胶原结合生理活性多肽的制作方法

专利名称：胶原结合生理活性多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及杂合多肽，更具体地说，涉及胶原结合生理活性多肽，它是通过将来自纤连蛋白(FN)的肽与生理活性肽通过基因工程方法连接而制备的并且它具有胶原结合活性和生理活性；以及通过将所述胶原结合生理活性多肽与来自胶原的多肽结合而制备的生物材料。
背景技术：
人们期望细胞因子、生长因子和其他生理活性肽能用作药物。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是这类多肽的一个例子。它具有各种各样的生物活性包括促进中胚层和神经外胚层来源的各种细胞的增殖和分化的活性，也就是促进血管内皮细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、星形神经胶质细胞或类似细胞的细胞生长、细胞迁移和血管生成的活性，并且bFGF广泛用作用于细胞培养物的生长因子(Journal of CellBiology(细胞生物学杂质)，第109卷，第1期，1-6页(1989))。由于bFGF有这样的活性，因此非常期望将它用作伤口愈合剂(R.A.F.Clark编写，The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair(伤口修复的分子和细胞生物学)，第2版，第6章，237-248页(1988)，Plenum，New York)。表皮生长因子(EGF)也期望能用作伤口愈合剂，因为它对上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞具有细胞生长促进活性，并具有血管生成活性(Ziegler等编写，Growth Factors and Wound Healing(生长因子和伤口愈合)，第3部分，第12章，206-228页(1997)，Springer-Verlag，New York)。
然而，生理活性肽通常在活组织中的稳定性不足。生理活性肽还难以实现在靶组织中的局部保留和持续释放，结果就有可能在身体的其他部分导致副作用。鉴于这种情况，人们认为许多这类生理活性肽的实际应用很困难，并且强烈需求这类生理活性肽的有效的药物释放系统(DDS)。
为了解决上述问题已进行了许多尝试，希望能通过将肽与适宜的生物相容性高分子量材料混合而得到具有持续释放能力的生理活性肽。在这类材料中，胶原是已因其优秀的生物适合性而作为用于修复组织损伤的生物材料和作为药物载体广泛用于医药领域的一种蛋白质。
例如，在日本专利第2641755号和JP-A5-43453中公开了通过将肽与胶原混合来控制生理活性肽的缓慢释放性能的技术。
JP-B4-18865公开了通过将生长因子与胶原混合后再进行热脱水和交联而生产的含有生长因子的胶原基质。
在JP-A8-253429和JP-A8-325160公开的方法中，持续释放基质通过将肝素、具有肝素结合活性的生理活性肽和胶原混合加以制备，目的是提供具有持续释放能力的生理活性肽。但是，在这样的方法中，生理活性肽与肝素一起使用，导致了肝素所固有的抗凝剂作用问题以及不能使用没有肝素结合活性的生理活性肽这样的限制。
Fujioka等(Fujioka等人，Journal of Controlled Release(控释杂志)第33卷，307-315页(1995))报道通过将干扰素与高浓度的胶原混合并将经过空气干燥的含有干扰素的胶原颗粒包埋在活组织中而改善了干扰素的稳定性和局部保留。
还报道了通过肝素与胶原的直接化学交联制备的抗血栓形成物质(Raghunath等，Journal of Biomedical Materials Research(生物医学物质研究杂志)，第17卷，613-621页(1983)，和Nimni等，生物医学物质研究杂志，第21卷，741-771页(1987))。
已进行的另一种尝试是通过戊二醛或类似物质进行生理活性肽与胶原的化学交联。
如上所述，对于能用于许多类型的生理活性肽的有效DDS有强烈的需求，并且期望胶原成为能改善生理活性肽的持续释放性能的有前途的载体。但是，生理活性肽对胶原的亲和力通常较低，并且只是将肽与胶原混合迄今为止都没能实现生理活性肽在胶原基质中长期的稳定保留。
生理活性肽与胶原的化学交联方法也遇到了生理活性损失或减少的问题。
在就这种情况而开发的更新进的技术中，借助于基因工程将生理活性肽与其他肽连接起来，由此实现了生理活性肽的到位。更具体地说，利用基因重组技术使得杂合多肽能够在大肠埃希氏菌(E.coli)或类似菌株中表达。然而，表达的杂合多肽并不必然显示其原始活性，这是在表达显示所需性能、特别是所需生理活性的多肽时经常会遇到的困难。
JP-A5-178897公开了通过将bFGF与纤连蛋白(FN)(它是胞外基质的组分)的细胞结合结构域序列连接来生产功能性多肽的方法。这种功能性多肽与细胞结合而显示出细胞生长促进活性。但是，由于多肽与细胞直接结合而没有实现局部保留或持续释放。JP-A5-178897还描述了该功能性多肽的显著降低的bFGF活性。
为了实现通过胞外基质的持续释放而采取的另一个尝试是胶原导向TGF-β，它是来自牛von Willebrand因子和转化生长因子β(TGF-β)的胶原结合十肽菌素的杂合多肽(USP 5,800,811，Tuan等，Connective TissueResearch(结缔组织研究)，第34卷，第1期，1-9页(1996)，Han等，ProteinExpression and Purification(蛋白质的表达与纯化)，第11卷，169-178页(1997)，和Gordon等，Human Gene Therapy(人类基因疗法)，第8卷，1385-1394页(1997))。
但是，这些报道显示从大肠埃希氏菌中的包涵体回收的大多数重组蛋白质都显示出削弱的胶原结合活性以及降低的生理活性。另外，尽管多肽成功地捕捉了细胞，但只有少部分杂合多肽在与胶原结合后显示出胶原结合活性而不是TGF-β生长活性。因此，没有实现局部保留和持续释放的目的。鉴于这种情况，来自von Willebrand因子的胶原结合十肽菌素不适合作为胶原结合肽用于生产胶原结合生理活性多肽。
在此期间，Nishi等生产出了胶原结合生长因子，它们是bFGF或EGF与来自一种厌氧的革兰氏阴性杆菌-溶组织梭菌的胶原酶的胶原结合多肽的杂合多肽。但是，Nishi等报道在他们的尝试中生产的这些胶原结合生长因子的胶原结合活性是不够的，且他们的产品没能结合用胶原包被的培养皿以及许多类型的胶原物质(Proe.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)，第95卷，7018-7023页(1998))。这类胶原结合生长因子当然不能在与胶原结合后显示出细胞生长促进活性，因为它们不能结合胶原物质。还发现这些胶原结合生长因子的EGF活性有所下降，并且从免疫学的观点看，来自细菌胶原酶的多肽显然不适合用于人的组织再生。
在减少利用基因工程进行杂合多肽的工业化生产中的生产成本方面，极为重要的是实现多肽在原核生物(例如细菌)或在酵母中的生产，特别是多肽在大肠埃希氏菌中的表达。
然而，在大肠埃希氏菌中表达常常伴有难以再现多肽的原始活性或以高收率生产所需多肽这样的困难。
在大肠埃希氏菌中表达的一个主要问题是难以得到足够量的可溶性多肽。换句话说，生产出的多肽有可能是不溶形式的包涵体，或者在合成后立即分解，据信这些都是大肠埃希氏菌的排斥机理的结果，因为大量外源多肽的表达对大肠埃希氏菌来说是一种压力。包涵体形成的机理尚不完全清楚，且没有用于这种包涵体形成的万能溶液。一种有效的方法是使用强蛋白质变性剂将包涵体溶解，接着将重组蛋白质复性。但是，该方法存在这样的缺点多肽的三维结构最终没能再现，且所得多肽没有显示出正常的生理活性。
本领域中已知有多种方法可以用于生产不同类型的杂合多肽和能有效地生产保持了原有活性的可溶性多肽，且其中即使形成了包涵体蛋白质也能复性。已知的用于生产杂合多肽的多肽配偶体包括硫氧还蛋白、A蛋白、氯霉素乙酰转移酶、半乳糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和β-半乳糖苷酶，而用于许多这些多肽配偶体的表达载体已经可以从商业上购得。
保持原有活性的可溶性杂合多肽的生产有可能以相对较高的概率通过使用这样的多肽配偶体而实现。但是，上述多肽配偶体中没有一种显示出胶原结合活性。使用上述这些以外的多肽配偶体有可能导致低概率的杂合多肽表达以及甚至更低概率的保留原有活性的蛋白质的生产。总之，通过使用上述那些以外的配偶体来生产活性杂合多肽的可行性只有在示范了使用特定多肽配偶体进行的杂合多肽的生产和杂合多肽产品的活性后才能得到证实。
FN的胶原结合结构域可以假定为胶原(明胶)结合多肽配偶体。
例如，已提出使用来自FN的多肽作为所研究的重组蛋白质的纯化中的标记物。更具体地说，USP 5,342,762和USP 5,460,955中公开了能表达包括与所需蛋白质相连的FN的明胶结合结构域的多肽的载体，以及纯化所需蛋白质的方法。JP-A62-89699中提出了包含与其他多肽或治疗剂相连的FN的胶原结合结构域的多肽，以及其纯化方法。
在前述USP 5,342,762和USP 5,460,955中，请求保护具有确定序列的大鼠FN的胶原结合结构域，并且通过利用FN衍生部分(纯化标记物)对胶原/明胶的亲和力来捕捉包含FN衍生部分和有价值的蛋白质的杂合多肽，且通过用特异性蛋白酶进行切割来回收所需蛋白质。
更具体地说，FN的前原序列或前导信号肽序列是32个氨基酸残基的氨基酸序列，它能促进重组多肽从昆虫细胞或动物细胞分泌到培养基中，现将其加到FN的明胶结合结构域的氨基端，而生产和纯化如实施例中所述使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中进行，或者生产和纯化在用作宿主细胞的动物细胞诸如COS细胞中进行。
更具体而言，胰蛋白酶切割位点位于FN的明胶结合结构域的氨基端侧，而所需蛋白质位于胰蛋白酶切割位点的氨基端侧。因子XIIIa位点位于所需蛋白质的氨基端侧，而前原序列或前导信号肽序列加在因子XIIIa位点的氨基端侧。
但是，这些美国专利中全然没有提到FN衍生部分、即杂合多肽中的所需蛋白质部分以外的那些部分是否有生理活性。
在这类蛋白质的表达和纯化的实施方案中公开的有价值的蛋白质包括FN的同源性单位I-12(第12个I型同源性单位)、同源性单位I-9(第9个I型同源性单位)和同源性单位III-1(第1个III型同源性单位)以及人类因子IX的不同部分。这些多肽在本发明的意义上不是生理活性的。
作为对这种情况的反映，这些美国专利也没有提到杂合多肽的活性、功能和应用性，即使所研究的多肽碰巧是生理活性肽。根本没有用作促进人的细胞增殖、组织再生和器官再生的药剂的指示，并且即使指示了这样的用途(实际没有)，如上所述构建的杂合多肽也不适合这类应用。
更具体地说，在这些美国专利的多肽中，所研究的蛋白质连接在FN的明胶结合结构域的氨基端侧上，胰蛋白酶切割位点包括在所得多肽中的接点处，并且即使胰蛋白酶切割序列被另一种蛋白酶识别序列代替，也至少有一种从蛋白酶识别序列衍生的不必要的氨基酸残基在利用蛋白酶进行切割后遗留在所研究的蛋白质中。结果，所研究的蛋白质的生理活性就将发生损失或下降。
当纯化是使用FN衍生部分的唯一目的时，这样的部分可以通过用胰蛋白酶或其他内切蛋白酶切割后用羧肽酶B或类似物质分解而去除，由此得到没有任何不必要序列的所需蛋白质。不经过这样的处理，蛋白质经内切蛋白酶切割后将在其羧基端包括过多的氨基序列，且蛋白质将显示出活性降低或没有活性。因此，这些美国专利的方法不适合其中所得杂合多肽被用于组织再生或药物的情况。
此外，当如上所述构建的杂合多肽在大肠埃希氏菌或其他原核生物中生产时，该杂合多肽表现出胶原结合能力下降，所需蛋白质的生理活性将发生下降或损失。并且，这种杂合多肽将显示出水溶性形式的活性多肽从包涵体中回收时极低或者没有回收率。
换句话说，通过使用动物细胞或昆虫细胞作为宿主来生产保持原有功能的动物来源的多肽相对较容易，而在原核生物(细菌或类似生物)或酵母中生产这样的多肽却非常困难。不过，在原核生物诸如大肠埃希氏菌中生产基因工程多肽在减少生产成本方面非常有利，尽管这种生产非常困难且要实现它需要许多新的突破。
前述JP-A62-89699公开了包括用从Thr379到Val445的人FN的氨基酸序列构建的多肽的序列，JP-A62-89699中公开的多肽不适合作为杂合多肽的配偶体。正如后面将要描述的那样，在JP-A62-89699的实施例中所用的序列不相当于通过蛋白酶切割得到的序列。这种序列与生理活性肽的杂合多肽基本上没有显示出胶原结合活性，且基本上没有或只有降低的生理活性。
JP-A8-140677提出了一种用于功能性蛋白质在胞外基质中的导向的技术。在这种技术中，生产一种嵌合蛋白，而在这种蛋白质中，来自外源蛋白质或肽的氨基酸序列被插入到FN分子N端的70kDa片段和FN分子C端的37kDa片段之间。此发明的实施将遇到两个主要障碍。考虑到嵌合蛋白的高分子量和在水中的不溶解性，这种技术对于使用大肠埃希氏菌或类似物质的工业化生产是不合适的。为了显示出功能，嵌合蛋白必需在动物细胞中表达，而其功用有可能限于其中嵌合蛋白的基因直接在人类细胞中表达的基因治疗。
发明的公开如上所述，尽管已作出了一些通过利用基因重组技术在大肠埃希氏菌或类似物质中表达杂合多肽的提议，但具有足够水平的活性的杂合多肽的生产仍是困难的。
鉴于如上所述的情况，本发明的目的是提供一种胶原结合生理活性多肽，其中生理活性肽的活性保持在足够水平，且利用基因工程方式赋予了胶原结合活性。本发明的另一个目的是通过提供一种生物材料(生理活性多肽/胶原复合材料)来实现生理活性多肽的局部保留和长时间的、可控的缓慢释放，其中所述生物材料是通过将如上所述的胶原结合生理活性多肽与来自胶原的多肽结合加以制备的。
为了避免如上所述的情形，本发明的发明人发现带有生理活性肽的活性和胶原结合活性的胶原结合生理活性多肽可以通过将纤连蛋白(FN)的胶原结合结构域与生理活性肽利用基因工程方式连接起来进行生产。本发明的发明人还发现生物材料(生理活性多肽/胶原复合材料)可以通过将胶原结合生理活性多肽与来自胶原的多肽结合来生产。本发明已在这些发现的基础上得以完成。本发明的目的是通过如下所述的(1)到(15)实现的。
(1)一种胶原结合生理活性多肽，其中来自纤连蛋白的肽与生理活性肽连接，且其中所述多肽具有胶原结合活性和生理活性。
