一种家蚕主要协助转运蛋白BmMFS及其融合表达和纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS及其融合表达和纯化方法。
【背景技术】
[0002]膜蛋白在生物的生命活动中扮演重要角色，作为受体、转运蛋白和通道蛋白，参与细胞黏附、信号通路以及一系列的代谢途径。基因组研究表明，膜蛋白大约占基因产物的30%，其中半数以上可作为药物设计的靶点。在蛋白数据库已解析结构的蛋白中，膜蛋白只占到0.5%左右。膜蛋白天然含量低，疏水性极强，通常需要高浓度的洗涤剂才能溶于水。这对天然膜蛋白的分离纯化造成了很大的困难，导致后续的结晶和结构解析不能顺利进行。因此提高膜蛋白的表达量并且建立易于分离纯化的方法对于膜蛋白的研究至关重要。利用基因工程方法表达重组膜蛋白仍然是研究膜蛋白的另一条有效的途径。大肠杆菌是膜蛋白表达时最常用的表达宿主，但是仍然存在膜蛋白不表达或表达量极低的情况。
[0003]多角体蛋白是昆虫杆状病毒感染昆虫后晚期高效表达的一种结构蛋白，在大肠杆菌表达系统中表达的多角体蛋白是以包涵体的形式存在的，在PH10.8及以上的条件下溶解，具有和天然多角体蛋白晶体相同的特性。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中已知膜蛋白数量少，分离纯化难等技术问题，本发明提供了一种家蚕主要协助转运蛋白汝?MFS。
[0005]本发明还提供了上述家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS的融合表达及纯化方法。
[0006]本发明通过以下技术方案实现上述目的:
一种家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0007]经家蚕蛋白库筛选，筛选出一条家蚕主要协助转运蛋白汝?MFS，经TMHMM服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM对该蛋白进行跨膜分析,得知此蛋白是含有六个跨膜区的膜蛋白。
[0008]上述家蚕主要协助转运蛋白他MFS的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所
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[0009]上述家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS的融合表达和纯化方法，是将该蛋白的编码基因与核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的多角体片段Ph20编码基因融合，构建重组表达载体表达融合蛋白，融合蛋白纯化后经凝血酶酶切，获得汝?MFS蛋白。
[0010]本发明将多角体的部分片段与膜蛋白融合表达，多角体的部分片段保持了多角体蛋白的部分特性，不用再和以前使用多角体蛋白一样必须反复调节PH值才能达到纯化的目的，大大简化了纯化步骤。
[0011]优选地，所述家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS的融合表达和纯化，具体步骤如下: (1)设计合成引物，以CDNA为模板，PCR扩增家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的编码基因；
(2)步骤(I)所得编码基因用限制性内切酶EcoRI和Xho I进行双酶切，酶切产物与同样经过EcoR I和Xho I双酶切的载体pET-32a-Ph20连接，构建重组表达载体；所述pET-32a-Ph20为pET_32a载体和多角体片段Ph20编码基因同时经和&oRI进行双酶切后再连接构建而成；
(3)重组表达载体转化宿主菌，培养诱导表达重组蛋白；
(4)步骤(3)的重组蛋白用pH值11.5的PBS搅拌溶解，再调节P H值调节至7.5^8.5，经镍离子亲和层析进行纯化。
[0012](5)将纯化后的融合蛋白用凝血酶酶切即可得到汝?MFS蛋白。
[0013]优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白BmMFS的融合表达和纯化方法中，步骤(I)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:4?5所示。
[0014]优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS的融合表达和纯化方法中，步骤(2)所述连接使用的连接酶为TOYOBO公司的ligat1n high，连接反应时间为40min。
[0015]优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS的融合表达和纯化方法中，步骤(3)所述的宿主菌为Fermentas公司的产品疋coli Rosetta。
