使用羧基官能化超顺磁性纳米团簇的磁性分离方法
【专利说明】使用羧基官能化超顺磁性纳米团簇的磁性分离方法
【背景技术】
[0001] 通常期望分析各种临床样品、食品样品、环境样品或其他样品中是否存在细菌或 其他微生物。
【发明内容】
[0002] 总而言之，本文公开了一种方法，该方法包括：使多个羧基官能化超顺磁性纳米团 簇与可能包含至少一种微生物菌株的液体样品接触；从至少一部分液体样品磁性分离至少 一些羧基官能化超顺磁性纳米团簇；以及分析磁性分离的超顺磁性纳米团簇用于证实至少 一种微生物菌株已非特异性结合到其上。
【具体实施方式】
[0003] 如本文所用，作为对性质或属性的修饰语，除非另外具体定义，否则术语"大体"意 指该性质或属性将容易被普通技术人员认识到，而不需要绝对精确或完美匹配（例如，对 于可计量的性质在+/-20%内）。除非另外具体定义，否则术语"基本上"意指高逼近程度 (例如，对于可计量的性质在+/-10%内），但同样不需要绝对精确或完全匹配。术语诸如相 同、相等、均匀、恒定、严格等应理解成是在通常的公差内、或适用于特定情况的测量误差， 而不需要绝对精确或完美匹配。所谓直径意指球形体的直径；或者对于不规则体来说，意指 体积与不规则体相同的球体的直径。术语诸如（甲基）丙烯酸、（甲基）丙烯酸酯等涵盖 所提及项目的丙烯酸酯型式和甲基丙烯酸酯型式两者。
[0004] 本文公开了从可存在一种或多种微生物菌株的液体样品中分离至少一种微生物 菌株的方法。该方法依赖在其表面上包含羧基官能团的超顺磁性纳米团簇，这些羧基官能 团可非特异性结合到（例如分别结合到，和/或两个一组、三个一组、四个一组或更多个一 组等结合到）一种或多种微生物（当存在时）。然后可从液体样品磁性分离超顺磁性纳米 团簇。在从液体样品分离超顺磁性纳米团簇（可能承载非特异性结合于其上的微生物）之 后，可分析这些纳米团簇用于证实至少一种微生物菌株已非特异性结合到其上。
[0005] 所谓超顺磁性意指由初级粒度小于单（磁）畴限制（例如，对于磁铁矿来说约30 纳米）的初级纳米粒子组成的铁磁材料或亚铁磁材料。在外加磁场的存在下，此类粒子可 显示出远高于常规顺磁性材料的磁化率。然而（由于这种初级纳米粒子的初级粒度极小）， 在不存在外加磁场的情况下，热效应可能会压制任何磁效应，使磁效应完全表现不出来，使 得粒子不能表现出整体永磁性能。也就是说，在移除外部磁场时，超顺磁性材料便不会表现 出任何永磁性能（就像例如由尺寸较大的粒子例如铁磁材料将表现出的那种永磁性能）。 超顺磁性材料可为例如Fe203、Fe304(磁铁矿）、Fe3S4，以及类似材料。
[0006] 所谓超顺磁性纳米团簇意指初级纳米粒子以初级纳米粒子的团簇的形式存在，这 些团簇的形状和形式分别为或多或少的永久性（也就是说，其形状和形式在诸如使纳米团 簇与液体样品接触、混合或搅拌（例如通过超声搅拌）等动作期间和之后会保持完整）。因 此，超顺磁性纳米团簇由附接例如粘结在一起形成稳定结构的初级（单畴）纳米粒子（可 例如为数十个、数百个、数千个或更多个）组成。因此，此类超顺磁性纳米团簇可区别于 由即便在一定条件下可能会暂时聚集或聚结的初级纳米粒子制成的材料（诸如铁磁流体 等），该材料容易例如通过超声搅拌分离成单独的初级纳米粒子。本文所公开的超顺磁性纳 米团簇（其最大直径可在例如50纳米至约1000纳米的范围内）还可区别于永磁粒子（即 便一些此类永磁粒子的尺寸可能与一些超顺磁性纳米团簇类似）。本文所公开的超顺磁性 纳米团簇还可区别于初级纳米粒子例如至少部分嵌入、封装或以类似方式位于有机聚合物 材料（例如聚苯乙烯）的层或壳内。在一些具体实施例中，本文所公开的超顺磁性纳米团 簇不包括有机聚合物材料（例如聚苯乙烯）的任何一部分（无论是内层、外层，还是部分涂 层等），但例如携带羧基官能团的有机聚合物除外。