(2)按照上述(1)的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽与来自纤连蛋白的肽的羧基端连接。
(3)按照上述(1)或(2)的胶原结合生理活性多肽，其中所述来自纤连蛋白的肽具有与通过纤连蛋白的蛋白酶水解得到的序列相对应并构成纤连蛋白的胶原结合结构域的氨基酸序列；与所述氨基酸序列同源的氨基酸序列；或者其中在所述氨基酸中缺失、替代、插入或加入了一个到若干个氨基酸残基的氨基酸序列。
纤连蛋白最好是人纤连蛋白或是通过蛋白酶的有限水解或人纤连蛋白的自然发生的水解得到的产物。
蛋白酶最好是纤溶酶和胰凝乳蛋白酶的结合物。
(4)按照上述(1)到(3)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述来自纤连蛋白的肽具有在人纤连蛋白中构成从Ala260到Trp599的多肽的氨基酸序列；与所述氨基酸序列同源的氨基酸序列；或者其中在所述氨基酸序列中缺失、替代、插入或加入了一个到若干个氨基酸残基的氨基酸序列。
此处所用的术语“胶原结合活性”与“明胶结合活性”相同。
(5)按照上述(1)到(4)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽是细胞因子或生长因子。
生长因子最好是成纤维细胞生长因子(FGF)族或表皮生长因子(EGF)族。
(6)按照上述(1)到(5)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽通过基因工程方式与所述来自纤连蛋白的肽连接。
(7)按照上述(1)到(6)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽与所述来自纤连蛋白的肽通过基因工程方法连接，且所述胶原结合生理活性肽在最好是大肠埃希氏菌(E.coli)的细菌中生产。
胶原结合生理活性多肽可以具有作为一个间隔区在生理活性肽和来自纤连蛋白的肽的连接位点插入的氨基酸或肽。
在这种情况下，间隔区或间隔区及其相邻序列可以优选包括蛋白酶识别序列。蛋白酶识别序列最好是肠激酶识别序列。
(8)按照上述(1)到(7)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述胶原结合生理活性多肽可溶于水。
(9)按照上述(1)到(8)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述多肽在其与胶原结合后通过被保留在胶原中或通过从胶原中逐渐释放而显示出其生理活性。
(10)一种用于使含有上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的生理活性肽或生理活性赋予剂能够局部保留或持续释放的试剂。
(11)一种含有生理活性肽/胶原复合材料的生物材料，其中胶原结合生理活性多肽与来自胶原的多肽结合。
(12)按照上述(11)的生物材料，其中胶原结合生理活性多肽是上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽。
还可提供一种方法，其中通过使用上述(11)或(12)的生物材料使细胞、组织或器官具有了促进增殖、分化、再生或生物学物质生成的生理活性。
(13)一种用于使含有上述(11)或(12)的生物材料的生理活性肽或生理活性赋予剂能够局部保留或持续释放的试剂。
(14)编码上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因。
包括编码上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的重组载体。
包括编码上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的转化体。
包括编码上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的细菌。
(15)含有包括编码上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的重组载体的转化体。
含有包括编码上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的重组载体的细菌。
含有包括编码上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的重组载体的大肠埃希氏菌(E.coli)。
一种通过使用大肠埃希氏菌(E.coli)生产上述(1)到(9)任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的方法。
附图的简要描述

图1概略地描述了胶原结合生理活性多肽。
图2概略地描述了生理活性多肽/胶原基质复合材料。
图3概略地描述了其中对FNCBD-FGF的明胶结合活性进行评估的分批工艺。
图4显示了在分批工艺中得到的上清液的SDS-PAGE凝胶电泳情况。
图5概略地描述了其中对胶原结合活性进行评估的ELISA。
图6显示了FNCBD的胶原结合活性(在ELISA中)。
图7显示了FNCBD-FGF的胶原结合活性(在ELISA中)。
图8显示了FNCBD-EGF的胶原结合活性(在ELISA中)。
图9显示了FNCBD-EGF对BALB/c3T3细胞的生长促进活性。
图10显示了FNCBD-FGF对人成纤维细胞的生长促进活性。
图11显示了FNCBD-EGF对NRK49F细胞的生长促进活性。
图12概略地描述了胶原结合生理活性多肽的功能。
图13显示了FNCBD-EGF/胶原复合材料的人角质形成细胞生长促进活性。
图14显示了FNCBD-EGF和EGF间的对不同胶原类型的结合活性的对比。
图15显示了FNCBD-EGF/胶原复合材料的细胞生长促进活性的长期稳定性。
图16显示了FNCBD-EGF的高浓度蛋白质溶液中的胶原导向活性与EGF的这种活性的对比。
图17显示了FNCBD-EGF通过人血浆FN的释放或持续释放。
实施本发明的最佳方式纤连蛋白(FN)是在血浆和胞外基质中以及在培养细胞的表面上发现的一种细胞粘着糖蛋白。已知纤连蛋白能结合高分子量的生物分子诸如胶原(明胶)、肝素、纤维蛋白和整联蛋白，并与细胞粘着、组织结构、受损组织的修复以及其他生物学过程有关(Ruoslahti，Annual Review ofBiochemistry(生物化学年评)，第57卷，375-413页(1988))。
本发明的胶原结合生理活性多肽是其中如上所述的来自FN的肽与生理活性肽相连的一种多肽，且本发明的多肽显示出胶原结合活性和生理活性，且该生理活性在与胶原结合后仍保留下来。换句话说，本发明的胶原结合生理活性多肽是一种功能性杂合多肽，其中来自FN的肽与生理活性肽通过基因工程方式连接。
应当注意到如上所述的常规研究都没能提供具有胶原结合活性和生理活性的杂合多肽。从实际的观点来看，杂合多肽与胶原结合后的生理活性是特别重要的，利用常规的杂合多肽没有达到这一点。
本发明的发明人也曾尝试生产FGF或EGF与来自人von Willebrand因子的胶原结合肽的杂合多肽。但是，这种尝试最终放弃了，因为所得杂合多肽显示出不充分的胶原结合活性以及不足的收率。
本发明的发明人已进行了进一步的研究并发现当将来自FN的胶原结合肽用于胶原结合多肽时能以足够的水平保持胶原结合活性和生理活性，并且甚至在杂合多肽与胶原结合后仍保持了生理活性多肽的活性。在这些发现的基础上，本发明的发明人发明了胶原结合生理活性多肽，它是一种新颖的功能性杂合多肽，以及其应用。
本发明还能赋予没有胶原结合活性的生理活性多肽以及本来就有胶原结合活性的生理活性肽以来自FN的肽为基础的胶原结合活性。
在本发明中所用的术语“胶原”包括胶原以及热变性胶原诸如明胶。因此，术语“明胶结合”活性实质上等于“胶原结合”活性，并且在本发明中，胶原结合活性可以描述为明胶结合活性，反之亦然。
从FN衍生的肽的胶原结合活性在杂合多肽中是非常稳定和高的，且这种稳定的胶原结合活性使得能够完成一种生理活性多肽/胶原复合材料，这是一种生理活性生物材料，其中生理活性部分保留在胶原基质中或者生理活性部分是从胶原基质中逐渐释放的。
此外，本发明的胶原结合生理活性多肽具有这样的性质其胶原结合活性受到血浆FN的竞争性抑制。换句话说，本发明的胶原结合生理活性多肽当与血浆、血清或血液接触时、或者在同时存在的血浆、血清或血液中、或者随着加入血浆、血清或血液而从胶原中释放，而在血浆、血清或血液不足时它保留在胶原中。
如上所述，在完成本发明时起决定性作用的是在生产胶原结合生理活性多肽时将从FN衍生的胶原结合肽用于胶原结合部分。
在当今的重组DNA技术和基因工程技术的状况下，杂合基因(融合基因)可以从生理活性肽的基因生产，原则上，通过连接来自FN任何一部分的肽的基因加以生产。但是，胶原结合肽序列的适当选择对于其中保持了胶原结合活性和生理活性的杂合多肽的生产来说是决定性的。这种选择也包括在本发明的范围内。
<来自FN的肽(纤连蛋白胶原结合结构域，FNCBD)>
如上所述，本发明中的决定性组分-从FN衍生的肽是从FN衍生的胶原结合肽，并且最好是与通过使用蛋白酶的FN的蛋白水解作用生产的胶原结合肽相一致的序列，更优选是通过FN的有限蛋白水解作用或自然发生的蛋白水解作用生产的。
更具体地说，从FN衍生的肽可以具有与构成FN的胶原结合结构域的具有胶原和/或明胶结合活性的多肽的氨基酸序列完全同源性的氨基酸序列；其中在这样的氨基酸序列中已加入一个到若干个氨基酸残基的氨基酸序列；或者其中在这样的氨基酸序列中已替代、缺失或加入了一个到若干个氨基酸残基的氨基酸序列。
这类蛋白酶的优选实例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、组织蛋白酶D和胃蛋白酶，它们可以单独使用或者两个或多个结合使用。
FN最好是人FN。在有些情况下使用来自其他动物品种的FN也是可接受的。
考虑到如上所述的情形，在本发明中所用的术语“FN胶原结合结构域(FNCBD)”是来自FN的胶原/明胶结合多肽，它位于从FN的氨基端开始的大约28kDa的位置到从FN的氨基端开始的大约75kDa的位置之间，并且它是通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶G、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃促胰酶、白细胞弹性蛋白酶、或这类蛋白酶的结合物对FN的有限水解得到的。
例举性的多肽包括通过胰蛋白酶的有限水解或枯草杆菌蛋白酶的有限水解得到的约30kDa的胶原或明胶结合多肽；通过胰凝乳蛋白酶的有限水解、组织蛋白酶和凝血酶的有限水解、白细胞弹性蛋白酶的有限水解、嗜热菌蛋白酶的有限水解、或胃促胰酶的有限水解得到的约39至45kDa的胶原或明胶结合多肽；和通过纤溶酶和胰凝乳蛋白酶的有限水解得到的人FN的从Ala260到Trp599的多肽。
例举性的胶原结合FN多肽还包括具有构成人FN的从Ala260到Trp599的多肽的氨基酸序列的序列的多肽；具有与这种序列同源的序列的多肽；以及具有其中一部分序列被替代或缺失或者其中插入或加入了另一种序列的这种序列的多肽。可以用于本发明的这类人FN肽的实例是具有以下序列的那些(1)从人FN通过蛋白酶的有限水解或自然水解得到的并具有胶原/明胶结合活性的人FN的从Ala260到Trp599的多肽的氨基酸序列；与这种序列同源的氨基酸序列；或者其中一部分序列被替代或缺失或其中插入或加入了另一种序列的氨基酸序列；(2)构成人FN的从Ala260到Trp599的多肽的氨基酸序列；与这种序列同源的氨基酸序列；或者其中一部分序列被替代或缺失或其中插入或加入了另一种序列的氨基酸序列；其中蛋白酶识别序列呈递在所述氨基酸序列的羧基端上，而所述蛋白酶识别序列是来自人FN的；(3)包括构成人FN的从Ala260到Trp599的多肽的全部氨基酸序列的氨基酸序列；与这种序列同源的氨基酸序列；或者其中一部分序列被替代或缺失或其中插入或加入了另一种序列的氨基酸序列；和(4)构成通过对人FN的从Ala260到Trp599的多肽的蛋白酶有限水解或自然水解得到的并具有胶原/明胶结合活性的多肽的氨基酸序列；与这种序列同源的氨基酸序列；或者其中一部分序列被替代或缺失或其中插入或加入了另一种序列的氨基酸序列。
明胶结合活性在通过使用FN肽作为多肽配偶体制备的杂合多肽中的保留可以相对容易地通过测量通过对包含人FN的从Ala260到Trp599的多肽和生理活性肽的杂合多肽的蛋白酶有限水解得到的多肽的明胶结合活性来证实。
明胶结合活性的程度可以通过评估在高浓度的盐例如2MNaCl的存在下或者在其中对血浆FN的竞争性抑制进行评估的实验中明胶结合的保留来测量。
应当注意到有一些例外的情况，其中使用与构成从人FN通过蛋白酶有限水解或自然水解得到的来自FN的明胶结合多肽的氨基酸序列同源的氨基酸序列稍有不同的序列没有导致所得杂合多肽的胶原结合活性的损失。
但是，应当注意，在大多数情况下，其中只可利用其中在蛋白酶水解或自然水解中的切割位点被完全忽视的基因工程工艺得到的FN氨基酸序列被用作用于与生理活性肽融合的FN衍生部分的杂合多肽显示出明显降低的胶原结合活性，即使所用的FN衍生部分是包括了所有或部分FN胶原结合结构域的序列。例如，在JP-A62-89699中公开的其中包含人FN的从Cys277到Set577的氨基酸序列的多肽或包含人FN的从Thr379到Val445的氨基酸序列的多肽通过基因工程方式与生理活性肽融合的杂合多肽的胶原/明胶结合活性大大减小。通过将从Thr314到Met446的人FN多肽、从Thr314到Gly507的人FN多肽、或类似多肽、或者由JP-A62-89699的发明人发表的文章中报道的(Owens等，EMBO J(欧洲分子生物学组织杂志)，第5卷，2825-2830页(1986))包含从Thr374到Met446的人FN氨基酸序列的多肽通过基因工程方式与生理活性肽融合而制备的杂合多肽也显示出大大降低的明胶结合活性。
考虑到这种情况，当通过基因工程方法制备杂合的胶原结合生理活性肽时，来自FN的胶原结合肽的序列应当通过挑选与通过蛋白酶有限水解或自然水解生产的明胶结合肽同源的序列来制备。
