特性见表1。
[0014] 实施例2,微生物