白血病bcr/abl融合基因mRNA的特异性抑制剂的制作方法

专利名称：白血病bcr/abl融合基因mRNA的特异性抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种白血病基因靶向治疗剂，特别涉及一种甾体衍生物的咖 啡酸盐类。
背景技术：
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是人类发现最早的 白血病之一，发病率约为人群的每十万分之二，其年发病率呈上升的趋势。 对CML的研究和治疗，分为几个标志性阶段1960年，Nowell和Hungerford 发现了Ph染色体。1972年，Rowley发现Ph染色体是由于9号和22号染色体之间 的abl与bcr基因相互易位造成的。1982年，Klein等人证实了融合基因bcr/abl的 存在，几乎在95X以上的CML病例中，均存在bcr/abl融合基因。1990年，Daley 等人证实，将bcr/abl融合基因导入小鼠体内可诱发类似CML的疾病，从而将 bcr/abl融合基因锁定为CML的致病基因。1996年，Druker等人发现了酪氨酸激 酶抑制剂(TKI) Imatinib的抗白血病活性。2000年后，Imatinib在治疗CML 中得到了广泛的临床应用。根据机理研究，Imatinib主要是与BCR/ABL融合 蛋白结合，从而抑制了该蛋白过度活化的酪氨酸激酶活性，诱导白血病细胞 调亡。堪称第一个基因耙向治疗药物。随着该药的应用，暴露出来的主要问 题是抗药性的产生，其主要原因是由于BCR/ABL蛋白的点突变，通常位于酪 氨酸激酶的活性区域，使Imatinib不能有效地与激酶部位结合而抑制其活性， 导致约70%左右的白血病复发率。目前，为了克服这一缺点，纷纷开发出了 第二代和第三代酪氨酸激酶抑制剂，但都是针对BCR/ABL蛋白结合部位的， 尚未见有真正意义上的bcr/abl融合基因靶向抑制剂，即直接抑制bcr/abl mRNA 融合基因的表达，继而抑制BCR/ABL蛋白的表达。尽管文献报导siRNA可抑 制bcr/ablmRNA融合基因的表达，但作为药物，其在体内的稳定性尤为重要， 而siRNA由于其稳定性差而限制了其作为药物的被开发。所以，寻找bcr/abl 融合基因的特异性的抑制剂，对CML的治疗具有十分重要的应用价值。

发明内容
4本发明的目的在于提供一种bcr/abl融合基因抑制剂及其制备方法。 本发明的另一目的在于提供该化合物的药物制剂，这种制剂是以本发明 的bcr/abl融合基因抑制剂作为药物活性成分，包含一种或多种药学上可接受的 赋形剂、稀释剂等载体成份的组合物。
经过反复筛选，发明人得到一种下列化学结构式的甾体小分子化合物的 咖啡酸盐，即2卩-(4'-甲基-l'-哌嗪基)-3a-羟基-5a-甾体-17-酮咖啡酸盐，该 化合物能直接抑制bcr/abl融合基因mRNA的合成，继而抑制BCR/ABL蛋白的 表达，从而有望作为bcr/abl融合基因靶向治疗剂而用于Ph阳性(Ph+)慢性粒 细胞白血病(CML)以及Ph阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。
o
本发明bcr/abl融合基因抑制剂的制备方法为采用表雄酮(I )为起始原 料，经过烯化、环化、开环和成盐四步化学反应而得到目的化合物(V)，目 的化合物经元素分析、IR、 ^111和]^8或1^/]\^确证其化学结构为2(3- (4，-甲
基-r-哌嗪基)-301-羟基-501-甾体-17-酮咖啡酸盐。其合成路线如下由表雄酮(I )合成(II)时，将对甲苯磺酰氯在无水吡啶中反应，混 合物不分离而直接回流一步制得HI),不用毒性较大的2、 4、 6-三甲吡啶， 产率尚可。在环化反应中，产物(III)的酸性较大，应尽可能地用水洗至中 性，以免影响下一步碱开环反应。在开环反应中，水的存在可对反应起促进 作用，采用甲基哌嗪水的比例为100: 40时，可使反应时间縮短为50小时左 右。在成盐反应中，由于哌嗪基团上氮原子的碱性，较容易与咖啡酸形成有 机酸盐，产物稳定性较好，在水中有一定的溶解度。
本发明所指的包含2P- (4'-甲基-l'-哌嗪基)-301-羟基-501-甾体-17-酮咖啡 酸盐的制剂，是以现有制剂领域的常规药物制剂技术得到的各种药学上可接 受的制剂，包括各种固体口服剂，液体口服剂，注射剂等。其中固体剂包括 片剂，胶囊剂，颗粒剂，缓释片及缓释微丸等等。液体剂型包括注射剂、输 液剂、粉针剂等等。
使用本发明的药物制剂，以本发明的化合物的有效成分计，推荐成人剂 量为3mg/次，每日2 3次。通过药物临床志愿者实验表明，该剂量是安全有效 的。当然，实际的服用量可根据患者的病情、年龄、体重以及其他因素来进行调整。