在使用胰蛋白酶的情况下，蛋白酶的切割位点是精氨酸和赖氨酸的C端侧；在使用胰凝乳蛋白酶的情况下，是异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸的C端侧；在使用嗜热菌蛋白酶的情况下，是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的C端侧；在使用纤溶酶的情况下，是精氨酸和赖氨酸的C端侧；在使用凝血酶的情况下，是在精氨酸和甘氨酸之间；在使用组织蛋白酶D的情况下，是赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸的C端侧；在使用胃蛋白酶的情况下，是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸的C端侧；在使用白细胞弹性蛋白酶的情况下，是具有短的侧链诸如Gly、Ala和Val的2-3个连续氨基酸的C端侧；在组织蛋白酶G的情况下，是亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的C端侧；在枯草杆菌蛋白酶的情况下，是丙氨酸的C端侧。
在FN的实际水解中，特别是在FN的有限水解中，有一些可能被切割的位点和一些因FN的高级结构而能抵抗切割的位点。换句话说，通过蛋白酶的有限水解得到的胶原/明胶结合肽的数量是有限的。
因此，当在通过基因工程技术进行的生产中使用胶原结合肽结构域时，更易受蛋白酶影响的位点必须被用作分裂的位点。
更具体地说，FN中的易被蛋白酶切割的位点和切开的结构域的胶原结合活性可以通过审查过去的一些文章来进行研究(Ruoslahti等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，第254卷，6054-6059页(1979)；Balian等，生物化学杂志，第254卷，1429-32页(1979)；Ruoslahti等，生物化学杂志，第254卷，6054-6059页(1979)；Hahn等，Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院报)，第76卷，1160-1163页(1979)；Gold等，美国国家科学院院报，第76卷，4803-7页(1979)；Furie等，生物化学杂志，第255卷，4391-4页(1980)；Engvall等，Coll.Relat.Res.，第1卷，505-516页(1981)；McDonald等，生物化学杂志，第256卷，5583-7页(1981)；Vartio，T等，生物化学杂志，第256卷，471-7页(1981)；De Petro，G等，美国国家科学院院报，第78卷，4965-9页(1981)；Ruoslahti等，生物化学杂志，第256卷，7277-81页(1981)；Vartio等，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)，第123卷，223-33页(1982)；Petersen等，国家科学院院报，第80卷，137-141页(1983)；Skorstengaard等，欧洲生物化学杂志，第140卷，235-243页(1984)；Zardi等，欧洲生物化学杂志，第146卷，571-579页(1985)；Skorstengaard等，欧洲生物化学杂志，第161卷，441-453页(1986)，等等)，或者通过实际进行蛋白酶对FN的有限水解并检验明胶结合肽的氨基端、羧基端或氨基酸序列来进行研究。
尽管对于FN的胶原结合肽已进行了相当多的研究，但在这些研究之间存在不相符之处(Owens等，欧洲分子生物学组织杂志，第5卷，2825-2830页(1986)；Ingham等，生物化学杂志，第264卷，16977-16980页(1989)；Litvinovich等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，第217卷，563-575页(1991)；Banyai等，欧洲生物化学杂志，第193卷，801-806页(1990)；Skorstengaard等，FEBS letters(欧洲生化学会联合会通讯)，第343页，47-50页(1994))。
本发明的发明人的见解是这些研究之间的这种不相符是由没有考虑通过基因工程方式得到的肽(序列在不适当的位点分开)和通过蛋白酶切割得到的肽之间的差异而得到的结论导致的。
在利用基因工程方式从FN生产FN衍生部分时选择了在不适当的位点分开的序列和加入了纯化标记物是造成胶原结合活性损失或下降的原因，即使该特定区域具有来自FN的多肽所固有的胶原结合活性。另外，就杂合多肽来说，来自FN的多肽的胶原/明胶结合活性常常通过融合而丧失了，甚至在来自FN的多肽在其融合前就存在这种活性的情况下也是这样。很可能是多肽的原始高级结构因不适当地采用了FN衍生肽而被扭曲了，从而导致了融合多肽中活性的损失。
本发明的胶原结合生理活性肽是通过生理活性肽与已在适当位点分开并且没有向其中加入纯化标记物的来自FN的胶原结合肽的融合生产的。另外，本发明的胶原结合生理活性多肽是在大肠埃希氏菌中生产的重组杂合肽，其中FN的胶原/明胶结合活性基本上保留了下来，使得能够与明胶结合，因此，本发明的多肽非常适合于明胶亲和纯化。本发明的胶原结合生理活性肽还显示出原始生理活性肽的高度保留的生理活性。
应当注意到来自FN的胶原结合肽序列不是本领域中报道的唯一的胶原结合肽序列，已报道的其他序列包括基质金属蛋白酶-胶原酶和明胶酶的序列，以及存在于胞外基质中的von Willebrand因子、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖、骨粘连蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白等。但是，尚未报道过与本发明的那些具有相等功能的杂合多肽，并且通过从如上所述的细菌胶原酶或von Willebrand因子选择胶原结合肽用于胶原结合多肽而进行的那些尝试都无一例外。
在本发明中用于生产胶原结合生理活性多肽(杂合多肽)的来自人FN的多肽的优选实例不限于包含了由人FN的从Cys277到Ser577的氨基酸序列(JP-A62-89699中描述的序列)构成的多肽的全长的那些。
这类多肽的实例包括通过枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的有限水解得到的具有人FN的从Val262到Arg484的氨基酸序列的多肽；通过纤溶酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的有限水解得到的具有人FN的从Ala260到Leu483的氨基酸序列的多肽；通过胰蛋白酶的有限水解得到的具有人FN的从Ala260到Arg484的氨基酸序列的多肽；通过纤溶酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的有限水解得到的具有人FN的从Ala377到Leu483的氨基酸序列的多肽；通过纤溶酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的有限水解得到的具有人FN的从Val377到Trp599的氨基酸序列的多肽；通过纤溶酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的有限水解得到的具有人FN的从Leu483到Trp599的氨基酸序列的多肽；和通过胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的有限水解得到的具有人FN的从Arg484到Trp599的氨基酸序列的多肽。
在本发明中用于生产胶原结合生理活性多肽的来自FN的多肽的优选实例还包括包含了由人FN的从Cys277到Ser577的氨基酸序列构成的多肽的全长的那些。这类实例包括通过纤溶酶和胰凝乳蛋白酶的有限水解得到的人FN的从Ala260到Trp599的多肽，和通过枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的有限水解得到的人FN的从Val262到Trp599的多肽。
应当注意到包括由从Cys277到Ser577的人FN氨基酸序列构成的多肽序列的整个长度的许多多肽不适合用作胶原结合生理活性多肽的FN衍生的胶原结合多肽。这类不适当多肽的完整名单将是巨大的，该名单的一部分包括由以下氨基酸序列构成的多肽人FN的从Asn220到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Arg221到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Gly222到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Asn223到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Leu224到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Leu225到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Gln226到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Cys227到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Ile228到Ser577的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Ser577的氨基酸序列；
人FN的从Cys277到Cys1201的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Thr1202的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Phe1203的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Asp1204的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Asn1205的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Leu1206的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Ser1207的氨基酸序列；人FN的从Cys277到Pro1208的氨基酸序列；和人FN的从Cys277到Gly1209的氨基酸序列。
如上所述，在选择用于生产本发明的胶原结合生理活性肽的来自FN的多肽的氨基酸序列时，包含人FN的从Cys277到Ser577的氨基酸序列的全长(JP-A62-89699中描述的序列)是不够的。在使用的FN衍生部分适当和不适当这两种情况下都包括从Thr379到Val445的氨基酸序列，因此，包含这一区域的全长不是在本发明的胶原结合生理活性肽中所用的来自FN的多肽的充分条件。JP-A62-89699描述了作为具有胶原结合能力的最小序列的从Thr379到Val445的区域。但是，用包含了Thr379到Val445区域的从The374到Ala479的氨基酸序列构成的多肽后来报道甚至在该序列没有与其他序列融合时也没有胶原结合能力(Skorstengaard等，欧洲生化学会联合会通讯，第343卷，47-50页(1994))。
<生理活性肽>
本发明中所用的术语“生理活性肽”是具有各种生理活性的肽和多肽的类属命名包括细胞因子和生长因子。例举性的生理活性肽包括生长因子诸如成纤维细胞生长因子(FGF)族，转化生长因子β(TGF-β)族，表皮生长因子(EGF)族，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素样生长因子(IGFs)，神经生长因子(NGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，肝细胞生长因子(HGF)和其他生长因子，和细胞分化因子诸如骨形态发生蛋白(BMPs)；细胞因子诸如干扰素(IFNs)、白介素(ILs)、集落刺激因子(CSFs)、红细胞生成素和肿瘤坏死因子(TNF)；激素诸如胰岛素和甲状旁腺激素(PTH)；酶诸如基质金属蛋白酶(MMPs)和其他蛋白酶。应当注意到作为融合配偶体或纯化标记物广泛用于基因工程领域的肽序列诸如麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽β-转移酶(GST)、组氨酸标记物和β-半乳糖苷酶不包括在本发明的生理活性肽的概念内。
本发明中所用的术语“生理活性”或“生理活性肽的活性”指的是如上所定义的“生理活性肽”的部分或全部活性。例如，就细胞因子或生长因子而言，细胞功能的调制活性诸如生物学物质的生长、分化、迁移、合成等等都包括在生理活性的范围内，而仅仅是与细胞、受体或类似物质结合则不包括在生理活性的概念内。在本发明中，FN固有的活性也不在生理活性的范围内。
在本发明中，作为融合配偶体或纯化标记物的功能，例如与特定物质结合的活性也从生理活性的概念内排除。例举性的这类活性是对硫氧还蛋白的金属螯合物的亲和力、A蛋白的IgG结合活性、氯霉素乙酰转移酶的氯霉素结合活性、半乳糖结合蛋白的半乳糖结合活性、MBP的直链淀粉结合活性、GST的谷胱甘肽结合活性、组氨酸标记物的镍结合活性、β-半乳糖苷酶的部分或全部酶活性。
这类融合配偶体或纯化标记物的结合活性或酶活性已经证明会保留在各种杂合肽中，而与这类融合配偶体或纯化标记物融合的多肽的活性也已知会完好地保留在杂合肽中。因此，这类活性应当看作是例外的。
<杂合多肽>
在本发明中，纤连蛋白胶原结合结构域(FNCBD)和生理活性肽通过基因工程方式连接，而生理活性肽优选连接在FNCBD的羧基端侧上。本发明的胶原结合生理活性多肽可溶于水并且非常适合于利用细菌的工业化生产，细菌优选大肠埃希氏菌。在酵母、昆虫细胞或动物细胞中生产也是可接受的。
