胡萝卜素羟化酶及其用于产生类胡萝卜素的用图
【专利说明】胡萝卜素羟化酶及其用于产生类胡萝卜素的用途
[0001] 发明背景
[0002] 本发明涉及新的羟化酶、编码它的核酸序列、包含此序列的表达构建体和载体、用 其转化的微生物、用于类异戊二烯的微生物羟化的方法，例如，用于将胡萝卜素转变成 β-隐黄素或玉米黄质以及将角黄素转变成虾青素的方法。
[0003] 类胡萝卜素是颜色在黄色至红色范围内的有机色素，其由一些生物包括光合生物 (例如，植物、藻类、蓝藻）和一些真菌天然产生。
[0004] 类胡萝卜素如叶黄素、玉米黄质或虾青素是在人和牲畜饮食中作为色素物质和维 生素Α衍生物的前体的非常重要的添加剂。此外，类胡萝卜素具有促进健康的作用如增强 免疫应答，而且由于其抗氧化剂特性的原因具有预防癌症的作用，这使其用作感兴趣的保 健品（nutraceutical)。因此用于制备类胡萝卜素的经济方法和具有增加的类胡萝卜素含 量的食品至关重要。用于制备类胡萝卜素的特别经济的方法是生物技术方法，其利用来自 产生类胡萝卜素的生物的类胡萝卜素生物合成的生物合成基因和蛋白。
[0005] 经由β-隐黄素催化β-胡萝卜素酶法转变成玉米黄质的原核β-胡萝卜素羟化 酶和编码这些蛋白的基因已知来自夏孢欧文氏菌（Erwiniauredovora) (Misawa等，J.of Bacteriology1990, 6704-6712;EP393690B1)、草生欧文氏菌（Erwiniaherbicola)(TO 9113078)、澄黄土壤杆菌（Agrobacteriumaurantiacum)(Misawa等，J.ofBacteriology 1995,6575-6584;EP735 137Al)、产碱菌属菌种（Alcaligenessp.)PC-l(EP735 137Al)、黄杆菌属菌种（Flavobacteriumsp.)菌株R1534(Pasamontes等，Gene 1997,185,35-41;EP747483A2)和来自蓝藻集胞藻属（CyanobacteriumSynechocystis) PCC6803(Masamoto等，PlantCellPhysiol. 1998, 39 (5)，560-564) 〇
[0006] 还已知来自橙黄土壤杆菌、产碱菌属和噬夏孢欧文氏菌的原核胡萝卜素 轻化酶还能够将角黄素经由金蓋花红素（adonirubin)转变成4下青素（Misawa等，J.of Bacteriology1995, 6575-6584;Fraser等，J.Biol.Chem. 1997, 272, 6128-6135) 〇
[0007] 已知来自真核来源的三种植物β-胡萝卜素羟化酶可催化β-胡萝卜素经由 β-隐黄素酶法转变成玉米黄质。相应的cDNA已从拟南芥（Arabidopsisthaliana) (Cunningham等，J.Biol.Chem. 1996, 271，24349-24352,TO9736998)和辣椒（Capsicum annuumL.)中分离。
[0008] 真核来源的基因相对于原核基因具有优势，其在更高等的转基因生物如植物中表 达更佳。尽管如此，仍然需要改进和增加类胡萝卜素生产力用于通过将真核核酸并入生物 体而制备类胡萝卜素衍生物或具有增加的类胡萝卜素含量的食品的方法。
[0009] 此外，现有技术中适当的真核β-胡萝卜素羟化酶具有它们仅有窄的底物范围的 缺点使得存在不能由羟化酶转变且可对羟化酶发挥抑制效果的代谢产物的积累。
[0010] 发明概沐
[0011] 本发明的目标之一是改正现有技术的所述缺陷并提供具有改进特性的真核胡萝 卜素羟化酶。
[0012] 发明人发现通过包含氨基酸序列SEQIDΝ0:2的具有羟化类异戊二烯（例如， β-胡萝卜素或角黄素）酶活性的蛋白可令人惊讶地实现上述目标。
[0013] 因此，本发明涉及包含氨基酸序列SEQIDΝ0:2的蛋白或多肽，或源自此序列通过 氨基酸的取代、插入或缺失并与序列SEQIDN0:2在氨基酸水平具有至少50%同源性的序 列。
[0014] 特别地，根据本发明的羟化酶如果在所选的或能够产生特定类胡萝卜素（例如玉 米黄质或虾青素）的菌株中表达，与未用编码根据本发明的蛋白或多肽的基因转化的菌株 相比，可增加这些类胡萝卜素的水平。
[0015] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸、包含所述多核苷酸的核酸构 建体、重组表达载体和重组宿主细胞，并涉及产生所述多肽的方法。
[0016] 本发明还提供用于类胡萝卜素生物产生的改进系统。在一个优选的实例中，本发 明提供产生一种或多种类胡萝卜素的含油真菌（包括，例如，酵母）。本发明还提供构建所 述酵母和真菌的方法，使用这种酵母和真菌以产生类胡萝卜素的方法，和制备包含类胡萝 卜素的组合物（如食品或饲料添加剂，或营养补充剂）的方法，使用所述含油酵母或真菌中 产生的类胡萝卜素的方法。特别地，本发明提供用于生成包含编码本发明多肽的多核苷酸 的酵母和真菌的系统和方法。
[0017]序列表概沐
[0018] SEQIDNO: 1是编码来自雨生红球藻（Haematococcuspluvialis)的低频胡萝卜 素羟化酶的未优化DNA序列。
[0019] SEQIDN0:2是从SEQIDNO: 1推导的氨基酸序列。