本发明甾体化合物的咖啡酸盐能在bcr/abl融合基因的转录或翻译水平抑 制bcr/abl原癌基因，从而抑制BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶的活性。该化合物盐 的作用机制是通过有效抑制bcr/abl融合基因的mRNA合成，进而抑制 BCR/ABL蛋白的表达，从而抑制蛋白酪氨酸激酶的活性，最终抑制白血病细 胞的生长。
与现有的抗白血病药物酪氨酸激酶抑制剂Imatinib类药物相比，由于本发 明的化合物盐抑制bcr/abl融合基因表达的药理作用发生在mRNA水平，与 Imatinib的蛋白结合部位无关，因此能彻底克服目前Imatinib类药物的抗药性。 本发明的化合物盐有望成为真正意义上的bcr/abl融合基因耙向治疗剂而被开 发，从而为CML和Ph阳性(Ph+)慢性粒细胞白血病以及Ph阳性(Ph+)急性 淋巴细胞白血病的治疗提供一种全新化学实体。
本发明药物的原料可从市场上购得，合成方法简单可行。


图h不同浓度本发明的化合物盐处理K562细胞第5天的MTT结果。 图2:不同浓度本发明的化合物盐处理Meg-01细胞第5天的MTT结果。 图3:不同浓度本发明的化合物盐处理CML细胞第5天的MTT结果。 图4:不同浓度本发明的化合物盐处理K562/R细胞第5天的MTT结果。 图5: 1(^mol/L浓度本发明的化合物盐处理不同白血病细胞第3天的bcr/abl mRNA表达结果。
图6: 10^mol/L浓度本发明的化合物盐处理不同白血病细胞第5天的 BCR/ABL蛋白表达结果。
图7: 1 (^mol/L浓度本发明的化合物盐处理不同白血病细胞第5天的PTK 活性结果。
具体实施例方式
以下的实施例均为对该发明作进一步的解释，并不以任何方式对该发明 的范围加以限制。
实施例l制备本发明的2e-(4'-甲基-l，-哌嗪基)-3"羟基-5(1-甾体 -17-酮咖啡酸盐(V)
(1)由表雄酮(I )为原料制备5a-甾体-2-烯-17-酮(II)表雄酮(I ) 4g (14mmol)溶于无水吡啶20ml中，加入对甲苯磺酰氯 4.6g(24mmo1)，搅拌反应3h后回流4h，回收吡啶后得半固体物。加入水溶液析 出固体，滤集后重结晶得白色结晶，收率60%左右，mp.l04-105°C， IR (KBr) cm" 3010 (OCH)， 1735 (OO)， 1650 (C=C)。
(2) 2a， 3a-环氧-5a-甾体-17-酮(III)的制备 将8。/。过氧乙酸17ml、水14ml和醋酸钠1.7g混合，滴加II的氯仿溶液(1.7g
溶于13ml氯仿中)。搅拌反应17h，分离有机层，洗至中性，浓縮后的固体， 重结晶后得白色结晶，收率约70%， mp.l25-127°C， IR(KBr)cm" 1735(C=0)， 810 (C-O画C)。
(3) 2卩-(4，-甲基-1'-哌嗪基)-301-羟基-501-甾体-17-酮(IV)的制备 将III l.Og (3.5mmo1)在N-甲基哌嗪5ml和水2ml中回流50h，回收N-甲
基哌嗪，加水溶液析出固体，滤集，重结晶后收率约40%， mp.l70-171。C， 元素分析C24H4(AN2，计算值。/。C 74.18， H 10.38， N7.21，实测值。/。C 74.21， H 10.56， N6.96。 IR (KBr) cm" 3350 (OH)， 1725 (C=0)。'画R (CDC13) 5ppm0.82 (s,3H,C18-CH3)， 0.84 (s，3H，C19-CH3)， 2.26 (s，3H，N-CH3) ， 3.30 (s，lH,C3a-OH， D20交换后消失)，3.85 (m,lH,C邓-H)。
(4) 2P- (4，-甲基-1，-哌嗪基)-3(!-羟基-501-甾体-17-酮咖啡酸盐(V)的
制备
将等摩尔量的IV和咖啡酸溶于70。/。的乙醇，析出白色结晶，重结晶后收率 约为50%， mp.228-229°C ， LCZMS检领!l为单峰，MS m/z 3 89(M+1 ), 371 (M-OH)， 181 (盐基M+1)， 163 (盐基M-OH)。
实施例2本发明化合物盐类口服片剂的制备
每片含本发明的化合物盐3mg，片剂组成如下
成份 mg/片
化合物V 3.0
微晶纤维素 120.0
淀粉 80.0
硬脂酸镁 6.0
将以上成份混匀(除硬脂酸镁外)，过120目筛，加入温热蒸馏水搅拌， 然后制粒，干燥，加入硬脂酸镁混匀，压片即得。 实施例3本发明化合物盐口服胶囊剂的制备每囊含本发明的化合物盐3mg，胶囊组成如下:
将以上成份混匀，过ioo目筛，加入温热蒸馏水搅拌制软材，过筛制粒，