例如，生理活性肽可以连接在FN的胶原结合结构域的羧基端侧上，容易被蛋白酶(例如存在于活组织中的蛋白酶)切割的适宜的氨基酸序列可以插入到来自杂合多肽的生理活性肽的氨基端侧，以使得生理活性肽能够释放而没有加入过多的序列。更具体地说，大多数蛋白酶切割识别序列的羧基端，当蛋白酶识别序列加在生理活性肽的氨基端上时，在经过蛋白酶切割后将不会有过多的氨基酸序列保留在生理活性肽的氨基端上。这种蛋白酶识别序列可以是新近插入的序列。但是，也有可能将胶原结合结构域的C端侧用于蛋白酶识别序列和切割位点。在这种情况下，生理活性肽可以直接与没有间插人工序列的胶原结合结构域的羧基端连接，在这一侧切割后将不会有过多的氨基酸序列保留在FN的胶原结合结构域的这一侧上或者保留在生理活性肽的这一侧上。基质分泌(Matricrine)或邻分泌活性是这样一种方式其中生理活性多肽与固定在固相上的细胞的受体结合，于是该细胞受到该多肽的生理活性的支配。当优选这种活性方式时，本发明的杂合多肽可以通过防止被切割而显示出其生理活性。另一方面，当生理活性肽应当从FN的胶原结合结构域上切割下来并释放到液相中时，蛋白酶识别位点的存在是非常重要的。
在其中FNCBD和生理活性肽连接的本发明的胶原结合生理活性多肽(杂合多肽)中，胶原结合活性和生理活性都保持在足够的水平，因此，生理活性肽可以高稳定性地保留在胶原基质中并显示出持续的生理活性。
在如上所述的胶原结合生理活性多肽中，氨基酸或肽可以作为间隔区插入在生理活性肽与来自纤连蛋白的肽的连接点处。
在这种情况下，无论是间隔区还是间隔区及相邻序列都最好含有蛋白酶识别序列。
蛋白酶识别序列最好是肠激酶识别序列。
肠激酶识别序列起着调节FNCBD和生理活性多肽诸如bFGF或EGF之间的距离的间隔区的作用，肠激酶使得bFGF或EGF能够从FNCBD释放。肠激酶是在高等动物的十二指肠膜和胰腺中发现的一种蛋白酶。结果肠激酶识别序列被肠激酶识别后被切开，bFGF或EGF由此释放。肠激酶是一种能识别特异性非常高的序列DDDDK的酶，从而切割K(Lys)的C端侧，而这种序列是研究胶原结合生理活性肽如何变得有生理活性的机理和进行胶原结合生理活性肽的工业化生产时所必需的。
本发明杂合多肽的胶原结合活性或胶原结合能力是以从FN衍生的肽的活性为基础的胶原结合能力，而不是生理活性肽的活性。胶原结合活性是以FN为基础的还是以生理活性肽为基础的可以通过其中使用了天然FN或生理活性肽的竞争性抑制实验来证实。
本发明中所用的术语“胶原”或“来自胶原的多肽”指的是天然胶原、未成熟胶原、不全胶原(atelocollagen)(胃蛋白酶化胶原)、明胶(变性胶原)、或构成这类胶原形式的多肽。
本发明的融合多肽的应用是一种使得如上所述的生理活性多肽和含有胶原结合生理活性多肽的生理活性赋予剂能够局部保留或持续释放的试剂。本发明还提供了这样一种试剂。
还提供了显示出可控的生理活性的生物材料。在这种生物材料中，生理活性肽通过在生理活性肽和来自FN的肽的连接位点或在这种连接位点的附近区域中的位点上的蛋白酶切割而从生物材料中逐渐释放。
如上所述的生物材料可以用于为细胞、组织或器官提供生理活性以促进增殖、分化、再生或合成活性的方法中。本发明还提供了这种方法。
结果本发明还提供了，例如，可用于使生长因子诸如bFGF或EGF能够在目标位点持续释放或局部保留以增强损伤或手术后伤口的愈合或最大程度地促进慢性溃疡或顽固性溃疡治愈的胶原结合生长因子和胶原结合生长因子/胶原复合材料。生物组织含有胶原的基本部分，而胶原存在于基本上所有组织中。因此，当生理活性多肽被赋予了与胶原结合的活性时，该生理活性多肽将保留在组织中的给药部位或该部位附近。于是，生理活性多肽的局部浓度将维持在较高水平，生理活性多肽的作用将增强。因生理活性多肽的扩散引起的生理活性多肽的有害的副作用也将得以避免。
本发明还提供了促进细胞增殖的方法，其中使用了胶原结合生理活性多肽(杂合多肽)。更具体地说，本发明的其中生理活性肽为生长因子的杂合多肽可以通过利用其胶原/明胶结合活性而与胶原/明胶基质结合，生长因子将保留在基质中而没有随灌流介质流走，由此细胞的增殖得以促进。
本发明并不限于使用生长因子诸如在伤口的愈合中有效的bFGF和EGF，本发明中可以使用各种各样的具有不同生理活性的肽。本发明能够保持特定生理活性肽所固有的生理活性，同时，赋予生理活性肽的胶原结合活性已实现了可用于生理活性肽的持续释放或局部保留的胶原结合生理活性多肽。
本发明还提供了编码这种胶原结合生理活性多肽的基因，包括这种基因的重组载体，具有这种基因的转化体，以及具有这种载体的细菌，优选大肠埃希氏菌。
还提供了用于基因治疗的载体，其中编码胶原结合生理活性多肽的基因掺入到通过使用病毒载体诸如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒制备的载体中，或通过使用脂质体方法制备的载体中。还提供了其中掺入了这种多肽或这种基因的具有药物功能的细胞。
通过将这种杂合多肽与胶原结合而提供了用生理活性进行了功能修饰的生理活性肽/胶原复合基质，这种复合胶原基质作为一种新颖的可用于组织再生的生物材料是非常有用的。更具体地说，本发明提供了一种同时具有支架性能和生理活性的包含生理活性肽/胶原复合材料的生物材料，它使得能够构建具有三维结构的人工组织和器官(血管、神经、骨、耳、鼻、手指、皮肤、十二指肠、胃、心脏、肝、胰腺、肾，等等)。
图2中显示了其中生理活性肽与胶原基质结合的胶原/生理活性肽复合胶原基质的略图。
接下来，本发明通过参照优选的实施方案进行描述。
人FN的cDNA和蛋白质初级结构分别记载在欧洲分子生物学实验室数据库中和《欧洲分子生物学组织杂志》第4卷第7期第1755-1759页(1985)中。
首先，克隆与通过用蛋白酶(纤溶酶和胰凝乳蛋白酶)对人FN的有限水解得到的胶原/明胶结合结构域的氨基酸序列相对应的序列。
通过使用从人细胞提取的mRNA进行逆转录反应，所得cDNA进行PCR(聚合酶链式反应Saiki等，科学，第230卷，1350-1354页(1985))，以扩增与人FN的胶原结合片段(FNCBD)相对应的cDNA片段。
在PCR中所用的有义引物具有加在其5′端的限制酶识别序列和起始密码子序列，反义引物具有加在其5′端的终止密码子的限制酶识别序列和反义序列。
然后将FNCBD cDNA片段插入到克隆载体pBlueScript SK中来组成质粒pBS(FNCBD)。确认了核苷酸序列后，切下cDNA片段并掺入到表达载体pTYB1中来构建质粒pTYB1(FNCBD)。
pTYB1(FNCBD)是表达人FN的Ala260-Trp599(340个氨基酸残基)的质粒，pTYB1(FNCBD)引入到大肠埃希氏菌中使得能够生产胶原结合多肽FNCBD。
在质粒pBS(FNCBD)中克隆的cDNA片段也可在本发明中用于产生所需的杂合基因。cDNA具有在其5′端上的起始密码子序列，而连接位点，例如，XhoI识别序列在终止密码子加入到其与FNCBD翻译区的C端相对应的3′端之前立即引入。FNCBD的cDNA与生理活性肽的cDNA的连接可通过这种FNCBD cDNA的组成实现。
本发明的多肽优选通过将FNCBD的cDNA和生理活性肽的cDNA通过基因工程方式连接并表达该多肽来制备。
本发明的功能性多肽是，例如，一种人造功能性多肽，其中与人FN的Ala260-Trp599相对应的340个氨基酸残基的多肽(是通过蛋白酶(纤溶酶和胰凝乳蛋白酶)对人FN的有限水解得到的，在序列表中用SEQ IDNO.1代表)与在序列表中用SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3代表的人bFGF或人EGF连接。
在序列表的SEQ ID NO.1中，氨基酸No.1是通过基因工程方式从用于表达人FNCBD的起始密码子翻译的Met；氨基酸No.2至341是人FNCBD的氨基酸序列；而氨基酸No.342至343是由用于与生理活性肽的cDNA连接的XhoI识别序列编码的Leu和Glu。应当注意的是Glu将随着XhoI识别序列与SalI识别序列的连接而除去。
在序列表的SEQ ID NO.2中，氨基酸No.1是由用于与FNCBD的cDNA连接的SalI识别序列编码的Asp；氨基酸No.1至5是肠激酶识别序列(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；DDDDK)；而氨基酸No.6至159是人bFGF的氨基酸序列。
在序列表的SEQ ID NO.3中，氨基酸No.1是由用于与FNCBD的cDNA连接的SalI识别序列编码的Asp；氨基酸No.1至5是肠激酶识别序列(DDDDK)；而氨基酸No.6至58是人EGF的氨基酸序列。
应当注意人FN的氨基酸上的数字上标与在欧洲分子生物学实验室数据库中记载的成熟人FN中的从N端开始计数的氨基酸残基的数目相对应。在序列表中用SEQ ID NO.1显示的与人FN的Ala260-Trp599相对应的包含340个氨基酸残基的多肽与欧洲分子生物学实验室数据库中的氨基酸序列有两个氨基酸残基不相同，这种差异不是人工突变。
人bFGF的cDNA和蛋白质初级结构记载于Kurokawa等，欧洲生化学会联合会通讯，第213卷，第1期，189-194页(1987)。人EGF的cDNA和蛋白质初级结构记载于Bell等，核酸研究，第14卷，第21期，8427-8446页(1986)。
在本发明中，人bFGF或人EGF的cDNA利用PCR从通过使用人mRNA制备的cDNA开始扩增。各个cDNA的PCR通过使用具有加在5′端的限制酶识别序列和编码蛋白酶识别序列的序列的有义引物和具有加在5′端的限制酶识别序列的反义引物进行。这些cDNA片段然后插入到pBluescript SK中，以分别制备pBS(FGF)载体和pBS(EGF)载体。
然后将如上所述的人FNCBD的cDNA连接到质粒pBS(FGF)或pBS(EGF)的bFGF或EGF的5′端上的限制酶识别序列上得到具有杂合基因的质粒pBS(FNCBD-FGF)或pBS(FNCBD-EGF)。从这些质粒上切下杂合基因的片段并插入到表达载体pTYB1中得到重组质粒pTYB1(FNCBD-FGF)或pTYB1(FNCBD-EGF)，它们表达在序列表中由SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5代表的杂合多肽。应当注意在这些多肽中，人bFGF或人EGF与人FNCBD的羧基端连接。
从PCR引物衍生的核苷酸序列存在于FNCBD的cDNA和bFGF或EGF的cDNA之间的杂合基因中。要对这样的序列进行修饰调节bFGF或EGF与FNCBD之间的分子距离和/或插入蛋白酶识别序列诸如肠激酶识别序列或类似物质作为间隔肽。蛋白酶识别序列在间隔肽中的存在/不存在以及类型、间隔肽的序列和长度等等可以根据这种间隔肽插入的目的加以选择。
序列表中的SEQ ID NO.4是人FNCBD和人bFGF的杂合多肽的氨基酸序列。氨基酸No.1是从起始密码子翻译的Met；氨基酸No.2至341是人FNCBD的氨基酸序列；而氨基酸No.342至343是由通过人FNCBD的cDNA和bFGF的cDNA的连接(XhoI识别序列和SalI识别序列的连接)生产的核苷酸序列编码的Leu和Asp；氨基酸No.343至347是肠激酶识别序列(DDDDK)；氨基酸No.348至501是人bFGF的氨基酸序列。
序列表中的SEQ ID NO.5是人FNCBD和人EGF的杂合多肽的氨基酸序列。氨基酸No.1是从起始密码子翻译的Met；氨基酸No.2至341是人FNCBD的氨基酸序列；而氨基酸No.342至343是由通过人FNCBD的cDNA和EGF的cDNA的连接(XhoI识别序列和SalI识别序列的连接)生产的核苷酸序列编码的Leu和Asp；氨基酸No.343至347是肠激酶识别序列(DDDDK)；氨基酸No.348至400是人EGF的氨基酸序列。
当如上所述构建的质粒pTYB1(FNCBD)、pTYB1(FNCBD-FGF)和pTYB1(FNCBD-EGF)分别引入到大肠埃希氏菌中并在适宜的条件下培养时，重组多肽在大肠埃希氏菌中积累。这种表达可以通过免疫印迹法来证实。更具体地说，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从重组大肠埃希氏菌的全细胞分离蛋白质并将其转移到硝酸纤维素膜上。然后通过使用各自识别FNCBD、bFGF和EGF的单克隆抗体来检测重组多肽的条带。
例如，本发明的多肽如下所述进行制备。将具有引入其中的质粒的重组大肠埃希氏菌在培养基诸如SB肉汤中进行培养，向该培养基中加入IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷)，由此诱导所引入的基因在细胞中的表达。经过进一步培养后收获细胞，收获的细胞通过超声处理加以裂解。细胞裂解液进行离心。包涵体形式的重组多肽包括在离心后收集的沉淀中，该包涵体用8M脲溶解而变性。
接着，溶解的包涵体用增量降低的脲浓度透析使重组蛋白质复性(重折叠处理)。由此制备的40kDa、57kDa和46kDa的多肽分别是FNCBD(FIG.1，A)、FNCBD和bFGF的杂合多肽(FNCBD-FGF；FIG.1，B)、以及FNCBD和EGF的杂合多肽(FNCBD-EGF；FIG.1，C)的具体化。B和C是胶原结合生理活性多肽的具体方案。
由此制备的多肽的胶原结合活性可以通过两种方法来检验。一种是分批法，其中测量多肽与明胶(明胶琼脂糖4B，Amersham PharmaciaBiotech公司)的结合活性。多肽与明胶琼脂糖4B的混合悬浮液在4℃下搅拌1小时，然后该悬浮液进行离心。收集上清液，沉淀部分用1M氯化钠溶液洗涤两次并收集上清液。多肽从明胶上的洗脱尝试着通过重复类似操作用1M脲、2M脲和4M脲这样的顺序进行。最终，沉淀在十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲剂中煮沸，收集上清液。收集的上清液部分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，多肽与明胶的结合以及从明胶上的洗脱通过相应条带的存在和不存在来确定。
在另一种方法中，测量FNCBD、FNCBD-FGF和FNCBD-EGF与不同形式的胶原，即明胶、天然胶原和不全胶原(胃蛋白酶化胶原)的结合能力。首先，96孔平板用明胶、天然胶原和不全胶原包被，并用血清白蛋白封闭。将FNCBD、FNCBD-FGF和FNCBD-EGF分配，平板在37℃下温育大约1小时，接着洗涤并加入抗-FNCBD单克隆抗体。进一步洗涤后，使发生与酶缀合次级抗体的反应并洗涤平板。然后加入酶底物用于显色，平板各孔中的吸收测量为胶原结合活性。
