lncRNA-MALAT1在制备增生性玻璃体视网膜病变诊断试剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及lncRNA-MALATl在制备增生性玻璃 体视网膜病变诊断试剂中的应用以及一种辅助PVR疾病早期诊断的MALAT1试剂盒，及其在 辅助PVR的早期诊断中的应用和检测方法。
【背景技术】
[0002] 增生性玻璃体视网膜病变（PVR)常见于过强的冷凝、电凝、外伤后、巨大视网膜裂 孔、多发视网膜裂孔、长期孔源性视网膜脱离、多次眼内手术、眼外伤以及眼内炎症等，其潜 在的危险因素尚不十分肯定，发病机制十分复杂。因此，PVR疾病的早期诊断仍然是眼科学 家面临的最严峻挑战之一，然而迄今为止，并没有特异性强用于PVR疾病辅助诊断的生物 学指标。
[0003]PVR目前的治疗主要是采用玻璃体手术治疗。手术中应用膜剥除、视网膜切开或切 除、眼内光凝等使视网膜复位，然后用长效气体或硅油充填。虽然在大多数病例，手术中通 常可以使视网膜复位，但术后眼内细胞增生复发，仍是手术失败的主要原因。在体外或动物 实验的药物包括糖皮质激素和抗代谢药，以及放射疗法等，显示了不同程度的效果。然而在 临床应用过程仍然是收效甚微。因此，亟需寻找PVR发生的生物标记物，对PVR发生和患者 的预后判断进行科学地判断。
[0004] 长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编 码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调 控基因的表达水平。在许多人类疾病发生过程，包括肿瘤、心血管、神经系统和血液疾病等 发生过程发生异常表达。最近研宄表明，部分lncRNA可以形成稳定的二级结构，稳定地存 在于血清/血浆中，使其免受血液中大量存在的RNase的降解，表现出高度地稳定性。
[0005]肺腺癌转移相关转录子 1 (metastasis-associatedlungadenocarcinoma transcript1，MALAT1，NCBIReferenceSequence:NR_002819. 2)属于LncRNA家族成员， 编码基因定位于染色体llql3. 1，普遍表达于人类和鼠的组织细胞中，尤以神经系统突出。 MALAT1 最早于 2003 年由Ji等（JiP，DiederichsS，WangW，etal.MALAT-l，anovel noncodingRNA,andthymosinbeta4predictmetastasisandsurvivalinearly-stage non-smallcelllungcancer.Oncogene, 2003, 22:8031-41)在观察早期非小细胞肺癌 (non-smallcelllungcancer,NSCLC)的转移现象时被发现，并因此得名。后诸多研宄显 示，MALAT1与乳腺、胰腺、肺、结肠、前列腺和肝脏等组织恶性肿瘤均显著相关。
[0006] 目前，尚无lncRNA-MALATl作为增生性玻璃体视网膜病变早期诊断的生物学标记 物的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供了lncRNA-MALATl的新的用途，可作为诊断试剂用于增生性 玻璃体视网膜病变的诊断，特别是增生性玻璃体视网膜病变的早期诊断。
[0008] 本发明具体技术方案如下： 核苷酸序列如SEQIDN0:1所示的IncRNA-MALAT1在制备增生性玻璃体视网膜病变 诊断试剂中的应用。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供一种增生性玻璃体视网膜病变诊断的Inc RNA-MALAT1检测试剂盒，包括RNA抽提体系、RNA反转录反应体系和PCR反应体系，其中PCR 反应体系含有特异性扩增如权利要求1所述SEQIDN0:1基因序列的引物序列。进一步的， 所述引物序列为MALAT1特异性的qRT-PCR的上下游引物。
[0010] 上述检测试剂盒，所述RNA抽提体系包括RNA抽提试剂；RNA逆转录反应体系包 括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；PCR反应体系包括扩增系统和引物系统， 所述扩增系统为SYBRPremixExTaq?试剂；所述引物系统包括RNA反转录随机引物和 MALAT1特异性的qRT-PCR的引物，其中， 上述RNA反转录随机引物可以选择GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR引物序列。