[0007] 在具体实施例中，超顺磁性纳米团簇可具有至少约30纳米、60纳米、100纳米、150 纳米、200纳米、300纳米、400纳米或500纳米的直径。在另外的实施例中，超顺磁性纳米团 簇可具有至多约1〇〇〇纳米、500纳米、400纳米或200纳米的直径。
[0008] 所谓羧基官能化意指羧基官能团设置在超顺磁性纳米团簇（或其上的接合层）的 表面上容易被液体样品的液体组分接近的位置，同时羧基官能团所处的状态也容易被液体 组分接近（例如，其中使羧基基团暴露使得它们可被例如液体样品的水分子溶剂化）。所谓 羧基意指-C00H基团，应当理解，此类基团能以其中性（-C00H)形式存在，或者能以其去 质子化（-C00)形式存在，具体以何种形式存在根据例如这种基团被放置的水环境的pH。 按照定义，羧基基团不包括醛、酮、酰亚胺、聚氨酯、酰胺或酯的羰基（除非当纳米团簇与液 体样品接触时，此类基团（例如一定酯的羰基）可水解产生-C00基团），尤其是可存在于 可用于形成小珠、在小珠上提供涂层等的常规高分子量有机聚合物材料（例如聚酯、聚酰 胺等）中的此类羰基。所谓羧基官能化进一步意指羧基基团存在于厚度为约2nm或更小的 薄层中，如下文所讨论。
[0009] 如本文所公开，在使纳米团簇与液体样品接触期间，以及在从液体样品磁性分离 纳米团簇期间（术语"磁性分离"实质上意指在此类过程中，不超过约10%的羧基基团可从 纳米团簇分离），羧基基团在超顺磁性纳米团簇的表面上至少基本上保持在适当的位置。实 际上，在诸如洗涤超顺磁性纳米团簇等程序期间（执行这些程序的目的可能是诸如从纳米 团簇附近移除未结合的材料、试剂等），此类羧基官能团可至少基本上保持在适当的位置。 在一些实施例中，至少一些羧基基团可共价结合到超顺磁性纳米团簇。然而，这不是严格必 须的，只要羧基基团与超顺磁性纳米团簇的表面相关联的强度足以在本文所述的处理期间 使羧基保持在适当的位置。
[0010] 在一些实施例中，由于合成超顺磁性纳米团簇的方法，这种纳米团簇可能固有地 包含羧基官能团。在这种类型的一些实施例中，羧基官能团可由包含羧基基团的聚合物材 料（例如聚（甲基）丙烯酸、聚（甲基）丙烯酸钠等）提供，该聚合物材料存在于用于合成 超顺磁性纳米团簇的反应混合物中，并且在接触步骤和磁性分离步骤期间保持与合成的超 顺磁性纳米团簇相关联（并可能共价结合到其上）。在这种类型的其他实施例中，羧基官能 团可通过使包含羧基基团的单体材料或低聚物材料（例如（甲基）丙烯酸钠）聚合来提供， 该单体材料或低聚物材料存在于用于合成超顺磁性纳米团簇的反应混合物中，并且在合成 超顺磁性纳米团簇期间聚合以形成包含羧基基团的聚合物材料。在接触步骤和磁性分离步 骤期间，聚合物材料保持与合成的超顺磁性纳米团簇相关联（并可能共价结合到其上）。
[0011] 在其他实施例中，在超顺磁性纳米团簇已形成之后，可将羧基官能团加入到超顺 磁性纳米团簇的表面。例如，羧基官能团可作为单体材料、低聚物材料或高分子聚合物材料 上的取代基存在，该材料与超顺磁性纳米团簇接触，以便变成与这种纳米团簇的表面相关 联。在一些特定实施例中，这种材料可共价结合到超顺磁性纳米团簇（或共价结合到涂覆 到纳米团簇表面上以有利于前述关联的材料），这将在下文详细讨论。
[0012] 超顺磁性纳米团簇可使用任何合适的方法来合成。在一些实施例中，超顺磁性纳 米团簇可由称为高温水解的通用方法合成。在该方法中，铁（例如铁（III))阳离子在高温 下至少减少一部分，并从溶液中沉淀出来，从而形成初级粒度在适当尺寸范围内的磁铁矿 纳米团簇。此类方法（例如由Ge等人，《欧洲化学杂志》，2007年，13(25) ,7153-7161 (Chem. Eur. J. 2007, 13(25)，7153-7161)所描述的）可使用例如聚丙烯酸作为封端剂，该聚丙烯酸 可以在纳米粒子形成时至少部分地结合到纳米粒子的表面，并且可保持至少部分地结合到 其上，并且因此，就本文所公开的目的而言，聚丙烯酸是提供羧酸官能团的现成品。