胶原结合生理活性多肽的细胞生长促进活性可以通过XTT方法(Roehm等，免疫学方法杂志，第124卷，257-265页(1991))或WST-1方法(Liu等，自然医学，第1卷，267-271页(1995))进行评估，其中测量线粒体脱氢酶活性与活细胞数量的比例。更具体地说，小鼠BALB/c3T3细胞或人成纤维细胞在添加了多肽的培养基中培养4天。加入作为脱氢酶底物的XTT或WST-1试剂，细胞再培养3-6小时。然后测量培养基在特定波长下的吸收以评估特定多肽的细胞生长促进活性。
XTT方法和WST-1方法也可以用于测量与胶原结合生理活性多肽结合的胶原基质的细胞生长促进活性。
向包被了胶原的培养皿中加入不同数量的多肽溶液，并使该溶液在37℃下静置1小时。当取出多肽溶液且培养皿用生理溶液充分洗涤时，培养皿中残余了与生理活性肽结合的胶原基质。BALB/c3T3细胞、NRK49F大鼠成纤维细胞或人成纤维细胞在这样的基质上培养4天，加入XTT或WST-1试剂后再培养3-6小时。然后测量培养物在特定波长下的吸收作为其脱氢酶活性，以评估细胞生长促进活性。
据信是新颖的那些本发明的特征细致地阐明在所附的中。本发明以及其目的和优点可以通过参照下述对目前优选的实施方案的说明得到最好的理解，落在权利要求书的含义和同义范围内的所有变化因此都要包含在其中。
实施例接下来，本发明通过参照实施例作进一步的详细描述，这些实施例决不限制本发明的范围。
实施例1制备人FNCBD和人bFGF的杂合多肽，以及人FNCBD和人EGF的杂合多肽(a)编码人FNCBD的cDNA的克隆通过用引物(2)进行从人的肾细胞提取的mRNA的逆转录来制备具有与通过人FN的纤溶酶和胰凝乳蛋白酶有限水解得到的某一序列相对应的序列的人FNCBD的cDNA，并用引物对(1)和(2)扩增所得cDNA(RT-PCR)。
在由序列表的SEQ ID NO.6代表的引物(1)中核苷酸No.1至2是为确保PCR后KpnI的消化而加入的相邻序列，核苷酸No.3至8是用于克隆的KpnI识别序列，核苷酸No.7至12是NcoI识别序列，核苷酸No.13至14是用于调节表达读框的序列，核苷酸No.15至20是NdeI识别序列，核苷酸No.18至20是用于人FNCBD的表达的起始密码子序列，和核苷酸No.21至49是来自人FNCBD的核苷酸序列。
在由序列表的SEQ ID NO.7代表的引物(2)中
核苷酸No.1至2是为确保PCR后BamHI的消化而加入的相邻序列，核苷酸No.3至8是用于克隆的BamHI识别序列，核苷酸No.9至11是终止密码子的反义序列，核苷酸No.12至17是用于与bFGF、EGF或其他生理活性肽的cDNA连接的XhoI识别序列，和核苷酸No.18至46是来自人FNCBD的cDNA的反义序列。
RT-PCR用RNA LA PCR试剂盒(AMV)1.1版(Takara Shuzo)进行。首先，0.8μg总RNA的逆转录在20μl体积的反应溶液和60℃的温度下进行20分钟，然后该溶液在99℃下进一步加热5分钟。
然后，使用所得cDNA作为模板的PCR在100μl体积的反应溶液下进行。该溶液在94℃下保持1分钟，并将在94℃下30秒、63℃下1分钟、和72℃下2分钟这样的温度循环重复12次。
1/10体积的反应溶液利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，发现了大约1kbp的DNA片段。这种片段具有与人FNCBD的cDNA相一致的大小。
由此扩增的cDNA片段用KpnI和BamHI进行消化，并连接到已在25℃下用KpnI和BamHI消化了3分钟的克隆载体pBluescript SK上(使用由Takara Shuzo制造的连接试剂盒第2版)。
对核苷酸序列的分析显示得到了具有掺入其中的由序列表中SEQID NO.8代表的cDNA的质粒。这种质粒命名为pBS(FNCBD)。
在序列表的SEQ ID NO.8中核苷酸No.1至6是用于克隆的KpnI识别序列，核苷酸No.5至10是NcoI识别序列，核苷酸No.11至12是用于调节读框的序列，核苷酸No.13至18是NdeI识别序列，核苷酸No.16至18是用于人FNCBD的表达的起始密码子序列，核苷酸No.19至1038是人FNCBD的cDNA的核苷酸序列，核苷酸No.1039至1044是用于与bFGF、EGF或其他生理活性肽的cDNA连接的XhoI识别序列，核苷酸No.1045至1047是终止密码子，和核苷酸No.1048至1053是用于克隆的BamHI识别序列。
据发现，所得到的FNCBD的cDNA序列与欧洲分子生物学实验室数据库中登记的序列有5个核苷酸不相同。但是，这种差异被证实不会由PCR中的点突变引起。
(b)编码人bFGF的cDNA的克隆通过用引物(4)进行从人的肾细胞提取的mRNA的逆转录来制备人bFGF的cDNA，并用引物对(3)和(4)扩增所得cDNA(RT-PCR)。
在由序列表的SEQ ID NO.9代表的引物(3)中核苷酸No.1至2是为确保PCR后SalI的消化而加入的相邻序列，核苷酸No.3至8是用于克隆和用于与FNCBD的cDNA连接的SalI识别序列，核苷酸No.6至20是编码肠激酶识别序列(DDDDK)的核苷酸序列，和核苷酸No.21至40是来自人bFGF的cDNA的核苷酸序列。
在由序列表的SEQ ID NO.10代表的引物(4)中核苷酸No.1是为确保PCR后EcoRI的消化而加入的相邻序列，核苷酸No.2至7是用于克隆的EcoRI识别序列，核苷酸No.8至10是终止密码子的反义序列，和核苷酸No.11至31是来自人bFGF的cDNA的反义序列。
RT-PCR用RNA LA PCR试剂盒(AMV)1.1版(Takara Shuzo)进行。首先，0.8μg总RNA的逆转录在20μl体积的反应溶液和60℃的温度下进行20分钟，然后该溶液在99℃下进一步加热5分钟。
然后用100μl含有cDNA的反应溶液进行PCR反应。该溶液在94℃下保持2分钟，并将在94℃下30秒和65℃下4分钟这样的温度循环重复30次。
1/10体积的反应溶液利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，发现了大约450bp的DNA片段。这种片段具有与人bFGFcDNA的大小相一致的大小。
该cDNA片段用SalI和EcoRI进行消化，并连接到已用SalI和EcoRI进行了消化的pBluescript SK上。得到了具有掺入其中的由序列表中SEQ ID NO.11代表的cDNA的质粒。这种质粒命名为pBS(FGF)。
在序列表的SEQ ID NO.11中核苷酸No.1至6是用于克隆和与FNCBD的cDNA连接的SalI识别序列，核苷酸No.4至18是编码肠激酶识别序列(DDDDK)的核苷酸序列，
核苷酸No.19至480是人bFGF的cDNA的核苷酸序列，核苷酸No.481至483是终止密码子，和核苷酸No.484至489是用于克隆的EcoRI识别序列。
据发现，所得到的人bFGF的cDNA序列与欧洲分子生物学实验室数据库中登记的序列有1个核苷酸不相同。这种差异被证实是由PCR中的点突变引起的。但是，这种突变是氨基酸没有发生变化的沉默点突变，因此，使用没有对核苷酸进行校正的序列。
(c)编码人EGF的cDNA的克隆通过用引物(6)进行从人的肾细胞提取的mRNA的逆转录来制备人bFGF的cDNA，并用引物对(5)和(6)扩增所得cDNA。
在由序列表的SEQ ID NO.12代表的引物(5)中核苷酸No.1至2是为确保PCR后SalI的消化而加入的相邻序列，核苷酸No.3至8是用于克隆和用于与FNCBD的cDNA连接的SalI识别序列，核苷酸No.6至20是编码肠激酶识别序列(DDDDK)的核苷酸序列，和核苷酸No.21至44是来自人EGF的cDNA的核苷酸序列。
在由序列表的SEQ ID NO.13代表的引物(6)中核苷酸No.1是为确保PCR后EcoRI的消化而加入的相邻序列，核苷酸No.2至7是用于克隆的EcoRI识别序列，核苷酸No.8至10是终止密码子的反义序列，和核苷酸No.11至30是来自人EGF的cDNA的反义序列。
RT-PCR用RNA LA PCR试剂盒(AMV)1.1版(Takara Shuzo)进行。首先，1.0μg总RNA的逆转录在20μl体积的反应溶液和60℃的温度下进行30分钟，然后该溶液在99℃下进一步加热5分钟。
然后用100μl体积的反应溶液进行PCR。该溶液在94℃下保持1分钟，并将在94℃下30秒和65℃下45秒这样的温度循环重复35次。
1/10体积的反应溶液利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，发现了大约150bp的DNA片段。这种片段具有与人EGFcDNA的大小相一致的大小。
该cDNA片段用SalI和EcoRI进行消化，并连接到已用SalI和EcoRI进行了消化的pBluescript SK上。
得到了具有掺入其中的由序列表中SEQ ID NO.14代表的cDNA的质粒。这种质粒命名为pBS(EGF)。
在序列表的SEQ ID NO.14中核苷酸No.1至6是用于克隆和与FNCBD的cDNA连接的SalI识别序列，核苷酸No.4至18是编码肠激酶识别序列(DDDDK)的核苷酸序列，核苷酸No.19至177是人EGF的cDNA的核苷酸序列，核苷酸No.178至180是终止密码子，和核苷酸No.181至186是用于克隆的EcoRI识别序列。
应当注意，所得到的人EGF的cDNA序列与欧洲分子生物学实验室数据库中登记的序列相同。
(d)制备用于人FNCBD的表达载体在上述(a)中得到的质粒pBS(FNCBD)用NdeI和NotI进行处理(NotI-识别序列存在于pBluescript SK的多克隆位点中)。
将插入的FNCBD的cDNA片段切下来，并将该片段连接到表达载体pTYBl(New England BioLab)的NdeI和NotI位点上。由此构建的质粒命名为pTYB(FNCBD)。
(e)制备用于FNCBD/bFGF杂合多肽的表达载体在上述(a)中得到的质粒pBS(FNCBD)用KpnI和XhoI进行消化。应当注意到该质粒被部分消化，因为XhoI-识别序列存在于通过肾RNA的RT-PCR生产的FNCBD的cDNA中，而XhoI-识别序列不存在于欧洲分子生物学实验室数据库中登记的序列中。
FNCBD的插入的cDNA片段通过如上所述的消化加以切除，并将该片段连接到质粒pBS(FGF)的KpnI和SalI部位。由此构建的质粒具有掺入其中的由序列表的SEQ ID NO.15代表的DNA，这种质粒命名为pBS(FNCBD-FGF)。
在序列表的SEQ ID NO.15中核苷酸No.1至6是用于克隆的KpnI识别序列，核苷酸No.5至10是NcoI识别序列，核苷酸No.11至12是用于调节表达读框的序列，核苷酸No.13至18是NdeI识别序列，核苷酸No.16至18是起始密码子序列，核苷酸No.19至1038是人FNCBD的cDNA序列，
核苷酸No.1039至1044是通过XhoI-识别序列与SalI-识别序列的连接形成的核苷酸序列，核苷酸No.1042至1056是编码肠激酶识别序列(DDDDK)的核苷酸序列，核苷酸No.1057至1518是人bFGF的cDNA序列，核苷酸No.1519至1521是终止密码子，和核苷酸No.1522至1527是用于克隆的EcoRI识别序列。
已插入在pBS(FNCBD-FGF)中的杂合基因的DNA片段用NdeI和EcoRI切断，并将该片段连接到表达载体pTYB1的NdeI和EcoRI部位。
由此构建的质粒命名为pTYB1(FNCBD-FGF)。
(f)制备用于FNCBD/EGF杂合多肽的表达载体存在于质粒pBS(FNCBD)中的FNCBD的cDNA片段通过用KpnI和XhoI处理(部分消化)而切除，并将该片段连接到在上述(c)中得到的质粒pBS(EGF)的KpnI和XhoI部位。
由此构建的质粒具有掺入其中的由序列表的SEQ ID NO.16代表的DNA，这种质粒命名为pBS(FNCBD-EGF)。
在序列表的SEQ ID NO.16中核苷酸No.1至6是用于克隆的KpnI识别序列，核苷酸No.5至10是NcoI识别序列，核苷酸No.11至12是用于调节表达读框的序列，核苷酸No.13至18是NdeI识别序列，核苷酸No.16至18是起始密码子序列，核苷酸No.19至1038是人FNCBD的cDNA序列，核苷酸No.1039至1044是通过XhoI-识别序列和SalI-识别序列的连接形成的核苷酸序列，核苷酸No.1042至1056是编码肠激酶识别序列(DDDDK)的核苷酸序列，核苷酸No.1057至1215是人EGF的cDNA序列，核苷酸No.1216至1218是终止密码子，和核苷酸No.1219至1224是用于克隆的EcoRI识别序列。
已插入在pBS(FNCBD-EGF)中的杂合基因的DNA片段用NdeI和EcoRI切断，并将该片段连接到表达载体pTYB1的NdeI和EcoRI部位。
由此构建的质粒命名为pTYB1(FNCBD-EGF)。
(g)确认FNCBD/bFGF杂合多肽和FNCBD/EGF杂合多肽的表达大肠埃希氏菌菌株ER2566(NEW ENGLAND BioLabs)分别用pTYB1(FNCBD)、pTYB1(FNCBD-FGF)和pTYB1(FNCBD-EGF)转化。
转化大肠埃希氏菌在2ml添加了100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中在37℃下培养过夜。将0.02ml这种前培养基接种到2ml添加了100μg/ml氨苄青霉素的SB培养基中。
培养至浊度为0.5后，向培养基中添加IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷)至1mM，培养在37℃下再进行2小时。然后收获细胞。
来自全细胞的蛋白质进行SDS-PAGE分析(12％凝胶)，凝胶用考马斯亮蓝染色。在染色的凝胶中发现了分别与FNCBD、FNCBD/bFGF杂合多肽和FNCBD/EGF杂合多肽的分子量相对应的40kDa、57kDa和46kDa的条带，从而确认了重组多肽的表达。
与此同时，在SDS-PAGE之后将凝胶也转移到硝酸纤维素膜上，该膜与特异性识别FNCBD(FNC4-4，Takara Shuzo)的单克隆抗体、特异性识别bFGF(FGF-2(C-18)，Santa Cruz Biotechnology)的单克隆抗体、和特异性识别EGF(克隆10825.1 R&D系统)的单克隆抗体反应。
然后证实了抗-人FNCBD单克隆抗体与40kDa的多肽反应，抗-人FNCBD单克隆抗体和抗-人bFGF单克隆抗体与57kDa的多肽反应，以及抗-人FNCBD单克隆抗体和抗-人EGF单克隆抗体与46kDa的多肽反应。
