肾细胞HEK293T在DMEM完全培养基（DMEM培养基添加10 %的胎牛血清， 100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中培养6h以上，1XPBS洗涤后加入2X109Gps实 施例2制备的重组病毒（培养基为DMEM未添加胎牛血清，剂量为lX10 4Gps/细胞）， 2-4小时后添加DMEM完全培养基继续培养。在分别转导重组病毒AAV-EGFP、AAV-TRAIL、 AAV-TRAIL+miR-222-TuD后，裂解人胚肾细胞HEK293T，用TRIzol提取RNA，进行qPCR检测。
[0069] 重组AAV病毒的生物学活性检测结果：
[0070] 其中AAV-EGFP可以成功侵染293细胞和A549细胞并使其表达绿色荧光蛋白，见 图 3 (A);
[0071 ] AAV-TRAIL 和 AAV-TRAIL+miR-222-TuD 在侵染 293 细胞后可以成功过表达 TRAIL， 见图3⑶；
[0072] AAV-TRAIL+miR-222-TuD 可以有效敲低 miR-222 的表达水平，见图 3 (C)。
[0073] 实施例 4 Western Blot
[0074] 分别注射了 AAV-EGFP、AAV-TRAIL、AAV-TRAIL+miR-222-TuD 的肿瘤组织或细胞 经裂解液（含 1 % Nonidet P_40、0. 35mg/ml PMSF、9. 5 y g/ml leupeptin 和 13. 7 y g/ ml pepstatin A的1XPBS)裂解后，12000rpm离心去沉淀，上清液经BCA蛋白分析试剂盒 (Pierce Chemical Company)测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜后 4°C封闭过夜，经一抗（抗PTEN多克隆抗体，1:1000稀释于封闭液中，室温2h)、二抗（HRP 标记的羊抗兔抗体1:10000稀释于封闭液中，室温lh)孵育后，彻底洗涤，然后利用ECL系 统（Amersham Pharmacia Biotech Co.)进行蛋白显色。检测PTEN在肿瘤内表达情况，可 以看到在AAV-TRAIL+miR-222-TuD组PTEN表达明显上调。
[0075] miR-222-TuD通过调节靶基因PTEN的变化水平发挥作用结果：
[0076] (1)PTEN是miR-222的预测靶基因，见图5(A);
[0077] (2)注射AAV-TRAIL+miR-222-TuD的肿瘤组织中，PTEN表达水平明显上调，见图 5(B) 〇
[0078] 实施例5 Annexin V-FITC/PI双染法流式测定细胞凋亡
[0079] 按照细胞凋亡试剂盒（BD-FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I)说明书 进行。细胞经0. 25% EDTA消化处理后，离心，用冰的PBS洗两次，用1 XBinding Buffer重 悬为 lX106cells/ml，取 100yl 细胞悬液（lX105cells)，加入 5yl FITC Annexin V 和 5yl PI，轻柔混匀，室温避光孵育15分钟。加入400 yl lXBinding Buffer，l小时内用 流式细胞仪检测。
[0080] 双染法流式测定细胞凋亡结果：
[0081] 转染单独表达TRAIL的质粒能引起Hela细胞凋亡，而转染了TRAIL与 miR-222-TuD的共表达质粒后，明显促进了对Hela的凋亡作用，见图2(D)。
[0082] 实施例6小鼠动物模型的建立
[0083] 取5至6周龄、体重约20g的Bal b/c裸鼠，皮下接种2X106人肺癌细胞A549， 每三或四天测量一次肿瘤的长短径，计算瘤体积（体积=1/2X长径X短径 2)。实 验结束时断颈处死裸鼠，肿瘤或各组织样品称重后经液氮冷冻后贮存在-70°C或在4% paraformaldehyde 固定。
[0084] 实施例7荷瘤小鼠的实验治疗与观察
[0085] 取5至6周龄、体重约20g的Balb/c裸鼠，皮下接种2X106人肺癌细胞A549， (1XPBS悬液100 y 1)，即实施例6制备的小鼠动物模型。肿瘤长至100mm3时，将实验动物 分成三组：a)AAV-EGFP阴性对照组；b)AAV-TRAIL阳性对照组；c)AAV-TRAIL+miR-222-TuD 重组病毒（病毒滴度1011)治疗组。每组5只，通过瘤内多点注射。每周观察不同组动物肿 瘤的生长情况和生存时间。做3批重复实验。
[0086] A549荷瘤小鼠经重组AAV-TRAIL和AAV-TRAIL+miR-222-TuD处理后，皮下瘤的生 长受到抑制，并且AAV-TRAIL+miR-222-TuD能促进AAV-TRAIL的使用效果，明显抑制肿瘤生 长：
[0087] (1)皮下瘤受抑制的形态学观察，见图4(A);
[0088] (2)给药后瘤体积变化的动态观察，见图4(B);
[0089] (3)处死时瘤重的差异，见图4(C)。
[0090] 过去几十年的研究显示，TRAIL在肿瘤和免疫系统里均发挥着十分重要的功能，是 一个非常有治疗潜力的因子。和TNF家族其他配体成员比较，TRAIL具有如下三个优势：1) 具有强大的和特异性诱导肿瘤细胞凋亡的能力，但对正常细胞无此效应；2)比TNF-a和 Fas-L有更广的抗癌谱；3)对NF-kB仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像 TNF-a和Fas-L那样产生严重的炎症反应。因此许多生物技术和制药公司都以此针对激活 肿瘤细胞的死亡程序来设计药物，目前，不同的TRAIL受体激动剂，包括TRAIL本身，和各种 竞争性的抗DR4、DR5的单克隆抗体都作为新型的肿瘤治疗靶点在临床试验当中。但是目前 仍然有其面临的困境，比如抗性问题。
