boratory Press:New York；F. M. Ausubel,R. Brent,R.E.Kingston, D. D. Moore,J.G.Seidman,J.A. Smith, K. Struhl(Hi). 1998.Current Protocols in Molecular Biology. Wiley:New York)实施。
[0106]实施例la:编码雨牛红球藻（H. pluvialis)胡萝卜素轻仆，酉每LF的 pMB6486 (Hygrtef-crtZ-Hp~)
[0107] 如使用雨生红球藻（UTEXNo. 2505)的mRNA序列分析的结果，发明人令人惊奇地 发现了新的胡萝卜素羟化酶，将其命名为HpW-CrtZ(雨生红球藻LF(低频））羟化酶。
[0108] 使用如SEQIDN0:3中详明的解脂耶氏酵母密码子偏好，基于雨生红球藻基 因的推导的蛋白序列从头合成密码子优化的胡萝卜素羟化酶（HpHCrtZ)ORF序列。在 从头合成的过程中，将包含Nhel限制位点和允许有效翻译的典型Kozak序列的序列 5'-TGCTAGCCACAAAA添加至紧接ATG的上游。将包含Mlul限制位点的序列ACGCGT-3'添加 至紧接终止密码子的下游。该序列使用Nhel和Mlul裂解并连接至用Nhel和Mlul剪切的 PMB6157以产生pMB6486。所得pMB6486编码的HpLF-CrtZ蛋白详明于SEQIDN0:2中。
[0109]实施例lb:编码粉尘克罗诺杆菌（之前的粉尘肠杆菌）胡萝卜素羟化酶的 DMB6056 (Hvg^tef-crtZ-ED)的产牛。
[0110]使用如SEQIDN0:4中详明的解脂耶氏酵母密码子偏好，基于粉尘克罗诺杆菌 (之前称为粉尘肠杆菌（EMBL登录号CAZ90621. 1))基因的推导的蛋白序列从头合成密码子 优化的胡萝卜素羟化酶（Ep-CrtZ)ORF序列。在从头合成的过程中，将包含Nhel限制位点 和允许有效翻译的典型Kozak序列的序列5' -TGCTAGCCACAAAA添加至紧接ATG的上游。将 包含Mlul限制位点的序列ACGCGT-3'添加至紧接终止密码子的下游。该序列使用Nhel和 Mlul裂解并连接至用Nhel和Mlul剪切的pMB6157以产生pMB6056。
[0111] 实施例lc :编码黄杆菌属R1534古月萝卜素轻化酉每的dMB6487 (Hyg^tef-crtZ-Fb)的 产牛。
[0112] 使用解脂耶氏酵母密码子偏好，基于如美国专利6, 087, 152中详明的黄杆菌属 R1534的蛋白序列从头合成密码子优化的胡萝卜素羟化酶（Fb-CrtZ)。在从头合成的过程 中，将包含Nhel限制位点和允许有效翻译的典型Kozak序列的序列5' -TGCTAGCCACAAAA添 加至紧接ATG的上游。将包含Mlul限制位点的序列ACGCGT-3'添加至紧接终止密码子的 下游。
[0113] 该序列使用Nhel和Mlul裂解并连接至用Nhel和Mlul剪切的pMB6157以产生 PMB6487。
[0114] 实施例2A :向解脂耶氏酵母角昔素产牛株ML6804引入三种胡萝卜素羟化_基_ 以产牛虾青素
[0115] 为测试Hp^CrtZ的轻化潜力并与FbCrtZ和EpCrtZ进行比较，用三种不同的构 建体转化菌株ML6804。
[0116] 1)携带tef lp控制下的黄杆菌属crtZ基因和潮霉素抗性标记Hyg1^ pMB6487的 Hindlll-Xbal片段；
[0117] 2)携带teflp控制下的粉尘克罗诺杆菌（之前为粉尘肠杆菌）crtZ基因和潮霉素 抗性标记Hygl^ pMB6056的PvuII片段；
[0118] 3)携带teflp控制下的雨生红球藻"低频"crtZ基因和潮霉素抗性标记Hyg1^ PMB6486的Hindlll-Xbal片段。
[0119] 在30°C生长3-4天后在具有100mg/L潮霉素的YPD上选择转化体。将来自每种 构建体的十个转化体在摇瓶中的YPD内生长4天。全部转化体产生虾青素。来自每种转 化的代表性转化体与其亲代菌株ML6804示于图1。包含黄杆菌属R1534crtZ基因的菌株 ML12471产生3%的虾青素和9%的金盏花红素（作为总类胡萝卜素的百分比）。包含粉尘 克罗诺杆菌（之前为粉尘肠杆菌）(：竹2基因的菌株此11622产生7%的虾青素和11%的金 盏花红素。且包含雨生红球藻wcrtZ基因的菌株ML12466产生12%的虾青素和22%的金 蓋花红素。
[0120] 实施例2B :向解脂耶氏酵母虾青素产牛株引入雨牛红球藻LF胡萝卜素羟化酶以 增加虾青素的纯度
[0121] 用携带tefl启动子、HpW crtZ基因和针对潮霉素抗性Hygl^选择性标志的 PMB6486的Hindlll-Xbal片段转化菌株ML9863和ML11956。在30°C生长3-4天后，在转化 平板（YPD，具有100mg/L潮霉素）上选择来自与亲代相比表现较暗的每种株的二十个HygR 转化体。转化体在YH)中于摇床中生长4天。与其亲代菌株相比两个代表性的转化体示于 图2。