这些结果表明40kDa的多肽是人FNCBD，57kDa的多肽是人FNCBD/人bFGF杂合多肽(FNCBD-FGF)，而46kDa的多肽是人FNCBD/人EGF杂合多肽(FNCBD-EGF)。
已分别用质粒pTYB1(FNCBD)、pTYB1(FNCBD-FGF)和pTYB1(FNCBD-EGF)进行了转化并且证实了其的各种多肽的表达的大肠埃希氏菌ER2566(NEW ENGLAND BioLabs)分别命名为ER2566[pTYB1(FNCBD)]、ER2566[pTYB1(FNCBD-FGF)]和ER2566[pTYB1(FNCBD-EGF)]。
(h)制备表达多肽在上述(g)中得到的各种转化体在添加了100μg/ml氨苄青霉素的2mlLB培养基中在37℃下培养过夜。
将0.2ml这种前培养基接种到添加了100μg/ml氨苄青霉素的2ml SB培养基中。添加IPTG后，在37℃下进行培养，然后收获细胞。
由此收集的细胞用超声处理缓冲剂(50mM Tris-HCl缓冲剂，pH8.0，50mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA))洗涤并离心。将沉淀再次悬浮于同样的缓冲剂中，细胞通过重复6次“超声处理15秒、间隔15秒”这样的循环加以裂解。
向该裂解液中加入TritonX-100至终浓度为1％，该裂解液在4℃下以5,000rpm离心20分钟。得到的沉淀用包涵体洗涤溶液
洗涤3次。离心后，使不溶部分在室温下在8M脲溶液[8M脲；50mM Tris-HCl缓冲剂，pH8.0；1mM EDTA]中溶解1小时。接着，该溶解后的溶液在4℃下以14,000rpm离心20分钟，以收集上清液。
由此得到的上清液针对4M脲溶液和2M脲溶液这样顺序的脲溶液进行透析，最后，针对超声处理缓冲剂或针对磷酸盐缓冲剂[10mM磷酸盐缓冲剂，pH8.0；50mM氯化钠]进行透析。
透析后，上清液在4℃下以14,000rpm离心20分钟，制得溶解的重组蛋白质样品。
由此得到的样品进行SDS-PAGE，然后证实每种样品的绝大多数是由与从重组蛋白质的氨基酸计算出的分子量相对应的40kDa、57kDa或46kDa位置上的条带所指示的多肽。
实施例2生物活性的评估评估在实施例1中得到的FNCBD、FNCBD-FGF和FNCBD-EGF的胶原结合活性和细胞生长促进活性。
(a)胶原结合活性的测量FNCBD-FGF结合明胶(明胶琼脂糖4B，Amersham Pharmacia Biotech)的活性利用图3中概略阐明的分批法进行评估。
所用的重组蛋白质样品是已在实施例1中针对超声处理缓冲剂进行了透析的大约50μg/ml的FNCBD-FGF。
向1.5ml微量试管中加入500μl FNCBD-FGF和100μl明胶琼脂糖4B(其已用超声处理缓冲剂洗涤两次并制备成50％(vol/vol)的悬浮液)，该混合物在4℃下搅拌1小时。
该混合物以5000rpm离心30秒并收集上清液。向沉淀中加入500μl1M氯化钠溶液，该悬浮液以5000rpm离心30秒并收集上清液。以类似的操作，沉淀再次用1M氯化钠溶液洗涤，然后依次用1M脲、2M脲和4M脲溶液洗涤。
最后，该悬浮液在100μl SDS样品缓冲剂中在90℃下加热，以完全洗脱结合在明胶琼脂糖4B上的蛋白质。
FNCBD-FGF结合肝素(AF-Heparin Toyopearl，Tosoh)的能力也利用分批法进行评估。向1.5ml微量试管中加入500μl FNCBD-FGF和100μlAF-Heparin Toyopearl的混合悬浮液(其已用超声处理缓冲剂洗涤两次并制备成50％(vol/vol)的悬浮液)，该悬浮液在4℃下搅拌1小时。该悬浮液以5000rpm离心30秒并收集上清液。沉淀用500μl1M氯化钠溶液洗涤两次(这些上清液不进行电泳)，并在100μl SDS样品缓冲剂中在90℃下加热5分钟以洗脱结合的蛋白质。向收集的各5μl上清液中加入1μl6x浓缩的SDS样品，在90℃下加热5分钟，并进行SDS-PAGE(12％凝胶)。
在图4中显示的SDS-PAGE凝胶中，从氨基酸序列计算出的大约57kDa的FNCBD-FGF的条带未在泳道3中检测出，表明大多数FNCBD-FGF与明胶结合。
在洗涤溶液(泳道4和5)中没有检测到条带，显示FNCBD-FGF通过用1M氯化钠溶液洗涤没有从明胶上洗脱。
在1M脲和2M脲洗脱液(泳道6和7)中完全辨认不出条带，而在4M脲洗脱液(泳道8)中检测到模糊的条带。
通过用SDS缓冲剂在90℃下洗脱(泳道9)清楚地检测到了FNCBD-FGF条带。换句话说，用1M脲和2M脲没有检测到FNCBD-FGF的洗脱，用4M脲检测到部分洗脱，而用SDS缓冲剂在90℃下洗脱出了基本上全部FNCBD-FGF，由此证明了FNCBD-FGF的强明胶结合活性。
在肝素结合实验中，在泳道10中没有检测到57kDa条带，提示大多数FNCBD-FGF与肝素结合。
在SDS缓冲剂中在90℃下加热后检测到从肝素上洗脱的FNCBD-FGF(泳道11)。由此证明了FNCBD-FGF的肝素结合活性。换句话说，FNCBD-FGF中的bFGF部分具有与天然bFGF类似的三维结构，提示bFGF的生理活性被保留。
如上所证明，强明胶结合活性保留在FNCBD-FGF的FNCBD部分中，而肝素结合活性保留在FNCBD-FGF的bFGF部分中。
通过如图5中概略描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)，评估了FNCBD、FNCBD-FGF和FNCBD-EGF对牛胶(Sigma)、牛天然胶原(I-AC，Koken)、牛不全胶原(I-PC，Koken)和牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的结合活性。
首先，将存在于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的明胶、天然胶原、不全胶原和血清白蛋白的100μg/ml溶液分别以200μl/孔分配到平底96孔ELISA平板的各孔中，使该平板在4℃下静置过夜。
抛弃溶液，各孔用3％血清白蛋白在4℃下封闭1天。
各孔用含有0.05％吐温20的PBS(PBS-吐温)洗涤3次，并将100μl用PBS稀释的FNCBD、FNCBD-FGF和FNCBD-EGF溶液分别分配到孔中，使溶液在37℃下静置1小时。
各孔用PBS-吐温洗涤3次，将以1∶1000稀释的100μl抗-人FNCBD单克隆抗体(Takara Shuzo)分配到各孔中并使之在室温下静置1小时。各孔用PBS-吐温洗涤3次，将以1∶1000稀释的100μl过氧化物酶缀合抗-小鼠免疫球蛋白多克隆抗体(Dako Japan)分配到各孔中并使之在室温下静置1小时。各孔用PBS-吐温洗涤6次后，将含有1mg/ml邻苯二胺和0.03％过氧化氢的0.1M柠檬酸盐缓冲剂，pH4.7分配到各孔中并使之静置10分钟。然后通过加入50μl 4N硫酸使反应终止并测量492nm下的吸收。
图6显示了当1μg/ml FNCBD分别与固定在各孔中的明胶、天然胶原、不全胶原或血清白蛋白反应时的结果。当固定血清白蛋白时，吸收为0.08，而当固定明胶、天然胶原和不全胶原时，吸收分别为2.27、2.08和1.93，它们比在血清白蛋白情况下的吸收高10倍以上。
图7显示了当0.1μg/ml FNCBD-FGF分别与固定在各孔中的明胶、天然胶原、不全胶原和血清白蛋白反应时的结果。在明胶、天然胶原和不全胶原情况下的吸收分别为1.60、2.12和2.20，而在血清白蛋白情况下的吸收为0.27。
如上所述，FNCBD-FGF对明胶、天然胶原和不全胶原的结合活性显著高于FNCBD-FGF对血清白蛋白的结合活性。
如图8中所示，当FNCBD-EGF以类似方式分别与血清白蛋白、明胶、天然胶原和不全胶原反应时，吸收为0.11、1.54、1.66和1.54。FNCBD-EGF对固定化明胶、天然胶原和不全胶原的结合活性明显高于FNCBD-EGF对血清白蛋白的结合活性。
ELISA中吸收的增加与结合活性的增加相关。既然FNCBD与固定化明胶、天然胶原和不全胶原反应后的吸收比FNCBD与其结合可被认为是非特异性结合的固定化血清白蛋白反应后的吸收高大约20倍，那么FNCBD与胶原的反应可认为是特异性反应(图6)。类似地，如图7中显示的FNCBD-FGF与固定化明胶和胶原的反应以及FNCBD-EGF与固定化明胶和胶原的反应(图8)可认为是特异性反应。这意味着在本发明中通过基因工程方式生产的多肽是其中生长因子已与生理活性多肽融合而FNCBD固有的胶原结合能力没有损失的分子。总之，有可能通过生产杂合多肽将胶原结合活性赋予生长因子。
(b)细胞生长促进活性的测量还评估在上述(a)中显示出胶原结合活性的FNCBD、FNCBD-FGF和FNCBD-EGF的细胞生长促进活性。
(b-1)小鼠成纤维细胞系将BALB/c3T3细胞(小鼠成纤维细胞系)悬浮于含有3％胎牛血清(FBS)的Iscove修饰的Dulbecco培养基(IMDM)中，并将该悬浮液以2×103细胞/孔分配在24孔平板中。细胞在37℃下培养5小时。
然后将培养基改变为含有0.6％FBS的IMDM培养基，细胞在37℃下再培养24小时。
然后向细胞培养物中分别加入FNCBD、FNCBD-EGF和EGF并在37℃下继续培养4天。向培养基中添加1/10体积的WST-1试剂(BoeringerManheim K.K.)，并在37℃下继续培养3小时。
将培养基转移到96孔微量滴定板上，并用微量平板阅读器测量450nm下的吸收，以评估细胞生长促进活性。
如图9中所示，FNCBD-EGF显示出对BALB/c3T3细胞的浓度依赖性细胞生长促进活性，且FNCBD-EGF的活性远远超过EGF的活性。FNCBD也显示出一些对BALB/c3T3细胞的细胞生长促进活性。
从如上所述的结果可以得出结论EGF的活性不是通过EGF与FNCBD的融合降低的。从FNCBD显示出一些细胞生长促进活性和FNCBD-EGF显示出超过EGF的细胞生长促进活性这些事实还表明FNCBD-EGF的细胞生长促进活性是FNCBD的活性和EGF的活性的总和。
(b-2)人成纤维细胞将人成纤维细胞悬浮于含有3％FBS的IMDM中，并将该悬浮液以5×103细胞/孔分配在24孔平板中。细胞在37℃下培养5小时。
然后将培养基改变为含有0.6％FBS的IMDM，细胞在37℃下再培养24小时。
然后将FNCBD和FNCBD-FGF加入到细胞培养物中，在37℃下继续培养4天。向培养基中添加1/2体积的XTT试剂(Boeringer Manheim K.K.)，并在37℃下继续培养6小时。将培养基转移到96孔微量滴定板中，测量在492nm下的吸收来评估细胞生长促进活性。
如图10中所示，FNCBD-FGF显示出对人成纤维细胞的浓度依赖性细胞生长促进活性。FNCBD也显示出一些对人成纤维细胞的细胞生长促进活性，尽管该活性比BALB/c3T3细胞情况下的活性弱。
从如上所述的结果可以得出结论bFGF的细胞生长促进活性没有减小，同时FGF被赋予了胶原结合活性。
(b-3)NRK49F细胞在下文中的实施例中，所用的重组蛋白质样品是已用明胶琼脂糖4B纯化并针对磷酸盐缓冲剂透析的那些。将NRK49F细胞(大鼠成纤维细胞系)悬浮于含有2％FBS的Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)中，并将该悬浮液以1×104细胞/孔分配到24孔平板中。细胞在37℃下培养7小时。然后将连续5次稀释的FNCBD、FNCBD-EGF和EGF分别加入到细胞培养物中(一式三孔)，在37℃下继续培养4天。向培养基中添加1/10体积的WST-1试剂(Dojin Kagaku Kenkyujo)，在37℃下继续培养3小时。将培养基转移到96孔微量滴定板中，测量在450nm下的吸收来评估细胞生长促进活性。
如图11中所示，FNCBD-EGF显示出对NRK49F的浓度依赖性细胞生长促进活性，其可比得上EGF的细胞生长促进活性。另一方面，FNCBD没有显示出对NRK49F细胞的细胞生长促进活性。因此可以得出结论EGF的活性没有通过EGF与FNCBD的融合而损失。
实施例3杂合生长因平/胶原复合材料的功能本发明的胶原结合生长因子和原始生长因子在用胶原孵育后对比彼此的功能。
(a)生长因子/胶原复合材料的细胞生长促进活性将FNCBD-EGF用作胶原结合生理活性多肽的实例，其胶原结合活性和细胞生长促进活性已在实施例1和2中得到证实。如图12中概略描述，评估FNCBD-EGF与胶原结合后(FNCBD-EGF/胶原复合材料)的细胞生长促进活性。首先，将存在于HCl，pH3.0中的3mg/ml不全胶原溶液以500μl/孔分配到24孔平板的各孔中，并使该溶液在4℃下静置过夜。将溶液抛弃，各孔用PBS-吐温洗涤4次，用PBS洗涤2次，用无血清的DMEM洗涤1次。接着，将用无血清的DMEM连续稀释的250μlFNCBD-EGF或EGF溶液(2.5nM，5nM，10nM，20nM或40nM)分配在各孔中，并使溶液在37℃下静置2小时。将溶液抛弃，各孔用PBS-吐温洗涤2次，用PBS洗涤6次，用Hanks溶液洗涤1次。将人角质细胞悬浮于添加了牛垂体提取物(BPE)的无血清的角质细胞基础培养基(KBM2)中，然后将该悬浮液以104细胞/0.5ml/孔分配到24孔平板的各孔中。如果100％的FNCBD-EGF或EGF被包被在孔中的胶原保留的话，终浓度将是1.25nM，2.5nM，5nM，10nM或20nM。人角质细胞在这样的条件下在37℃下培养4天。向培养基中添加1/10体积的WST-1，在37℃下继续培养3小时。将培养基转移到96孔微量滴定板中，测量450nm下的吸收来评估细胞生长促进活性。
如图13中所示，FNCBD-EGF显示出对人角质细胞的浓度依赖性细胞生长促进活性，而EGF则没有。在细胞生长促进活性方面的这种差异据判断是FNCBD-EGF和EGF间的胶原结合能力有差异的结果。由此表明FNCBD-EGF是胶原结合生理活性多肽，它在与胶原结合后或者通过保留其与胶原的结合或者通过逐渐从胶原中释放而显示出EGF活性。
此外，具有结合其上的FNCBD-EGF的胶原是包括胶原结合EGF和来自胶原的多肽(与EGF结合的胶原)的生物材料的实例。如上所述的人角质细胞培养的方法是其中刺激细胞的生长活性或其他生理活性的一个实例。
