一种甜菜夜蛾卵黄原蛋白、其特异性肽链、载体、菌株及应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白(Spodoptera exigua Vitellogenein，SEVg)的DNA序列。本发明还公开了一种可利用Western?blot检测AlVg蛋白表达量的特异性多肽序列，本发明还公开了一种SEVg多肽的多克隆抗体及其制备方法。利用此多肽特异性抗体分析SEVg在甜菜夜蛾体内的组织分布及蛋白水平上的差异表达。应用本发明，可以用于田间对于甜菜夜蛾种群动态的测报工作，也可为该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。
【专利说明】
-种甜菜夜蛾卵黄原蛋白、其特异性化链、载体、菌株及应用
技术领域
[0001] 本发明设及农业科学技术领域，具体设及一种甜菜夜蛾卵黄原蛋白、其特异性肤 链、载体、菌株及应用。
【背景技术】
[0002] 甜菜夜蛾Spodoptera exigua(册bner)属鱗翅目夜蛾科，是一种世界性分布的多 食性重要害虫，可严重危害多种重要经济作物。目前农业生产上的甜菜夜蛾防控面临严峻 挑战，由于其繁殖能力强及较高的抗药性，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控 手段。田间种群预测测报是其防治的重要一环，直接关系到病虫防治的效果，对保证农业丰 收具有重大作用。卵黄原蛋白（Vg)是昆虫体内卵黄的主要成分，其含量高低直接影响雌成 虫产卵潜力大小。通过检测Vg含量开发害虫种群测报工作是一种甜菜夜蛾种群测报的新兴 方法。然而目前对于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白（Spodoptera exigua Vitellogenein，SEVg) 蛋白表达量的检测方法相对匿乏。同时SEVg蛋白在昆虫体内是相对比较大的蛋白，很难全 长表达，进而合成特异性抗体较难。因此分离纯化SEVg基因特异性肤链，制备其多克隆抗 体，一方面可W预测甜菜夜蛾产卵量及田间爆发潜力，可为甜菜夜蛾田间种群测报新技术 的研发提供基础；另一方面可为掲示预测甜菜夜蛾的卵黄发生规律、卵黄蛋白的降解W及 激素调控机理等研究提供了良好的方法保障。
【发明内容】
[0003] 发明目的:本发明的第一个目的是提供一种用于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白（SEVg) 的DM序列。
[0004] 本发明的另一个目的在于提供一种甜菜夜蛾卵黄原蛋白。
[0005] 本发明的又一个目的是提供一种用于编码甜菜夜蛾SEVg特异性肤链的DNA序列。
[0006] 本发明的又一个目的是提供一种甜菜夜蛾SEVg特异性肤链。
[0007] 本发明的又一个目的是提供含有所述的用于编码甜菜夜蛾SEVg特异性肤链的DNA 序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
[000引本发明的又一个目的是提供一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达 载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
[0009] 本发明的又一目的是提供一种甜菜夜蛾SEVg特异性肤链的制备方法。
[0010] 本发明的又一目的是提供一种甜菜夜蛾SEVg多克隆抗体。
[0011] 本发明的又一目的是提供一种甜菜夜蛾SEVg多克隆抗体的制备方法。
[0012] 本发明的又一个目的是提供一种甜菜夜蛾SEVg多克隆抗体的化LSA检测方法。
[0013] 本发明的又一个目的是提供一种甜菜夜蛾SEVg多克隆抗体的Western blot检测 方法。
[0014] 技术方案:为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供一种用于编码甜菜 夜蛾卵黄原蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] 本发明的内容还包括一种甜菜夜蛾卵黄原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所 /J、- ο
[0016] 本发明的内容还包括一种用于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链的DM序列， 其碱基序列如SEQ ID NO:3所示。
[0017] 本发明的内容还包括一种甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0018] 本发明的内容还包括含有上述的用于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链的DM 序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0019] 本发明的内容还包括将上述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达甜 菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链的重组表达载体。