干燥后填充入胶囊即得。
实施例4本发明化合物盐注射剂的制备 每安瓿lml溶液含发明的化合物盐lmg，注射剂组成如下
将原料溶于注射用水，无菌过滤，分装于安瓿中，使药物含量为lmg/m1/ 安瓿，灭菌即得。由于该化合物已成盐，溶液pH值接近中性，可供肌肉注射 或加入输液剂中静脉滴注。
药效学实施例
本发明化合物盐类抗白血病的生物学活性及药效学结果通过下述实验表
明
(一)、抑制白血病细胞增殖的效果
1、方法取指数生长期的白血病细胞系K562、 Meg-01和K562/R，以及
一例来自临床慢粒白血病患者的外周血经淋巴细胞分离液分离的临床原代慢 粒白血病细胞(CML)。 K562为红系来源的人类慢粒白血病细胞系，Meg-Ol 为巨核系来源的人类慢粒白血病细胞系，K562/R为抗Imatinib的白血病细胞 株。以常规细胞浓度加入培养体系，处理组分别加入10'Smol/L、 10'7mol/L、 l(T6mol/L、 1(TSmol/L和l(^mol/L浓度的本发明的化合物盐，对照组(未处理 组)加入等量的无水乙醇，接种于96孔板中，每组平行种3孔，于37。C， 5%C02 湿热培养5天后离心去上清。每孔加入5mg/ml浓度的MTT lO(il及PBS 100^1， 继续培养4h后离心去上清，加入200plDMSO，于570nm测定吸光值，取3次重 复实验的均数。
PEG3000
注射用水
成份 化合物V
9计算白血病细胞生长抑制率，按公式 抑制率(1%)=[对照组-处理组]/对照组>< 100%
以该化合物不同浓度对生长抑制率作图得剂量抑制曲线，经线性回归求 得该化合物盐类的ICso值。
2、不同浓度的本发明化合物对白血病细胞的抑制结果见表l。
表l 10-8~10-4浓度本发明化合物对白血病细胞的抑制率
抑制率2p- (4，-甲基-r-哌嗪基)-301-羟基-501-(mol/L)甾体-17-酮咖啡酸盐浓度白血病细胞l(T810-710-610-510-4
K56226.83%45.16%60.45%84.320/0卯.87%
Meg-Ol63.86%70.63%75.10%80.20%87.74%
CML44.09%52.02%68.22%88.35%93.55%
K562/R18.61%36.94%61.47%75.75%92.48%
附图1~4表明MTT检测的抑制结果，其IC5o值分别为 K562(IQo"l.75x 10-6mol/L， Meg-01 (IC50)=2.72x 10-9mol/L， CML(IC50)=4.30xl(r7 mol/L， K562/R(IC50)=3.65xl(r6 mol/L。 实验结果表明本发明的化合物盐类对K562， Meg-01和K562/R抗药株以
及原代慢粒白血病细胞均有较好的抑制活性(P〈0.01)。 (二)、抑制白血病细胞融合基因bcr/ablmRNA表达的效果
1、方法收集经本发明化合物盐(10-6mol/L)处理3天的白血病细胞106
个，用Trizol提取细胞总RNA，经电泳检测可见28s、 18s及5s条带，260nm/280nm
比值在1.8-2.0之间。RT反应步骤如下 配制退火混合物
RNA 2pg 0.5|ig/nl Oligo (dT) 18 1 |il
加无RNA酶的H20至总体积10 pl 混合液在7(TC水浴3分钟，降到37'C放置10分钟。 RT反应液
10xRT缓冲液 2^1 2.5 mM dNTP混合液 4 nlRNA酶抑制剂 1 pi
MMLV反转录酶 1 pi
混合后37T:恒温1分钟。
力口10pl的RT反应液到10nl退火混合物中，37i:水浴60分钟，加热到95匸 维持5min。得RT终溶液即为cDNA溶液，置冰浴待用。
几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反 应体系。
体系配置如下
dNTP (2.5mMeach)2.5 pl
10 x PCR缓冲液2.5 pl
MgCl2溶液1.5 pl
Taq聚合酶1.0 units
Sybergreen I终浓度0.25x
lOpM的PCR特异引物F1 pi
10pM的PCR特异引物R1 pi
cDNAorDNA1 |il
加水至总体积为25 pi
轻弹管底将溶液混合，5000 rpm短暂离心。配置PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR反应。