(b)对比FNCBD-EGF和EGF与不同胶原类型的结合活性FNCBD-EGF和EGF对胶原的结合活性通过使用ELISA进行比较。首先，在平底96孔平板的各孔中以200μl/孔分配存在于HCl(pH3.0)、BSA或Block Ace(封闭剂)中的I、II、III或IV型不全胶原的3mg/ml溶液，并使该平板在4℃下静置过夜。将溶液抛弃，各孔用PBS-吐温洗涤6次。然后向各孔中分别添加100μl用无血清的DMEM连续稀释的FNCBD-EGF溶液(1.25nM，2.5nM，5nM，10M和2nM)或EGF溶液(1.25nM，2.5nM，5nM，10nM和20nM)，使各孔在37℃下静置2小时。各孔用PBS-吐温洗涤3次后，使100μl用PBS以1∶1000稀释的抗-人EGF单克隆抗体在室温下静置1小时。各孔用PBS-吐温洗涤3次后，将100μl以1∶1000稀释的过氧化物酶缀合抗-小鼠免疫球蛋白多克隆抗体分配在各孔中，并使溶液在室温下静置1小时。最后，各孔用PBS-吐温洗涤6次，并向各孔中分配含有1mg/ml邻苯二胺和0.03％过氧化氢的0.1M柠檬酸盐缓冲剂，pH4.7。静置大约10分钟后，用50μl 4N硫酸终止反应，并测量492nm下的吸收。
所测得的吸收的值显示在图14中。竖轴代表根据吸收的胶原结合活性，而横轴指示的是FNCBD-EGF或EGF的浓度。当对孔的吸收指定无FNCBD-EGF为0(对照孔)时，在用I、II、III或IV型不全胶原包被并用FNCBD-EGF孵育的孔中，吸收以浓度依赖性方式增加。与此对照，在从1.25nM至20nM的浓度下，用胶原包被并用EGF孵育的孔的吸收基本上与对照孔的吸收相同。既然ELISA中吸收的增加与结合活性相关，就证明其中EGF与FN的胶原结合结构域相连的FNCBD-EGF具有显著高于原始EGF的对各型胶原的结合活性。因此证实在实施例3(a)中证明的FNCBD-EGF的促进人角质细胞生长的活性是由其胶原结合活性介导的。换句话说，FNCBD-EGF能够在胶原被固定的特定部位显示出细胞生长促进活性。
如前述实施例中所证明，在本发明的胶原结合生理活性肽中，已能够实现胶原的在某位点的保留或从某位点的持续释放以及导向到某位点。应当注意原始生理活性肽不具有这样的能力，且通过本发明已在其生理活性没有损失的条件下实现了这种能力。
(c)生长因子/胶原复合材料的细胞生长促进活性的长期稳定性将FNCBD-EGF用作胶原结合生长因子的例子，其胶原结合活性和细胞生长促进活性已得到证实。FNCBD-EGF在与胶原结合后(FNCBD-EGF/胶原复合材料)评估其细胞生长促进活性。首先，将存在于HCl(pH3.0)中的1mg/ml不全胶原溶液以500μl/孔分配在24孔平板的各孔中，使该溶液在4℃下静置过夜。将溶液抛弃，各孔用PBS-吐温洗涤4次，用PBS洗涤2次，并用无血清的IMEM洗涤1次。接下来，将用无血清的DMEM稀释至8pM、40pM、200pM和1000pM的250μlFNCBD-EGF溶液一式三份分配到各孔中，并使溶液在37℃下静置2小时。将溶液抛弃，各孔用PBS洗涤2次，用DMEM洗涤1次。向各孔中添加500μl/孔的DMEM，并使溶液在37℃下静置1周。与此同时，将用无血清的DMEM培养基稀释至8pM、40pM、200pM和1000pM的250μlEGF溶液一式两份分配到各孔中，并使溶液在37℃下静置2小时。将溶液抛弃，用FNCBD-EGF或EGF孵育的各孔用PBS-吐温洗涤2次，用PBS洗涤6次，用DMEM洗涤1次。接着，将NRK49F大鼠成纤维细胞悬浮于含有2％FBS的DMEM中，并将该悬浮液以104细胞/0.5ml/孔分配到24孔平板的各孔中。假定100％的FNCBD-EGF或EGF被包被在孔上的胶原保留，则终浓度将是4pM、20pM、100pM和500pM。NRK49F细胞在这样的条件下在37℃下培养4天。向培养基中添加1/10体积的WST-1试剂后，细胞在37℃下继续再培养3小时。将培养基转移到96孔微量滴定板上，测量在450nm下的吸收来评估细胞生长促进活性。
如图15中所示，FNCBD-EGF显示出浓度依赖性细胞生长促进活性，而EGF则没有。据判断这是FNCBD-EGF和EGF的胶原结合能力存在差异的结果。还显示FNCBD-EGF甚至在37℃下孵育1周后仍保留了其胶原结合活性和EGF活性，且FNCBD-EGF在与胶原结合后或者通过保留其与胶原的结合或者通过逐渐从胶原中释放而显示出其EGF活性。这些结果表明对活组织给药的FNCBD-EGF能够显示出其生理活性来促进细胞、组织和器官的生长、分化、再生或合成活性。
(d)在高浓度蛋白质的存在下FNCBD-EGF和EGF的胶原导向活性的对比FNCBD-EGF和EGF对胶原的导向活性通过使用ELISA进行对比。首先，在平底96孔平板的各孔中添加200μl/孔的存在于HCl，pH3.0中的I型不全胶原的3mg/ml溶液，并使该平板在4℃下静置过夜。将溶液抛弃，各孔用PBS-吐温洗涤6次。然后向各孔中添加用含有80mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的DMEM分别稀释到2nM、4nM和8nM的100μlFNCBD-EGF溶液或EGF溶液，并使各孔在37℃下静置1小时。各孔用PBS-吐温洗涤3次后，加入以1∶1000稀释的100μl抗-人EGF单克隆抗体，并使该溶液在室温下静置1小时。各孔用PBS-吐温洗涤3次后，在各孔中分配以1∶1000稀释的100μl过氧化物酶缀合抗-小鼠免疫球蛋白多克隆抗体，并使该溶液在室温下静置1小时。最后，各孔用PBS-吐温洗涤6次，并向洗涤后的各孔中分配含有1mg/ml邻苯二胺和0.03％过氧化氢的0.1M柠檬酸盐缓冲剂，pH4.7。静置大约10分钟后，用50μl 4N硫酸终止反应，并测量平板在492nm下的吸收。
所测得的吸收的值显示在图16中。竖轴代表根据吸收的胶原结合活性，而横轴指示的是FNCBD-EGF或EGF的浓度。在高浓度的BSA的存在下，FNCBD-EGF与胶原的结合以浓度依赖性方式增加。与此对照，EGF显示基本上不与胶原结合。于是可证明其中EGF与纤连蛋白的胶原结合结构域相连的FNCBD-EGF在高浓度的蛋白质溶液中具有显著高于原始EGF的胶原导向活性。这又意味着FNCBD-EGF能够特异性地导向其中蛋白质以高浓度存在的组织中的胶原并能够以局部方式显示出细胞生长促进活性。
如前述实施例中所证明，通过本发明的胶原结合生理活性肽已能够实现胶原的在某位点的保留或从某位点的持续释放以及导向到某位点，且应当注意到原始生理活性肽不具有这样的能力，而现已在其生理活性没有损失的条件下实现了这种能力。还证明本发明构成了一种新颖的药物释放系统。
(e)血浆FN对FNCBD-EGF的持续释放或局部保留性能的影响FNCBD-EGF在血浆FN的存在下从胶原的持续释放和释放性能通过使用ELISA进行研究。首先，在平底96孔平板的各孔中添加200μl/孔的存在于HCl(pH3.0)中的I型或IV型不全胶原的3mg/ml溶液，并使该平板在4℃下静置过夜。将溶液抛弃，各孔用PBS-吐温洗涤6次。然后向各孔中添加用DMEM稀释到20nM的100μl FNCBD-EGF溶液，并使各孔在37℃下静置90分钟。各孔用PBS-吐温洗涤3次后，加入用PBS稀释至20、40、80、160、320、640和1280nM浓度或用BSA进行相同倍数稀释的100μl FN溶液，并使该溶液在37℃下静置90分钟。各孔用PBS-吐温洗涤3次后，在各孔中分配以1∶1000稀释的100μl过氧化物酶缀合抗-小鼠免疫球蛋白多克隆抗体，并使该溶液在室温下静置1小时。最后，各孔用PBS-吐温洗涤6次，并加入含有1mg/ml邻苯二胺和0.03％过氧化氢的0.1M柠檬酸盐缓冲剂(pH4.7)。静置大约10分钟后，用50μl4N硫酸终止反应，并测量平板在492nm下的吸收。
所测得的吸收的值显示在图17中。竖轴代表根据吸收的胶原结合活性，而横轴指示的是FNCBD-EGF与FN的摩尔浓度比的浓度。在其中FN以20、40、80、160、320、640和1280nM的浓度存在于用I型胶原包被的孔中的情况下，吸收的值与FN的浓度相关联地下降。既然ELISA中的吸收与和胶原结合的FNCBD-EGF的量相关联地减少，就证明其中EGF和纤连蛋白的胶原结合结构域融合的FNCBD-EGF的胶原结合活性受到FN的竞争性抑制。因此，非常有可能当FNCBD-EGF一旦与体内或活体表面上的胶原结合后就通过血浆FN特异性地释放。
如前述实施例中所证明，胶原结合生理活性多肽当与血浆、血清或血液接触时，或者共同存在或加入了血浆、血清或血液时，就从胶原中逐渐释放，而在缺乏血浆、血清或血液时，即在缺乏生理活性多肽诸如生长因子时，它就保留在胶原中。还证明本发明构成了一种新颖的药物释放系统，其中生理活性肽定向于胶原，并由此经过可控地保留在胶原中或从胶原持续释放而定向生理活性肽。
本发明的优点其中维持了生理活性肽的活性并被赋予了对胶原的结合活性的胶原结合生理活性多肽可用于构成生理活性肽的药物释放系统(DDS)。另外，胶原结合生理活性多肽可以与胶原结合，且所得经过功能修饰的胶原基质可用作新的用于组织再生的生物材料。
序列表<110>Terumo Corporation<120>具有胶原结合活性的功能性杂合多肽F<130>19990120<140><141><160>16<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>343<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明修饰人纤连蛋白胶原结合结构域<220><221>INIT_MET<222>(1)<220><221>结构域<222>(2)..(341)<223>/注释＝″修饰人纤连蛋白胶原结合结构域″<220><221>CONFLICT<222>(69)<220><221>CONFLICT<222>(125)<400>1Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr1 5 10 15Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln20 25 30Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly35 40 45Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly50 55 60Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly Arg65 70 75 80Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu Trp85 90 95Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe Cys100 105 110Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn Gly115 120 125Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr Asp130 135 140Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp 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Glu340<210>2<211>159<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明具有肠激酶识别序列的人碱性成纤维细胞生长因子<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>/注释＝″肠激酶识别序列″<220><221>肽<222>(6)..(159)<223>/注释＝″人成纤维细胞生长因子″<400>2Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu1 5 10 15Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp20 25 30Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His35 40 45Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile50 55 60Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly65 70 75 80Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu85 90 95Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu100 105 110Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr115 120 125Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly130 135 140Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155<210>3<211>58<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明具有肠激酶识别序列的人表皮生长因子<220><221>肽<222>(1)..(5)<223>/注释＝″肠激酶识别序列″<220><221>肽<222>(6)..(58)<223>/注释＝″人表皮生长因子″<400>3Asp Asp Asp Asp Lys Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp1 5 10 15Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp20 25 30Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln35 40 45Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg50 55<210>4<211>501<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明人纤连蛋白胶原结合结构域和人碱性成纤维细胞生长因子杂合多肽<220><221>INIT_MET<222>(1)<220><221>结构域<222>(2)..