甘油糖基甘油酸作为增效剂在pcr中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高PCR效果的增效剂，尤其是甘露糖基甘油酸作为添加剂用来 提高PCR效果。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(简称PCR)是一种分子生物学技术，用于生物体外酶促合成DNA， 由高温变性、低温退火及适度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，在短时间内能使目 的DNA迅速扩增。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分 离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病诊断或任何有DNA、RNA的地方。由美国 科学家Dr. Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了 1993年诺贝尔化学奖。
[0003] 近年来，人们发现，向PCR反应体系中加入一定量的添加剂可以提高PCR扩增效率 和专一性，减少或消除副反应的产生。常见的添加剂有：DMS0、牛血清蛋白（BSA)、甘油、聚 乙二醇、吐温-20等。但是，这些添加剂各有其局限性。开发新的PCR扩增添加剂是一项非 常重要的工作，以适用于多种复杂环境的片段扩增。
[0004] 甘露糖基甘油酸（mannosylglycerate，MG)是嗜热菌体内蓄积的一种溶质，主 要发琢1存在子蹲热麗 Rhodothermus marinus, Thermus thermophiIus,私 Rubrobacter xylanophiIus, Pyrococcus, Thermococcus, Palaeococcus, Aeropyrum 等中。其主要作用为具有高温下保护蛋白、酶等生物大分子的功能，从而达到协助嗜热菌抵 御外界高温的侵害。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种PCR添加剂，以提高PCR扩增效果，效果显著，用量少，成 本低，操作方便，使用安全。
[0006] 实现本发明目的的是一种甘露糖基甘油酸PCR添加剂，在PCR反应体系中加入甘 露糖基甘油酸。
[0007] 所述甘露糖基甘油酸在PCR反应体系中的终浓度为0. 5-2. 5mg/ml。
[0008] 本发明的一种PCR增效剂的有益效果如下： 通过在PCR反应体系中添加甘露糖基甘油酸，提高了聚合酶对高温度的耐受程度，从 而使PCR反应在高温下能更稳定的进行，从而提高了 PCR的效果。
[0009] 利用甘露糖基甘油酸作为添加剂的提高PCR效果的增效剂有以下功能：（1)通过 在PCR反应体系中中添加甘露糖基甘油酸，确实提高了 PCR效果，且成本低。（2)甘露糖基 甘油酸对后续操作无影响。（3)本发明提供的甘露糖基甘油酸提高PCR扩增效果的方法操 作简单，易于实行。
【具体实施方式】
[0010] 本发明结合附图通过以下实施例进行详述，但不限于下述实施例。
[0011] 本发明涉及PCR优化的方法是向PCR反应体系中添加甘露糖基甘油酸来实现，具 体步骤如下： 1.配置甘露糖基甘油酸水溶液：称取市售甘露糖基甘油酸l-4mg，置于已灭菌的I. 5ml 离心管中，加入灭菌水使其溶解，最后定容至lml，所得溶液进行12rC，20min灭菌。
[0012] 2. PCR反应体系的配置：待扩增的DNA片段不同，PCR反应体系中dNTP、Mg2+、模板 的加入量不同；在上述反应体系中加入适量的甘露糖基甘油酸溶液，双蒸水的添加量应根 据甘露糖基甘油酸溶液的加入作相应扣减。
[0013] 3. PCR反应运行：预变性、变性、退火温度及时间应根据模板来选择，延伸时间根 据所要扩增的目的片段的长度来选择。
[0014] 4. PCR扩增产物的检测：用琼脂糖凝胶电泳检测。
[0015] 实施例1 :甘露糖基甘油酸对2kb的DNA片段的优化扩增。
[0016] 1.分别配置1，2, 3, 4mg/ml甘露糖基甘油酸水溶液。
[0017] 2. PCR反应体系的配置： 10XPCR Buffer 2. 5ul dNTP (2. 5mM) 5ul 引物 I (2. OuM) Iul 引物 2(2.0uM) Iul Mg2+ (25mM) I. 5ul 配置好上述反应体系后，分别加入14ul甘露糖基甘油酸添加剂，附图中1，2, 3, 4分别 表示加入1，2, 3, 4mg/ml的甘露糖基甘油酸溶液，这样的话，甘露糖基甘油酸溶液在PCR反 应体系中的终浓度分别为〇· 56mg/ml, I. 12mg/ml，I. 68mg/ml，2. 24mg/ml。对照组将甘露糖 基甘油酸溶液换成14ul灭菌双蒸水，如附图中5。
[0018] 3. PCR反应运行： 预变性 94 V 4min 变性 94 V 30s , 32个循环 退火 58°C 30s } 延伸 72°C Imin 进一步延伸 72°C 3 min 4. PCR下反应后用琼脂糖凝胶电泳检测：结果如图所示，所用Maker为DL2000,从图中 可以看出加入甘露糖基甘油酸添加剂的四组明显比对照组条带亮，说明甘露糖基甘油酸确 实能提高PCR效果。 【附图说明】 附图中1，2, 3,4分别表示加入1，2, 3,4g/ml的甘露糖基甘油酸溶液，图中5表示未加 甘露糖基甘油酸的对照组，所用marker为DL2000。
【主权项】
1. 一种甘露糖基甘油酸作为PCR增效添加剂提高扩增效果的方法，其特征在于，先将 甘露糖基甘油酸溶于无菌水制备甘露糖基甘油酸溶液。
2. 根据权利要求1所述的PCR添加剂，其特征在于：所述甘露糖基甘油酸溶液的浓度 为l-4mg/ml的甘露糖基甘油酸水溶液。
3. 根据权利要求1或2所述的PCR增效剂，其特征在于：向PCR反应体系中加入甘露 糖基甘油酸水溶液后甘露糖基甘油酸的终浓度为〇. 5-2. 5mg/ml。
4. 根据权利要求1所述的甘露糖基甘油酸提高PCR扩增效果的方法，其特征在于，所述 的PCR扩增包括：常规PCR，高GC片段PCR、含有较多重复序列的PCR。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种PCR增效添加剂甘露糖基甘油酸。本发明的利用添加甘露糖基甘油酸的方法，提高了DNA聚合酶对高温的耐受程度，从而使PCR反应在高温下能更稳定的进行，从而提高PCR扩增效果。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104560946
【申请号】CN201310469113
【发明人】朱道辰, 陈焱, 洪好, 朱淑静
【申请人】镇江拜因诺生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月10日