[0020] 其中，上述大肠杆菌表达载体为pCznl。
[0021] 本发明的内容还包括一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导 入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
[0022] 本发明所述的大肠杆菌为化21 (DE3)。
[0023] 本发明所述的SEVg蛋白的特异性肤链DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞 系统或转基因重组菌在生产SEVg蛋白特异性肤链抗体中的应用。
[0024] 本发明的内容还包括一种SEVg蛋白特异性肤链的制备方法，是培养所述的转基因 重组菌得到的SEVg蛋白特异性肤链。
[0025] 本发明的内容还包括一种SEVg蛋白特异性肤链抗体的制备方法，是经过抗原亲和 纯化法获得针对SEVg蛋白特异性肤链多克隆抗体。
[0026] 本发明的内容还包括一种SEVg蛋白特异性肤链的制备方法，包括W下步骤：
[0027] 1)、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链cDNA片段的PCR扩增，所述甜菜夜蛾卵黄原蛋 白特异性肤链cDNA序列如SEQIDN0:3所示；
[0028] 2)、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链cDNA片段的原核表达载体构建；
[0029] 3)、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链的变性和复性；
[0030] 4)、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肤链的纯化即得。
[0031] 然后将上述得到的SEVg蛋白特异性肤链采用抗原亲和纯化法获得针对SEVg蛋白 特异性肤链多克隆抗体;最后Western杂交验证SEVg蛋白特异性肤链抗体的效果。
[0032] 有益效果:本发明相对于现有技术，具有W下优点：
[0033] 本发明将原核表达纯化的SEVg蛋白特异性肤链应用于免疫家兔后制备了多克隆 抗体，在通过利用化ISA法确定了该多克隆抗体的效价后，发明人建立了一套高效、高灵敏 度和准确的Western blot方法，可特异性地从甜菜夜蛾体内检测出Vg蛋白。本发明纯化出 的SEVg蛋白特异性肤链抗体可用于甜菜夜蛾雌成虫Vg含量的检测，预测甜菜夜蛾田间爆发 潜力，对甜菜夜蛾田间种群测报新技术的研发着重要的实践指导作用。同时应用本发明，可 为卵黄发生规律及激素调控机理等研究提供物质基础和技术支撑。
【附图说明】
[0034] 图1:沈Vg的结构图；
[0035] 图2:SEVg蛋白特异性肤链DNA序列的PCR扩增电泳图；泳道1 :SEVg蛋白特异性肤链 DM序列；泳道2:为2000bp的DM maker;
[0036] 图3: SEVg特异性肤链cDNA序列连接pCznl表达载体后Ndel和Xbal双酶切图谱；泳 道1:为5000bp的DNA maker;泳道2 :pCznl载体片段及SEVg蛋白特异性肤链基因；
[0037] 图4 pCzn 1 -SEVg特异性肤链基因序列利用诱导表达的经12 % SDS-PAGE分析电泳 图；泳道M:为蛋白maker;泳道1:未经诱导菌株的总蛋白；泳道2:诱导菌株的总蛋白；泳道3: 经0.5mM IPTG在37°C诱导祀标载体表达的总蛋白包涵体;泳道4:经0.5mM IPTG在37°C诱导 祀标载体表达的总蛋白上清液；
[003引图5 SEVg特异性肤链诱导表达，纯化后经12 % SDS-PAGE电泳分析图谱；泳道Μ:为 蛋白maker;泳道1:经0.5mM IPTG在37°C诱导祀标载体表达的总蛋白包涵体;泳道2:纯化后 的祀标蛋白；
[0039] 图6利用特异性肤链抗体Western杂交SEVg蛋白图谱；泳道M:为250kd蛋白maker; 泳道l-3:80yg、4化g和20yg甜菜夜蛾总蛋白（加1抗和2抗），泳道4为水(加1抗和2抗）；泳道5 为80yg甜菜夜蛾总蛋白（不加1抗和2抗）。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0041 ]实施例1: SEVg全长基因的获得