[0016]优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS的融合表达和纯化方法中，步骤(3)所述的培养诱导条件为:在含50 μ g /mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C，220 rpm振荡培养至0D600=0.5，加入终浓度为I mM的IPTG，37°C，220 rpm诱导表达5h。
[0017]优选地，上述家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS的融合表达和纯化方法中，步骤(4)具体操作为:收集步骤(3)的培养物，经超声破碎菌体后离心，取沉淀用pH值11.5的PBS搅拌溶解，再将PH值调节至7.5^8.5，离心取上清，经0.45 μ m纤维素膜过滤后，加入镍离子亲和层析柱中，用20mM的咪唑水溶液洗脱杂蛋白，用浓度为200mM的咪唑水溶液洗脱获得目的重组蛋白。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
MFS蛋白是一种次级膜转运蛋白，转运底物的多样性使得其在细胞物质交换和能量代谢过程中起着重要作用。在最初发现时被认为只在糖类的吸收过程中起作用，随后发现该蛋白在药物外排系统、磷酸:Na+转运系统、有机磷:磷酸交换系统也发挥了重要作用。目前还没有该类蛋白在家蚕中表达及纯化的报道，本发明获得的家蚕主要协助转运蛋白ifeMFS填补了这一空白。
[0019]本实验室研究发现，多角体蛋白自N端起的20个氨基酸残基的片段在大肠杆菌中依然保持了多角体晶体的特性，并且在PH值回调至8.0时融合蛋白依然存在于上清中，大大简化了纯化过程，提高了纯化效率。本发明利用Ph20与膜蛋白融合表达的方式获得融合蛋白，通过调节PH和镍离子亲和层析的方法即可获得纯度较高的重组蛋白，克服了天然膜蛋白表达量低、分离纯化难以及利用基因工程方法难表达跨膜区多的膜蛋白的问题。
【附图说明】
[0020]图1是本发明BmWS基因的PCR扩增回收结果图；M:DNA Ladder Mix ;1:第2次PCR扩增条带。
[0021]图2是本发明pET-32a-Ph20-汝?MFS重组表达载体的PCR和双酶切鉴定图:M:DNALadder Mix ；1:PCR的产物；2:双酶切的产物。
[0022]图3是本发明重组融合蛋白的表达图:M:蛋白分子量标准；1:pET-32a空载体诱导对照；2.pET-32a-汝?MFS 未诱导；3.pET_32a_汝?MFS 诱导；4.pET_32a_Ph20-汝?MFS 未诱导；5.pET-32a-Ph20-汝?MFS 诱导。
[0023]图4是本发明重组融合蛋白通过调节pH进行纯化的情况；M:蛋白分子量标准；1.超声后上清；2.pH8.0上清；3.pH8.0沉淀；4.pH9.0上清；5.pH9.0沉淀；6.ρΗ10.0 上清；7.ρΗ10.0 沉淀；8.ρΗ11.0 上清；9.ρΗ11.0 沉淀；10.ρΗ11.5 上清；
ll.pHll.5 沉淀。
[0024]图5是本发明重组目的蛋白通过镍柱进一步纯化的结果。M:蛋白分子量标准；1:纯化后的融合蛋白。
[0025]图6是本发明重组目的蛋白的Western blotting鉴定图；M:蛋白分子量标准；I:pET-32a空载诱导对照；2.pET_32a_汝?MFS未诱导；3.pET_32a_汝?MFS诱导；4.pET-32a-Ph20-汝?MFS 未诱导；5.pET-32a_Ph20-汝?MFS 诱导。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中如无特殊说明，均为本领域常规试剂及操作手段。
[0027]生物材料及试剂来源:
pET_32a载体、限制性内切酶&01? I和限制性内切酶ISo I购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技公司，氨苄青霉素购自上海恒远生物科技有限公司，LB培养基购自Oxoid公司，连接酶ligat1n high购自Τ0Υ0Β0公司，疋coli TGl感受态细胞购自 Fermentas 公司，E.coli Rosetta 购自 Fermentas 公司。
[0028]实施例1家蚕主要协助转运蛋白汝?MFS的制备 1.BmWS的筛选
经本实验室家蚕蛋白库筛选，筛选出一条家蚕主要协助转运蛋白(5M1FS)，经TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对该蛋白进行跨膜区分析,发现此蛋白是含有六个跨膜区的膜蛋白(是为了预测i^MFS基因表达出的蛋白是一个六次跨膜蛋白)。
[0029]2.扩增汝?MFS的编码基因
(I)根据^sMFS的特性，设计引物F和R，以家蚕蚕蛹cDNA为模板，进行PCR，扩增他MFS的编码基因