2、结果实时定量PCR时各样品加样量均为ljil，由于受RNA浓度定量误 差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的lpl体积的cDNA其含量并不 完全相同，为校正此差异，使用管家基因beta-actin (不同样品间表达量基本 恒定)作为内参，以样品待测基因得值除以此样品内参得值，最终得到的比 值为样品的待测基因相对含量。附图5所示为l(^mol/L浓度本发明的化合物盐 处理不同白血病细胞第3天的bcr/abl mRNA表达结果。表2为待测基因以内参 校正列表(bcr/ablmRNA)，处理组与对照组比较，P值均小于O.Ol。 表2 处理组与对照组bcr/abl mRNA的RT-PCR结果比较
对照组(X10—2)处理组(X10-2)
K5624.36±0.152.04±0.11
Meg-Ol5.97±0.912.88±0.33
11CML 4.79±0.34 2.25±0.36
K562/R 6.81±0.88_3.72±0.15_
(三)、抑制白血病细胞融合基因BCR/ABL蛋白表达的效果
方法收集经本发明化合物盐(l(T6mol/L)处理5天的白血病细胞，用预 冷的PBS清洗细胞2次，离心倾去PBS。配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂(lml 抽提试剂中加入5Hl蛋白酶抑制剂混合液，5HlPMSF和5pl磷酸酶混合液)。细 胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(1(^个细胞中加入lml抽提试 剂；5xl()e个细胞中加入0.5ml抽提试剂)，轻轻摇动5分钟。转移细胞悬浮液到 离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。裂解液于预冷的离心机中12,000 xg 离心15分钟。弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。测量562 nm附近(540-590nm皆可以使用)的吸收值。测得的每个标准孔和待测样品 孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值，以校正过的BSA标准蛋白562 rnn 测量值对其浓度(^g/ml)做图绘制标准曲线。使用标准曲线定量待测样品蛋
白浓度。
样品准备
上样染液(Laemmli上样染液) 3x储存液
1MTris-ClpH6.8 2.4 ml
20% SDS 3ml
甘油(100%) 3ml
(3巯基乙醇 1.6 ml
溴酚蓝 0.006 g
总体积 10ml (储存于4。C)
准备lx上样缓冲液的样品液如6 pl蛋白样品加入3 )ll 3x上样染液储存 液。每孔配制含50吗总蛋白样的样品液。上样前煮沸3分钟。加入电泳缓冲液， 上样。凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用lx电泳缓冲液清洗。上、下层电泳 槽中加入lx电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端l 2cm。 BioRad电泳槽中需加入500 ml的lx电泳缓冲液(50 ml的10x储存液+ 450 ml dH20)。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准 加进第一个孔中。
电泳使用BioRad电泳装置，样品首先在80V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端。然后120V恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4X:。准 备好Bio-Rad蛋白转移装置夹板，凝胶用lx转移缓冲液稍微清洗。吸水纸，滤
纸(比凝胶稍微大一些)用lx转移缓冲液预湿，如下顺序装配于转移装置上 吸水纸-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-吸水纸，于200 mA恒流条件下，4。C转移 2h。
lx转移缓冲液
Tris碱 15.14g 甘氨酸 72.07g 甲醇 1L 加水至总体积为 5L
膜在5% BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。封闭过的 膜加入一级抗体C-Abl4。C过夜，抗原抗体结合。TBST洗膜3次，每次5分钟。 加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体，及HRP标记的抗生物素抗体以结合 分子量标准，室温孵育膜l小时。TBST洗膜3次，每次5分钟。将膜置于反应 液中室温孵育3分钟。KCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液。