[0042] 采用TRIzol法提取甜菜夜蛾总RNA，选择电泳图谱良好并且0D260/0D280值在1.8 ~2.0之间的总RNA样品合并进行mRNA的纯化，反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为:0.5 yg总ΚΝΑ，2.5μ1 01ig〇-dT18,加1 MMlv Buffer,扣1 lOmM dNTP，40U RNasin，0.加1 MMlv 反转录酶（reverse transcrip1:ase)，加 dd出0至20μ1; PCR反应参数为：42°C Ih，95°C lOmin。 根据已知昆虫Vg基因的保守序列设计适用于PCR扩增引物SEVg-lF(5 / - GCTGAATGGCGACGAGAGCT-3')及沈Vg-1R(5' -CTCATGGAAGCGATAATGCGGAC-3')，获得沈Vg基因 保守序列，该保守序列参见序列表中的SEQ ID N0:11，PCR反应体系为:5μ1 10X反应缓冲 液，5μ1 25mM Mg2+，如1 lOmM (1ΝΤΡ，0.5μ1 Taq plus DNA聚合酶，1.5μ1 ΙΟμΜ上游引物 沈Vg-1-F，1.5yl ΙΟμΜ下游引物沈Vg-1-R，cDNA模板化1，加 d地20至50yl;PCR反应参数为： 941：5111111;941：3〇3,551：3〇3,721：6〇3,40个循环；72°(：继续延伸1〇111111;在根据获得的沈￥邑 基因的保守序列设计 RACE 引物56￥邑-抑。6-5'3(5'-64〔4〔66了66了66〔46了61'(：-3')，56￥邑- race-3' F(5' -GCTTTGTACATGAGTGTACAGTCA-3')，扩增方法具体参见Clontech公司的cDNA末 端的快速扩增(RACE)试剂盒的方法进行，PCR反应参数为:94 °C 30 s，70°C 180 s，5个循环;94 1：3〇3,7〇1：3〇3,72°(：18〇3,5个循环；941：3〇3,681：3〇3,72°(：18〇3,72°(：继续延伸1〇111111。通 过序列拼接，SEVg基因全长5357bp，开放阅读框(0RF)为5286bp，编码1761氨基酸，包含Ξ个 结构保守域:Vitellogenin_N，DUF1943，VWD(图 1)。
[0043] 结论:SEVg基因0RF框包5286个碱基，编码1761个氨基酸，预测分子量200.48kDa。
[0044] 实施例2: SEVg蛋白特异性肤链cDNA克隆
[0045] 根据已测得的SEVg基因全长序列用DNAMAN软件预测SEVg蛋白特异性肤链cDNA序 列，并设计？(^扩增引物56￥邑-3。（5'-〔4了66〔444(：了66〔444(：1'門4-3')及56￥邑-31?(5'- TAATTCCACTCTTGATAGCAGAAC-3/ )，获得沈Vg蛋白特异性肤链基因序列，PCR反应体系为:5μ1 10Χ反应缓冲液，5μ1 25mM Mg2%祉 1 lOmM (1ΝΤΡ，0.5μ1 Takala LA DNA聚合酶，1μ1 ΙΟμΜ 上游引物SEVg-3F，化1 ΙΟμΜ下游引物沈Vg-3R，cDNA模板化1，加 d地2〇至0μ1; PCR反应参数 为:941：5111111;941：3〇3,551：3〇3,721：2111111，35个循环；72°(：继续延伸1〇111111。电泳结果显示 PCR扩增拼接后，得到与预期大小209化P相符的条带（图2)。将PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶 电泳分离和胶回收纯化目的DNA，与pGEM-TEasy载体进行连接，转入大肠杆菌DH5a，挑选单 菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步表达载体构建。
[0046] 结论:SEVg蛋白特异性肤链基因序列包含2091个碱基，编码697个氨基酸。
[0047] 实施例3: SEVg蛋白特异性肤链DNA原核表达载体的构建
[0048] 含有SEVg蛋白特异性肤链基因 T载体的原核表达载体构建方法为:将上述测序正 确的PCR产物连入pGEM-TEasy的载体及pCznl均用限制性内切酶Nde巧肋bal双酶切，进行连 接。酶切体系为:2种限制性内切酶各1.化1，10 X Buff er缓冲液2.化1，带有合适酶切位点的 基因片段ΙΟ.ΟμΙ，用dd此0补足至20μ1，37Γ水浴化。连接体系为:酶切回收后的载体5.化1， 基因片段10. 〇μ1，T4DNA连接酶1.0μ1，10 X Buffer缓冲液2.0μ1，用dd此0补足至20μ1，16°C 反应12~16h，连接成功后的酶切图谱见图3。连接产物转化大肠杆菌化21(DE3)后采用PCR 筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒命名为pCznl-SEVg转化到10化1大肠杆菌化21(DE3) 感受态细胞后，置冰上20min，42°C热激90s，迅速至冰中5min，加入600ul LB培养液振摇一 个小时，离屯、后涂布到含卡那霉素(50yg/mU的平板上，37°C倒置培养过夜;从转化后培养 过夜的平板上挑单克隆到3ml LB培养液的试管中，37Γ摇床中振荡培养过夜;次日将菌液 按1 %的比例接种到LB液体培养基(含50yg/mL卡那霉素）中，37 °C摇床(200巧m)振摇至菌液 的0D600达到0.6-0.8之间（约化）。取出1ml培养物，lOOOOg室溫离屯、2min，弃上清，用10化1 1 X上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37°C22化pm 振摇12h，诱导祀标载体融合蛋白表达；取出1ml培养物，12000g室溫离屯、2min，弃上清，用 100μΙ 1 X上样缓冲液重悬菌体沉淀，进行12%SDS-PAGE电泳检测（图4)。