[0091] 本专利中，Hsa-miR-222在多种细胞系中表现出了对TRAIL抗性的影响，过表达 miR-222的模拟物以后细胞对TRAIL抗性增强，而抑制掉miR-222以后，细胞的凋亡率增 加，即对TRAIL抗性减弱。因此我们设计了 miR-222的特异性抑制剂miR-222-TuD来和 TRAIL联合应用。可以看到，Hela细胞作为对TRAIL敏感的细胞株，在转染了只表达TRAIL 的质粒以后，细胞是发生了明显凋亡的，而在此基础之上，TRAIL+miR-222-TuD共表达质粒 仍能显著增强TRAIL的杀伤作用。A549同样作为对TRAIL比较敏感的细胞株，在用其成 瘤以后的动物实验中，分别注射包装的AAV病毒，和对照组相比，注射了 AAV-TRAIL组的 肿瘤生长受到部分抑制，而注射AAV-TRAIL+miR-222-TuD联合治疗的病毒组，肿瘤生长在 AAV-TRAIL单独使用的基础之上又有更进一步的凋亡。也就是说，对于TRAIL敏感的细胞， TRAIL+miR-222-TuD的联合应用，仍能进一步增强细胞对TRAIL的敏感性，可以作为临床上 降低TRAIL使用剂量的新选择。
[0092] 我们对Hsa-miR-222的靶基因进行了预测，选中了一些候选靶基因，将肿 瘤组织中的蛋白提取出来进行western blot验证，最后发现，其靶基因PTEN在 AAV-TRAIL+miR-222-TuD联合治疗组是明显上调的。miRNA通过靶向抑制其靶基因来发挥 作用，而miR-222-TuD又是miR-222的特异性抑制剂，因而在体内检测到其靶基因PTEN的 上调，是和实际情况相符合的，一方面说明miR-222-TuD在体内确实发挥了抑制miR-222的 作用，另一方面说明其增强TRAIL抗性功能的机制可能是通过PTEN。
[0093] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种RNA，其特征在于，其具有： (I )、如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；或 (II )、如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的互补序列；或 (III) 、与（I )或（II )的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与 (I )或（II )的核苷酸序列不同的序列；或 (IV) 、与（I )或（II )或（III)所述序列至少有70%同源性的序列。2. 根据权利要求1所述的RNA用于抑制Hsa-miR-222的用途。3. -种组合物，其特征在于，包括TRAIL 95 281和如权利要求1所述的RNA。4. 一种重组表达载体，其特征在于，包括： (1) 编码TRAIL95 281的核苷酸序列；和/或 (2) 编码如权利要求1所述的RNA的DNA。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，将编码TRAIL 95 281的 核苷酸序列与编码如权利要求1所述RNA的DNA连接到载体中，构建表达载体。6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述载体为质粒或病毒。7. 根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述病毒为腺相关病毒。8. -种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求4所述的重组表达载体。9. 根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细胞株，所述细胞株 选自 HeLa 细胞、A549 细胞、Bel-7402 细胞、CNE-2Z 细胞、EC109 细胞、MGC-803 细胞、SW1990 细胞、DU145细胞、U251细胞、A875细胞、HCT116细胞、MCF7细胞或SK-0V-3细胞。10. 根据权利要求3所述的组合物、权利要求5所述的重组表达载体、权利要求8或9 所述的宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为原发性、继发性或转移性的 肿瘤。12. 根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、 食管癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌或卵巢 癌。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种RNA及其用途、包含该RNA的组合物、重组表达载体和宿主细胞。该RNA能有效抑制Hsa-miR-222的表达水平，增强TRAIL对肿瘤的杀伤活性。本发明提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为肿瘤基因治疗的候选病毒。
【IPC分类】C12N15/861, A61K48/00, C12N15/11, C12N5/10, C12N15/64, A61P35/00
【公开号】CN105039320
【申请号】CN201510382699
【发明人】马思思, 史娟
【申请人】中国医学科学院基础医学研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月2日