去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X光胶片曝光。图片扫描保存 为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。结果 如图6所示。在BCR/ABL蛋白的表达中，处理组与对照组比较，P值均小于O.Ol， 具体见表3。
表3处理组与对照组BCR/ABL蛋白表达的结果比较
_对照组 处理组
K562 1.84±0.03 0.54±0.01 Meg-Ol 1.39±0.04 0.61±0.04 CML 2.89±0.32 0.84±0.01 K562/R 2.07±0.14 0.48±0.05 四、抑制白血病细胞融合基因BCR/ABL蛋白酪氨酸激酶活性的效果
1、方法将本发明化合物盐l(^mol/L浓度处理的白血病细胞裂解后，加 入c-ABL抗体，加入蛋白A吸附免疫复合物。经SDS-PAGE电泳分离后，将蛋 白条带转移至膜上，分别用抗p-Tyr和actin的抗体进行杂交，再加入连有HRP 的二抗体，然后以DAB显色并扫描进行半定量测定。以磷酸化酪氨酸底物的相对量来代表BCR/ABL酪氨酸激酶的活性强度。
2、结果处理组与对照组蛋白酪氨酸激酶的活性(PTK活性)测定结果 如附图7所示，见表4。在蛋白酪氨酸激酶的活性测定中，处理组与对照组比 较，P值均小于0.01。
表4处理组与对照组蛋白酪氨酸激酶的活性(PTK活性)测定结果
_对照组 处理组
K562 1.22±0.04 0.33±0.01 Meg-Ol 1,56±0.03 0,45±0,04 CML 1.82±0.05 0.77±0.01 K562/R 1.66±0.05 0.29±0.0权利要求
1. 一种化合物，其特征在于该化合物是由2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-3α-羟基-5α-甾体-17-酮和咖啡酸反应成盐得到的，具有下列化学结构式
2. 权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于将等摩尔的2(3- (4'-甲基-l，-哌嗪基)-3(1-羟基-501-甾体-17-酮和等摩尔的咖啡酸溶于乙醇， 析出白色结晶，即得本发明的化合物。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 以表雄酮(I )为原料，溶于无水吡啶中，加入对甲苯磺酰氯，搅 拌反应，回收吡啶后得半固体物；加水析出固体，滤集后重结晶得 白色结晶(II);(2) 将8%过氧乙酸、水、和醋酸钠混合，滴加的(II)氯仿溶液，搅拌 反应后，分离有机层，洗至中性，浓縮后的固体重结晶后得白色结晶(m);(3) 将结晶(III)在N-甲基哌嗪和水中回流，回收N-甲基哌嗪，加水析 出固体，滤集后重结晶得产物(IV);(4) 将等摩尔量的(IV)和咖啡酸溶于70%的乙醇，析出白色结晶，即 得本发明的化合物。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中N-甲基哌嗪和水的摩尔比为10: 4。
5. 权利要求1所述化合物在抑制白血病bcr/abl融合基因mRNA表达中的 应用。
6. 权利要求1所述化合物在制备治疗Ph阳性(Ph+)慢性粒细胞白血病以 及Ph阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病药物中的应用。
7. 权利要求1所述化合物的药学可接受形式的制剂。
8. 权利要求7所述的药物制剂在抑制白血病bcr/abl融合基因mRNA表达 中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种白血病bcr/abl融合基因靶向小分子抑制剂，该化合物是由2β-(4’-甲基-1’-哌嗪基)-3α-羟基-5α-甾体-17-酮和咖啡酸反应成盐得到。该化合物盐通过有效抑制bcr/abl融合基因的mRNA合成，进而抑制BCR/ABL蛋白的表达，从而抑制蛋白酪氨酸激酶的活性，最终抑制白血病细胞的生长。本发明的化合物盐有望成为真正意义上的bcr/abl融合基因靶向治疗剂而被开发，从而为CML和Ph阳性(Ph⁺)慢性粒细胞白血病以及Ph阳性(Ph⁺)急性淋巴细胞白血病的治疗提供一种全新化学实体。
文档编号C07J43/00GK101456890SQ20081014398
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者群 何, 君 张, 甄焕英, 俊 董 申请人:中南大学