[0049] 结论:经37°C，0.5mM IPTG诱导12h后沈Vg特异性肤链基因可在pCznl载体中进行 高效表
[(K)加 ]达，主要W包涵体形式存在。
[0051 ]实施例4: SEVg蛋白特异性肤链变性和复性及蛋白的纯化
[0052] 祀标融合蛋白的提取及纯化：将实施例3诱导表达后的培养菌液低溫4°C离屯、 6000g，10min，菌体沉淀重悬与20ml裂解buffer(包含20mM Tris-肥l、lmM PMSF和细菌蛋白 酶抑制剂cocktail混合液，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4s，间歇8s，共20min);将超 声破碎的细胞裂解液4°ClOOOOg离屯、20min，收集沉淀;使用包涵体洗涂液(20mM化is，ImM EDTA，2M尿素，IM化Cl，1 %Triton X-100，p服.0)洗涂包涵体3次；用溶解缓冲液（20mM 化iS，5mM DTT，8M尿素抑8.0)，按一定比例溶解包涵体，4度放置过夜。室溫，15000巧m离屯、 15min，将包涵体溶解液滴加至lj(20mM Tris-肥L，5mM EDTA Buffer，PH7.8)缓冲液中逐步成 倍梯度稀释，缓慢揽拌，将蛋白溶液装入透析袋于PBS pH7.4溶液中透析过夜。利用低压层 析系统，包涵体溶液W〇 . 5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA- Sepharose 化-6B亲和层析柱，用化-IDA Binding-Buffe;r、Ni-IDA Washing-Buffe;r、Ni- IDA Elution-Buffer洗脱目的蛋白，收集流出液。将蛋白溶液装入透析袋于4°C在20mM PBS，pH 7.4中透析过夜，进行12 % SDS-PAGE电泳检ii (图5)。
[0053] 结论:通过变复性的方式，重溶，纯化获得祀标蛋白，电泳检测为目的蛋白，并呈现 单一条带。
[0054] 实施例5: SEVg蛋白特异性肤链抗体制作
[0055] 动物免疫:将实施例4纯化的祀标蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰白兔 (2-2.5KG)，皮下免疫40化g/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接化ISA方法确 定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50000进行，最终采血制备抗血清，并准备纯化。抗 体纯化:将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混 合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在 PBS中进行4 °C透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
[0056] 结论:获得高质量的SEVg蛋白特异性肤链抗体，抗体的浓度0.5mg/ml，抗体纯化后 纯度在90 % W上。
[0057] 实施例6: SEVg蛋白特异性肤链多克隆抗体的化LSA检测
[005引据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。用PBS包被液将SEVg蛋白稀释成 需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔1(Κ)μ1，4Γ冰箱过夜。包被抗原:SEVg蛋白；包被浓度： 5μg/ml，10化1/孔;包被缓冲液:憐酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4);包被好后，弃去包被液，洗板3 次，每孔加入20化1封闭液，37 °C恒溫箱比。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。一抗反应:SEVg 蛋白纯化抗体按1/500,2倍稀释，每孔l(K)yl，37°C恒溫箱化。二抗反应:取出酶标板，弃去内 液，洗板3次，向每孔中加入10化1稀释好的酶标二抗，酶标二抗:羊抗兔-HRP(钟鼎生物公 司），1/5000。37 °C恒溫箱1小时。取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入10化1 TMB显 色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37°C，15min。每孔加入10化1 1M Η化溶液，终止 反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将0D值大于设定的阴性对照0D值的2.1倍的孔对应的稀 释度，定为该样品的效价。
