一种rna及其用途、包含该rna的组合物、重组表达载体和宿主细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重 组表达载体和宿主细胞。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是威胁人类健康的头号杀手之一，并且目前并没有十分有效的手段来治疗肿 瘤。传统的治疗方法，如化疗、放疗、手术和靶向药物，尽管最初能成功控制住肿瘤，但往 往又会反过来诱导宿主细胞产生一系列其他的行为，进而最终导致肿瘤的复发、扩散和转 移。基因治疗由于其针对性强、靶向性好、有效和基本无毒副作用等优点，这些年正在越来 越受到人们的青睐和关注。TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)属于肿瘤坏死因子（TNF)家族成员，因其可以选择性地杀死肿瘤细胞，但对绝大多 数正常组织没有毒性而成为癌症基因治疗的研究热点之一。研究表明静脉多次注射重组可 溶性TRAIL可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长和形成，延长实验动物的生存时间的同 时却不引起可监测到的毒性发生。尽管它可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不同的肿瘤细胞 对TRAIL的敏感性不同，因此增强抗性细胞对TRAIL的敏感性具有良好的临床应用前景。
[0003] 目前研究表明，TRAIL抗性的机制在不同细胞中是不同的，有诸如假受体占位、细 胞内部抗凋亡分子的高表达等假说，但是有些假说验证困难，且目前并没有十分有效的方 法来改善TRAIL抗性问题。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和 宿主细胞。该RNA能有效抑制miR-222的表达水平，增强TRAIL对A549的杀伤活性。本发 明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种RNA，其特征在于，其具有：
[0007] ( I )、如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；或
[0008] ( II )、如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的互补序列；或
[0009] (III)、与（I )或（II )的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性 而与（I )或（II )的核苷酸序列不同的序列；或
[0010] (IV)、与（I )或（II )或（III)所述序列至少有70%同源性的序列。
[0011] 本发明还提供了所述RNA用于抑制Hsa-miR-222的用途。
[0012] 本发明还提供了一种组合物，包括TRAIL95 281和所述的RNA。
[0013] 本发明还提供了所述组合物的制备方法：
[0014] 步骤1 :将编码TRAIL95 281与所述的RNA的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载 体；
[0015] 步骤2:将所述表达载体转化宿主细胞，表达，收集表达产物，即得。
[0016] 本发明还提供了一种重组表达载体，包括：
[0017] (1)编码trail95281的核苷酸序列；和/或
[0018] (2)编码本发明所述RNA的核苷酸序列。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法，将编码 TRAIL 95 281与所述RNA的核苷酸序列连接到载体中，构建表达载体。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中的载体为质粒 或病毒。
[0021] 在本发明的一些具体实施方案中，所述重组表达载体的构建方法中病毒为腺相关 病毒。
[0022] 本发明还提供了一种宿主细胞，包括所述的重组表达载体。
[0023]所述重组表达载体的结构为 pAM-CAG-pL-INS-TRAIL95 2S1-polyA-U6-miR-222-TuD -WPRE-BGH polyA 的 AAV 重组表达载体，简称 AAV-TRAIL-miR-222-TuD。
[0024]所述重组表达载体包括：pAM(the abbreviation of the plasmid of anti-ampcilin construction)、 ITR(adeno_associated virus 2 inverted terminal repeat sequence)、CAG(cytomegalovirus immediated-early enhancer/chicken 0 -actin hybrid)n INS(human Insulin)secretion signal peptide、pL (poly-linker)、 TRAIL95 2S1 (编码 TRAIL 第 95 至 281 位氨基酸）、polyA(多聚腺苷酸）、U6、miR-222-TuD、 WPRE(Woodchuck Heptitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element)、BGH(Bos taurus growth hormone)、polyA (多聚腺苷酉爱）和 ITR(adeno_associated virus 2 inverted terminal repeat sequence)〇