[0011]GAPDH定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQIDN0:2所示，下游引物序列如SEQ IDN0:3 所示； Beta-tubulin定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQIDN0:6所示，下游引物序列如SEQIDN0:7 所示； MALAT1特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQIDN0:4所示，下游引物如SEQIDN0:5 所示。
[0012] 上述检测试剂盒，包括： (a) 抽提体系： 1) Trizolreagent，1 管，2000yL/ 管； 2) 氯仿，1管，500yL/管； 3) 无水乙醇，1管，8000yL/管； 4)DEPCddH20,1 管，1000yL/ 管； 5)ddH20,1 管，2000yL/ 管； 6) 异丙醇，8000yL/管； (b) 反转录体系： 1) 总RNA反转录引物（包括OligodT和Random6mers)，1 管，浓度：50yM，50yL/管； 2) 反转录酶（200U/yL) 50yL; 3)dNTPMixture(10mMeach)50yL； 4) 反转录buffer50yL; (c) PCR体系： 1) SYBRPremixExTaq酶； 2)buffer100yL； 3)MALAT1特异性的qRT-PCR上游引物，1管，10yM，100yL/管； MALAT1特异性的qRT-PCR下游引物，1管，10yM，100yL/管； GAPDH定量PCR上游引物，1管，10yM，100yL/管； GAPDH定量PCR下游引物，1管，10yM，100yL/管； 和 / 或，Beta-tubulin定量PCR上游引物，1 管，10yM，100yL/管； Beta-tubulin定量PCR下游引物，1 管，10yM，100yL/管； 4)dNTPMixture(10mMeach)50tiL〇
[0013] 本发明采用Agilent公司IncRNAmicroarray筛选出PVR疾病的视网膜增殖膜 和其他眼科疾病的视网膜增殖膜的差异表达谱，并联合应用定量PCR方法验证芯片分析结 果。最后，选用IncRNA分子MALAT1作为生物标记物，用于辅助PVR疾病的早期诊断。
[0014] 本发明中确定lncRNA-MALATl作为PVR疾病早期诊断的生物标记物包括如下步 骤： 第一步：样本准备：眼科玻璃体手术后的视网膜前膜标本（实验组，n = 30)和白内障 增殖膜标本（对照组，n= 30)，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80°C备 用。
[0015] 第二步：差异表达IncRNA筛选：采用美国Aglient公司的IncRNA表达谱芯片，分 析PVR疾病发生相关的IncRNA;分析具体步骤为：采用标记酶将荧光基团标记IncRNA，得 到用于与芯片杂交的荧光探针，在标注条件下使用MAUI杂交仪和芯片杂交；使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数值型数据进行保存；采用 GenespringGX软件分析找出PVR发生相关的IncRNA分子；这时会筛选出一系列的差异 表达IncRNA，然后结合G0和KEGG信号通路分析，结合TRANSFAC和catRAPID数据库，根据 t-testunequalunpaired算法，将P< 0.05且差异倍数在2倍以上的IncRNA确定为差异 表达IncRNA，最终确定lncRNA-MALATl为与增生性玻璃体视网膜病变相关的研宄靶点。
[0016] 第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果。
[0017] 第四步：验证靶点lncRNA-MALATl在PVR病人、正常人和手术治疗PVR病人血浆和 血细胞内的表达差异。
[0018] 第五步：基于体外细胞实验，从基本原理方面揭示lncRNA-MALATl通过调控RPE细 胞的增殖和迀移，进而确证其参与PVR病理过程的调控。
[0019] 本发明的另一目的在于提供IncRNA-MALAT1反义核苷酸在制备治疗增生性玻璃 体视网膜病变药物中的应用。
[0020] IncRNA-MALAT1反义核苷酸与靶IncRNA-MALAT1互补，抑制或封闭基因的转换和 表达，或诱导RnaseH识别或切割IncRNA-MALAT1，使其丧失功能，因此可以作为药物用于 治疗增生性玻璃体视网膜病变。
[0021] 本发明证明通过定量PCR技术，检测患者血浆或血清中MALAT1的表达来实现早期 PVR的诊断是完全可行的。