[0化9] 表1抗体间接Elisa结果 [0060]
「00611
[0062] 起始稀释度：1:500
[0063] 效价即样品0D/空白0D〉= 2.1的最高稀释度
[0064] 结论:甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体效价均大于1:512000。
[0(?日]实施例7 :Weste;rn杂交验证
[0066] 甜菜夜蛾饲养:供试虫源为室内人工继代饲养的甜菜夜蛾(江苏盐城大丰市大丰 港农田）。人工饲料W玉米粉和麦胚粉为主要原料，辅W-些维生素和抗生素;饲养条件为 溫度(26±1)°C，相对湿度70%±5%，光周期1^:0=14:10。成虫期补充10%蜂蜜水，用养虫 笼室溫饲养。取甜菜夜蛾羽化2日龄成虫，提取蛋白开展Wes tern杂交实验。
[0067] Western杂交样品使用10头雌成虫所提取的蛋白样品，总蛋白提取使用南京钟鼎 生物技术有限公司的总蛋白提取试剂盒。取组织样品通过RIPA裂解液提取蛋白，按梯度上 样80yg，4化g，20yg等。上样完毕后，聚丙締酷胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V 直到电泳结束。电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5小时。电转结束后， 取下膜后先用PBS洗涂4次，每次5分钟。然后置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37°C1小时。用 封闭液稀释一抗(SEVg蛋白纯化抗体），膜在一抗稀释液中37°C反应1小时。洗膜4次，每次5 分钟；用含5%牛奶的封闭液稀释二抗(钟鼎生物公司的羊抗兔-HRP)。膜在二抗中37°C反应 1小时。洗膜E化显影(参见图6)。
[0068] 结论:SEVg蛋白特异性肤链抗体可W用于Western杂交分析SEVg蛋白的表达情况， 其杂交出的单一条带在200-210kDa之间，与SEVg蛋白预测分子量一致。
[0069] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -种甜菜夜蛾卵黄原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。3. -种用于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO: 3所示。4. 一种甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所 不。5. 含有权利要求3所述的用于编码甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链的DNA序列的重组 表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。6. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求3所述的DNA序列插入 到大肠杆菌表达载体中得到的表达甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链的重组表达载体。7. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pCznl。8. -种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求5或6所述的重组表达载 体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。9. 权利要求3所述的DNA序列、权利要求5所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基 因重组菌在生产甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链抗体中的应用。10. -种甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的PCR扩增，所述甜菜夜蛾卵黄原蛋白特 异性肽链cDNA序列如SEQIDN0 :3所示； 2) 、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链cDNA片段的原核表达载体构建； 3 )、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链的变性和复性； 4)、甜菜夜蛾卵黄原蛋白特异性肽链的纯化即得。
【文档编号】C07K16/18GK106011144SQ201610350116
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】赵静, 孙洋, 肖留斌, 谭永安, 柏立新
【申请人】江苏省农业科学院