[0122] ML12562源自ML9863且ML12566源自ML11956。作为总类胡萝卜素的百分比， ML12562和ML12566相比它们的亲代分别产生3倍（40%对13% )和2倍（27%对13% ) 更多的虾青素（图2)。
[0123] 实施例2c :向解脂耶氏酵母β -胡萝卜素产牛株引入雨牛红球藻LF羟化酶以产 牛β-隐昔素：
[0124] 用三种不同的构建体转化菌株ML5252 :
[0125] 1)携带teflp控制下的黄杆菌属R1534crtZ基因和潮霉素抗性标记Hygl9 PMB6487的Hindlll - Xbal片段；
[0126] 2)携带teflp控制下的粉尘克罗诺杆菌（之前为粉尘肠杆菌）crtZ基因和潮霉素 抗性标记Hygl^ pMB6056的PvuII片段；
[0127] 3)携带teflp控制下的雨生红球藻LF crtZ基因和潮霉素抗性标记Hygl9 PMB6486的Hindlll-Xbal片段。
[0128] 在30°C生长3-4天后在具有100mg/L潮霉素的YPD上选择转化体。将来自每种构 建体的十株转化体在摇瓶中的Yro内生长4天。全部转化体都产生玉米黄质和β-隐黄素。 代表性转化体与亲代菌株ML5252相比示于图3。包含黄杆菌属crtZ基因的菌株ML12458 产生6%的β-隐黄素和6%的玉米黄质（作为总类胡萝卜素的百分比）。包含粉尘克罗诺 杆菌（之前为粉尘肠杆菌）crtZ基因的菌株ML10341产生3%的β-隐黄素和39%的玉米 黄质（作为总类胡萝卜素的百分比）。包含雨生红球藻LFcrtZ基因的菌株ML12453产生 21%的β-隐黄素和4%的玉米黄质（作为总类胡萝卜素的百分比）。
[0129] 从解脂耶氏酵母细朐提取类胡萝卜素并通讨HPLC宙量类胡萝卜素牛产:
[0130] 根据之前美国专利号7, 851，199Β2中描述的方法对生成的菌株实施摇瓶测试和 类胡萝卜素分析。
【主权项】
1. 一种用于类异戊二烯的微生物羟化的具有羟化酶活性的多肽，其选自下组： a) SEQIDNO: 2 的多肽； b) 源自SEQIDNO:2通过氨基酸的取代、插入或缺失并与SEQIDNO:2的序列在氨基 酸水平具有至少50%同源性的多肽。2. 权利要求1的多肽，其中所述蛋白具有用于将胡萝卜素转变成隐黄素和/ 或玉米黄质的酶活性，和/或将角黄素转变成andirubin和/或虾青素的酶活性。3. -种编码权利要求1的多肽的分离的核酸。4. 权利要求3的分离的核酸，其分别由SEQIDNO: 1和SEQIDNO: 3描述的序列组成。5. -种核酸构建体或表达载体，其包含与一个或多个（几个）调控序列可操作连接的 权利要求3或4的多核苷酸，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主细胞中的产生。6. -种转化的微生物（宿主细胞），其中表达权利要求3或4的核酸。7. 权利要求6的转化的微生物，其类胡萝卜素代谢不同于野生型。8. 权利要求7的转化的微生物，其中所述微生物是含油株（oleaginousstrain)。9. 权利要求8的转化的微生物，其中所述含油株是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)的菌株。10. -种用于产生权利要求6的转化的微生物的方法，其包括引入由SEQIDNO: 1中描 述的序列组成的核酸或核酸构建体，其与一个或多个调节信号功能性连接。11. 一种用于制备类胡萝卜素或类胡萝卜素衍生物的方法，其包括在权利要求1的多 肽存在下将β-紫罗兰酮转变成3-羟基-β-紫罗兰酮和/或将4-酮-β-紫罗兰酮转变 成3-羟基-4-酮-β-紫罗兰酮结构元件。12. 权利要求11的方法，包括如下步骤： a) 在有助于类胡萝卜素产生的条件下培养根据权利要求6至9中任一项的转化的微生 物；和 b) 回收所述类胡萝卜素和类胡萝卜素衍生物。13. -种包含权利要求1或2任一项的多肽的组合物。
【专利摘要】本发明涉及新的羟化酶、编码它的核酸序列、包含此序列的表达构建体和载体、用其转化的微生物和用于类异戊二烯的微生物羟化的方法，例如，用于将β-胡萝卜素转变成β-隐黄素和玉米黄质、将角黄素转变成虾青素的方法。
【IPC分类】C12N9/02, C12P23/00
【公开号】CN105308180
【申请号】CN201380066965
【发明人】C·法雷尔, M·马约尔加, B·谢弗勒
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2013年8月27日
【公告号】CA2895298A1, EP2935570A1, US20150315550, WO2014096990A1, WO2014096990A8