在其他 实施例中，超顺磁性纳米团簇可由称为水热（有时称为溶剂热）合成法的通用方法合成， 在该方法中，将铁前体（例如六水合氯化铁）溶于具有多种试剂（例如乙二醇和/或二甘 醇、以及丙烯酸钠和/或乙酸钠）的溶液中，将溶液加热并保持在高温下以使反应进行，并 且然后将溶液冷却以获得反应产物。在此类方法中（这类方法例如由Xuan等人，《材料化 学》，2009年，第21卷，5079-5087 (Chem.ofMat. 2009, 21，5079-5087)所描述，将该文献全 文以引用方式并入本文以用于所有目的），丙烯酸钠等可用于例如约束和/或稳定生长中 的纳米粒子，例如以便控制其粒度。看起来，丙稀酸钠在合成工艺期间至少一定程度上聚合 (例如，以形成聚丙烯酸钠）；因此，在生产超顺磁性纳米团簇的工艺期间，该合成工艺可原 位产生羧基官能低聚物材料或聚合物材料。然后就本文所公开的目的而言，可用此类羧基 官能团。
[0013] 虽然上述方法可能特别适用于本文提到的原因，但可使用任何合适的合成超顺磁 性纳米团簇的方法（例如有机金属热解法、化学共沉淀法、胶束合成法、激光热解法），只要 选择的方法提供羧基官能团、或允许此类基团在合成纳米团簇期间或之后与纳米团簇相关 联（例如接到其上）。
[0014] 在一些实施例中，可将羧基官能化超顺磁性纳米团簇用于合成（并且在执行任何 期望的洗涤步骤等以移除试剂或原材料之后）。在其他实施例中，超顺磁性纳米团簇的至 少一些初级纳米粒子的至少一部分表面可涂覆有可促进或增强羧基官能团与纳米团簇关 联的材料。这种材料还可用于增强纳米团簇的稳定性（也就是说，该材料可增强初级纳米 粒子在本文所述的过程期间不以无法接受的程度从纳米团簇脱落的能力）、可用于使纳米 团簇形成更接近球形的形状等等。已发现可满足所有这些目的的一种示例性材料为二氧化 硅，可例如通过简单的沉积过程使其涂覆到超顺磁性纳米团簇上，在该简单的沉积过程中， 可（经由水解）缩聚原硅酸四乙酯，从而在纳米团簇的一部分甚至全部初级纳米粒子上形 成一层期望厚度的二氧化硅。在各种实施例中，这种二氧化硅涂层可具有至少2纳米、5纳 米、10纳米、20纳米或30纳米的平均厚度。在另外的实施例中，这种二氧化硅涂层可具有 至多100纳米、50纳米或20纳米的平均厚度。
[0015] 这种二氧化硅涂层能够轻易充当接合层，从而允许任何合适的分子（包含例如羧 基官能团）共价结合到二氧化硅涂层。例如，任何合适的含硅醇材料（诸如例如羧乙基硅 烷三醇）可与二氧化硅表面接触，使得硅烷部分与二氧化硅的表面羟基基团反应以形成共 价键，因此提供栓系到二氧化硅表面的羧基。在这种反应机理的变型中，使所谓的硅烷偶联 剂（包含例如易于转换为反应性硅醇的基团）可与二氧化硅表面接触以获得类似的效果。 因此，在特定实施例中，三甲氧基甲硅烷基丙基（乙二胺三乙酸）可经由三甲氧基甲硅烷基 部分（该部分在水中水解以形成硅醇）来结合到二氧化硅表面，使每个分子留下三个羧基 基团栓系到二氧化硅表面。于是形成了本文称之为包含衍生自m)TA(乙二胺四乙酸）的羧 基基团的表面（应当注意，严格说来每个分子上只存在三个羧基而不是四个，因为每个分 子贡献了一个羧基基团以使硅烷偶联剂部分能够结合到m)TA分子上）。
[0016] 如果需要，可先将第一分子即接头分子（例如，在一端部具有硅烷偶联剂，在另一 端部具有合适的反应性基团）附接到纳米团簇（例如，附接到其上的二氧化硅涂层的表 面），之后进行将第二分子即含羧基分子附接到接头分子的反应性基团。然而，此类方法可 能不如例如将含羧基分子直接附接到二氧化硅表面的方法便利。
[0017] 概括地说，使用此类方法时，例如二氧化硅的接合层能够涂覆到超顺磁性纳米团 簇的至少一部分表面上，并且这种二氧化硅涂层随后不仅可促进羧基基团附接（无论是一 般形式的羧基，还是衍生自m)TA的特殊形式羟基基团），而且还可提供上文提及的其他有 ?效果。