[0020] SEQIDN0:3是编码来自雨生红球藻的低频胡萝卜素羟化酶的DNA序列，如对于在 解脂耶氏酵母/解脂西洋蓍霉（Yarrowialipolytica)中表达而优化的。
[0021] SEQIDN0:4是编码来自粉尘克罗诺杆菌（Cronobacterpulveris)(之前为粉尘 肠杆菌（Enterobacterpulveris)(Ep)的胡萝卜素轻化酶的DNA序列，如对于在解脂耶氏 酵母中表达而优化的。
[0022] SEQIDN0:5是编码来自肠杆菌科（Enterobacteriaceae)细菌DC404(Dc)的胡萝 卜素羟化酶的DNA序列，如对于在解脂耶氏酵母中表达而优化的。
[0023]
[0024] 分离的多肽：术语"分离的多肽"意指相对于天然发现的多肽由人工进行修饰的多 肽。在一个方面中，所述多肽为至少1 %纯，例如，至少5%纯、至少10%纯、至少20%纯、至 少40 %纯、至少60 %纯、至少80 %纯，和至少90 %纯，如通过SDS-PAGE确定的。
[0025] 基本上纯的多肽：术语"基本上纯的多肽"意指制备物，其包含按重量计至多 10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1 %和至多0. 5%的 与所述制备物天然或重组结合的其他多肽材料。优选地，所述多肽按制备物中存在的全部 多肽材料的重量计为至少92%纯，例如，至少94%纯、至少95%纯、至少96%纯、至少97% 纯、至少98%纯、至少99%纯、至少99. 5%纯，和100%纯。本发明的多肽优选为基本上纯 的形式。这可例如通过由已知的重组方法或由经典的纯化方法制备多肽来实现。
[0026] 序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数"序 列同一"性"描述。
[0027] 就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度使用如在EMBOSS包 (EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,Trends Genet. 2000, 16:276-277)的Needle程序，优选3.(λ0或以后的版本中执行的 Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970,J.Mol.Biol. 48:443-453)来确定。使 用的任项参数为缺口开放罚分10、缺口延伸罚分〇. 5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版 本）取代矩阵。使用标记"最长同一性"的Needle输出（使用-nobrief选项获得）作为 百分比同一性并计算如下：
[0028](相同的残基xlOOV(比对长度-比对中缺口的总数）
[0029] 就本发明而言，两个脱氧核糖核酸序列之间的序列同一性的程度使用如在EMBOSS 包（EMB0SS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，见上 文）的Needle程序，优选3. 0. 0或以后的版本中执行的Needleman-Wunsch算法（Needleman 和Wunsch，1970,见上文）来确定。使用的任选参数为缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5 和EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。使用标记"最长同一性"的Needle 输出（使用-nobrief选项获得）作为百分比同一性并计算如下：
[0030](相同的脱氧核糖核酸xlOOV(比对长度-比对中缺口的总数）
[0031] 片段：术语"片段"意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个（几 个）氨基酸的多肽，其中所述片段具有羟化酶活性。
[0032] 等位变体：术语"等位变体"意指占据相同染色体基因座的基因的两种或多种可替 换形式中的任何。等位变异通过突变自然出现，且可导致种群内的多态性。基因突变可为 沉默的（在编码的多肽中无变化）或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变 体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0033] 分离的多核苷酸：术语"分离的多核苷酸"意指相对于天然发现的多核苷酸由人 工进行修饰的多核苷酸。在一个方面中，所述分离的多核苷酸为至少1%纯，例如，至少5% 纯、至少10%纯、至少20 %纯、至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90 %纯和至少 95 %纯，如通过琼脂糖凝胶电泳确定的。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合 成来源的，或其任何组合。
[0034] 基本上纯的多核苷酸：术语"基本