(341)<223>/注释＝″修饰人纤连蛋白胶原结合结构域″<220><221>肽<222>(343)..(347)<223>/注释＝″肠激酶识别序列″<220><221>肽<222>(348)..(501)<223>/注释＝″人成纤维细胞生长因子″<400>4Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr1 5 10 15Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln20 25 30Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly35 40 45Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly50 55 60Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe 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Ser500<210>5<211>400<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明人纤连蛋白胶原结合结构域和人表皮生长因子杂合多肽<220><221>INIT_MET<222>(1)<220><221>结构域<222>(2)..(341)<223>/注释＝″修饰人纤连蛋白胶原结合结构域″<220><221>肽<222>(343)..(347)<223>/注释＝″肠激酶识别序列″<220><221>肽<222>(348)..(400)<223>/注释＝″人表皮生长因子″<400>5Met Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro Tyr1 5 10 15Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met Gln20 25 30Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu Gly35 40 45Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly Gly50 55 60Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly Arg65 70 75 80Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu Trp85 90 95Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe Cys100 105 110Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn Gly115 120 125Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr Asp130 135 140Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr Thr145 150 155 160Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala Ala165 170 175His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile Gly180 185 190Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys Thr195 200 205Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser Gln210 215 220Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn Asp225 230 235 240Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr Cys245 250 255Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln Cys260 265 270Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp Glu275 280 285Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg Gly290 295 300Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser Ser305 310 315 320Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn Ser325 330 335His Pro Ile Gln Trp Leu Asp Asp Asp Asp Lys Asn Ser Asp Ser Glu340 345 350Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met355 360 365Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr370 375 380Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg385 390 395 400<210>6<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人纤连蛋白胶原结合结构域PCR有义引物<400>6gaggtaccat ggtacatatg gcagctgttt accaaccgca gcctcaccc49<210>7<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人纤连蛋白胶原结合结构域PCR反义引物<220><400>7cgggatcctt actcgagcca ctggatgggg tgggagttgg gctgac46<210>8<211>1053<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明修饰人纤连蛋白胶原结合结构域<220><221>conflict<222>(109)<220><221>conflict<222>(206)<220><221>conflict<222>(270)<220><221>conflict<222>(374)<220><221>conflict<222>(681)<400>8ggtaccatgg tacatatggc agctgtttac caaccgcagc ctcaccccca gcctcctccc 60tatggccact gtgtcacaga cagtggtgtg gtctactctg tggggatgca gtggctgaag 120acacaaggaa ataagcaaat gctttgcacg tgcctgggca acggagtcag ctgccaagag 180acagctgtaa cccagactta cggtggcaac tcaaatggag agccatgtgt cttaccattc 240acctacaatg gcaggacgtt ctactcctgc accacagaag ggcgacagga cggacatctt 300tggtgcagca caacttcgaa ttatgagcag gaccagaaat actctttctg cacagaccac 360actgttttgg 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gacattggaa g31<210>11<211>489<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明具有肠激酶识别序列的人碱性成纤维细胞生长因子<220><221>mutation<222>(228)<223>/注释＝″由聚合酶链反应引起的突变″<400>11gtcgacgacg atgataaggc agccgggagc atcaccacgc tgcccgcctt gcccgaggat 60ggcggcagcg gcgccttccc gcccggccac ttcaaggacc ccaagcggct gtactgcaaa 120aacgggggct tcttcctgcg catccacccc gacggccgag ttgacggggt ccgggagaag 180agcgaccctc acatcaagct acaacttcaa gcagaagaga gaggagtcgt gtctatcaaa 240ggagtgtgtg ctaaccgtta cctggctatg aaggaagatg gaagattact ggcttctaaa 300tgtgttacgg atgagtgttt cttttttgaa cgattggaat ctaataacta caatacttac 360cggtcaagga aatacaccag ttggtatgtg gcactgaaac gaactgggca gtataaactt 420ggatccaaaa caggacctgg gcagaaagct atactttttc ttccaatgtc tgctaagagc 480tgagaattc 489<210>12<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人表皮生长因子PCR有义引物<400>12gtgtcgacga cgatgataag aatagtgact ctgaatgtcc cctg44<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明人表皮生长因子PCR反义引物<400>13gaattcttag cgcagttccc 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1.一种胶原结合生理活性多肽，其中来自纤连蛋白的肽与生理活性肽连接，且其中所述多肽具有胶原结合活性和生理活性。
2.按照权利要求1的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽与来自纤连蛋白的肽的羧基端连接。
3.按照权利要求1或2的胶原结合生理活性多肽，其中所述来自纤连蛋白的肽相当于通过纤连蛋白的蛋白酶水解得到的且构成纤连蛋白的胶原结合结构域的氨基酸序列；与所述氨基酸序列同源的且具有胶原结合活性的氨基酸序列；或者其中在所述氨基酸序列中缺失、替代、插入或加入了一个到若干个氨基酸残基并具有胶原结合活性的氨基酸序列。
4.按照权利要求1或2所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述来自纤连蛋白的肽具有在人纤连蛋白中构成从Ala260到Trp599的多肽的氨基酸序列；与所述氨基酸序列同源的氨基酸序列；或者其中在所述氨基酸序列中缺失、替代、插入或加入了一个到若干个氨基酸残基的氨基酸序列。
5.按照权利要求1-4任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽是细胞因子或生长因子。
6.按照权利要求1-5任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽与所述来自纤连蛋白的肽通过基因工程方式连接。
7.按照权利要求1-6任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述生理活性肽与所述来自纤连蛋白的肽通过基因工程方法连接，且所述胶原结合生理活性多肽在细菌中生产。
8.按照权利要求1-7任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述胶原结合生理活性多肽可溶于水。
9.按照权利要求1-8任何一项所述的胶原结合生理活性多肽，其中所述多肽在与胶原结合后或者以与胶原结合的状态或者通过从胶原中缓慢释放而显示出其生理活性。
10.一种用于使含有权利要求1-9任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的生理活性肽或生理活性赋予剂能够局部保留或持续释放的试剂。
11.一种含有生理活性肽/胶原复合材料的生物材料，其中 1-9任何一项所述的胶原结合生理活性多肽与来自胶原的多肽结合。
12.一种用于使含有权利要求11的生物材料的生理活性肽或生理活性赋予剂能够局部保留或持续释放的试剂。
13.包括编码权利要求1-9任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的重组载体。
14.含有包括编码权利要求1-9任何一项所述的胶原结合生理活性多肽的基因的重组载体的转化体。
全文摘要
本发明提供了一种胶原结合生理活性多肽。在这种多肽中,来自纤连蛋白的肽与生理活性肽连接,且这种杂合多肽具有胶原结合活性和生理活性。还提供了一种新颖的其中杂合多肽与胶原结合的胶原基质。具有胶原结合活性和生理活性的胶原结合生理活性多肽可用作生理活性肽的药物释放系统(DDS)。另外,这种多肽可以与胶原结合而提供一种经过功能修饰的胶原基质,它作为一种新的适合用于组织再生的生物材料是非常有用的。
文档编号C07K14/50GK1347456SQ00806395
公开日2002年5月1日 申请日期2000年2月21日 优先权日1999年2月19日
发明者石川哲也, 北嶋隆 申请人:泰尔茂株式会社