[0025]其中，ITR sequence (Patent TO0220748)的序列如 SEQ ID No. 5 所示；CAG sequence 的序列如 SEQ ID No. 6 所不；INS secretion signal peptide sequence (Genbank accession no. NM 000207)的序列如 SEQ ID No.7 所不；WPRE sepuence(Genbank accession no. J04f514)的序列如 SEQ ID No. 8 所不；BGH(Bos taurus growth hormone) pA sequence 的序列如 SEQ ID No.9 所不；TRAIL95 281 amino acid sequence (Patent ZL03138357. 2)的序列如 SEQ ID No. 10 所示。
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为细胞株，所述细胞株选自HeLa 细胞、A549 细胞、Bel-7402 细胞、CNE-2Z 细胞、EC109 细胞、MGC-803 细胞、SW1990 细胞、 DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞或SK-0V-3细胞。
[0027] 本发明还提供了所述组合物、所述重组表达载体、所述宿主细胞在制备治疗肿瘤 的药物中的应用。
[0028] 在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤为原发性、继发性或转移性的肿瘤。
[0029] 在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、结直 肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌。
[0030] 本发明的实验证明，在HeLa细胞、A549细胞、Bel-7402细胞、CNE-2Z细胞、EC109 细胞、MGC-803 细胞、SW1990 细胞、DU145 细胞、U251 细胞、A875 细胞、HCT116 细胞、MCF7 细胞、SK-0V-3细胞中转染了 Has-miR-222的mimics以后能增强细胞对TRAIL的抗性，而 转染了 Has-miR-222的inhibitor以后能增强细胞对TRAIL的敏感性（图1)。人工设计 的miR-222特异性抑制剂TuD (图2A)，并在原有pAM/CAG-TRAIL载体基础上加入polyA以 终止II类启动子CAG，然后插入一个新的III类启动子U6来表达miR-222-TuD (图2B)。 将构建好的共表达质粒转入到293T细胞中验证各个抑制剂对miR-222的靶向抑制作用， miR-222-TuD能有效抑制miR-222的表达水平（图2C)。将各个共表达质粒转入Hela中，用 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒流式检测细胞凋亡，可以看到，miR-222-TuD 能增强TRAIL对Hela的杀伤活性（图2D)。
[0031] 采用辅助病毒缺陷包装系统进行该重组共表达载体的包装，病毒用碘克沙醇 密度梯度超速离心纯化，超滤浓缩，Real-time PCR确定其最终滴度。同样方法制备 和包装编码绿色荧光蛋白（EGFP)的AAV重组病毒（AAV-EGFP)作为阴性对照，只编码 TRAIL蛋白的AAV-TRAIL作为阳性对照。将AAV-EGFP病毒侵染293细胞和A549细胞 72h后，观察细胞的荧光表达情况，可以看到细胞被成功侵染并表达了绿色荧光蛋白（图 3A)。将 AAV-EGFP、AAV-TRAIL、AAV-TRAIL+miR-222-TuD 分别侵染 293 细胞，检测到在被 AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD侵染后，TRAIL的表达水平明显升高（图3B)，而被 AAV-TRAIL+miR-222-TuD侵染后，miR-222的表达被明显抑制（图3C)。在A549裸鼠体内 移植瘤实验中，经AAV-TRAIL治疗后，肿瘤生长受到抑制，但在AAV-TRAIL+miR-222-TuD联 合治疗组可以看到更明显的生长抑制（图4)，并且miR-222-TuD是通过靶向抑制miR-222 间接促进其靶基因PTEN来发挥作用（图5)，表明得到的重组病毒是有生物学活性的，有希 望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。
【附图说明】
[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0033] 图 1 示 miR-222 对 TRAIL 抗性的影响；转染了 miR-222 的 mimics 和 inhibitors 以后，再用TRAIL蛋白刺激人宫颈癌细胞Hela、人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402、 人鼻咽癌细胞CNE-2Z、人食管癌细胞EC109、人胃癌细胞MGC-803、人胰腺癌细胞SW1990、人 前列腺癌细胞DU145、人神经胶质瘤细胞U251、人黑色素瘤细胞A875、人乳腺癌细胞MCF7、 人结直肠癌细胞HCT116、人卵巢癌细胞SK-0V-3对细胞的杀伤作用；
[0034] 图2示pAM/CAG-TRAIL-U6-miR-222-TuD共表达质粒的构建及功能验证，其中图 2(A) :miR-222-TuD 的序列设计；图 2(B) :pAM/CAG-TRAIL-polyA-U6-miR-222-TuD 共表达 载体的表达结构；图2(C):共表达质粒转染293T细胞后对miR-222表达水平的影响；图