专利名称：一种超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，是一种超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽的方法。
背景技术：
目前使用的食品抗氧化剂大多是化学合成物如BHA、BHT等，虽然抗氧化效果良好，但对人体肝、脾、肺等有害，具有蓄积性致癌作用。近年来，人们逐渐把目光转向天然抗氧化剂。研究发现蕴藏于蛋白质多肽链中的肽类物质具有较强的抗氧化活性，并且其抗氧化活性往往强于母体蛋白质和氨基酸。与人工合成的食品抗氧化剂相比，抗氧化肽更加安全可靠，制备天然抗氧化肽替代合成抗氧化剂已成为当前抗氧化剂研究热点之一。此外有 报道证实抗氧化肽还具有抗癌、抗诱导及抗衰老等其他生物活性，因此抗氧化肽不仅在食品工业，而且在医药、化妆品和整形外科等领域中都得到了广泛的应用。一般蛋白质经过酸、碱水解或酶解等反应均可得到抗氧化活性肽。因酶解反应具有条件温和、专一性强、安全性高、副产物少、价格低廉且可得到特定的活性肽等优点，已成为制备活性肽的主流方法。但是酶解反应在常规水浴中进行时，需要较长的反应时间，费时费力；在酸、碱及有机溶剂等介质中进行时，易使酶蛋白变性失活，酶解效率降低。而利用微波或者超声波等物理手段辅助酶解蛋白质制备多肽，不但可以大大缩短酶解时间，提高酶解效率，而且可以获得含量丰富的多肽和氨基酸。采用微波辅助处理蛋白质，可使其结构变得更松散，暴露出更多的作用位点与酶结合，使水解反应更快更有效地进行，水解度得以提高。超声波对酶解反应的影响主要是其超声效应，包括热效应、机械效应、空化效应和化学效应等。超声波可在液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量的释放，可以提高许多化学反应的速度。中国专利文献CN102273543A公开了一种超声波辅助酶解制备花生抗氧化肽的方法，利用超声波辅助酶解，可提高酶解过程中肽的释放量，并使所得花生抗氧化肽的抗氧化活性增强。中国专利文献CN101962596A公开了同步制备核桃油和核桃蛋白肽的方法，在加入蛋白酶或符合蛋白酶水解的同时进行微波处理辅助酶解。然而，同时利用超声波-微波辅助酶解蛋白制备抗氧化肽尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽的方法，包括以下步骤
(1)酶解底物制备用去离子水配制鲑鱼蛋白溶液做为酶解底物；
(2)酶解调节酶解底物的pH值，然后加入碱性蛋白酶，放入水浴中先酶解；
(3)超声波-微波辅助酶解打开电脑微波-超声波组合催化合成仪对酶解物进行超声波-微波辅助酶解，其中超声波的探头插入深度固定不变，微波处理后，继续酶解，灭酶；
(4)灭酶后将反应液离心分离，取上清液，冷冻干燥后得抗氧化肽粉剂。所述的步骤(3)中微波功率500W、超声功率100W、超声-微波处理温度为41°C条件下处理9. 7分钟。所述的步骤(I)中鲑鱼蛋白溶液的浓度为5 mg/mL。所述的步骤(2)中每50mL酶解底物加入O. 002g碱性蛋白酶。所述的步骤(2)中碱性蛋白酶的主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，酶活范围为20 万 u/go所述的步骤(4)中冷冻干燥的条件为-80°C，_2Pa。所述的超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽的方法包括以下步骤
(O酶解底物制备用去离子水配制浓度为5mg/mL的鲑鱼蛋白溶液50mL做为酶解底
物；
(2)超声波-微波辅助酶解调节酶解底物的pH值8.2，然后加入碱性蛋白酶O. 002g,放入41°C的水浴中先酶解5min ；
(3)打开电脑微波-超声波组合催化合成仪对酶解物进行超声波-微波辅助酶解，其中超声波的探头插入深度固定不变，微波功率500W、超声功率100W、超声-微波处理温度为41°C条件下处理9. 7分钟后，继续酶解，在总酶解反应时间达2h时100°C灭酶；
(4)灭酶后将反应液离心分离，取上清液，冷冻干燥后得抗氧化肽粉剂。所述的步骤(2)中碱性蛋白酶的酶活范围为20万u/g。所述的步骤(4)中冷冻干燥的条件为-80°C，_2Pa。本发明优点在干
1、本发明将超声波技术、微波技术与酶学生物技术三者相结合；
2、与常规法制备的肽相比，无化学反应，減少了生物活性物质的改变，減少了有机溶剂的利用，利用超声波-微波辅助酶解后缩短酶解时间，而且经实验验证显著提高了鲑鱼肽的抗氧化能力；
3、本发明エ艺简单，可产业化生产，具有较高的经济及社会效益。
图I.邻苯三酚反应体系的吸收光谱。图2.超声-微波处理时间对清除率的影响。图3.超声功率对清除率的影响。图4.超声-微波处理温度对清除率的影响。图5.超声波功率(X1)与超声波-微波处理时间(X2)的等高线(a)及响应面(b)(X3=40)。图6.超声波-微波处理时间(X2)与超声-微波处理温度(X3)的等高线(C)及响应面(d) (X1=ISO)0图7.超声-微波处理温度(X3)与超声功率(X1)的等高线(e)及响应面(f)(X2=8)。 图8.微波功率对超氧阴离子自由基清除率的影响。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I响应面法优化超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽 I.材料与设备
I.I原料与试剂
鲑鱼胶原蛋白(Salmon collagen, SC),武汉天天好生物制品有限公司；Tris_HCl盐购买于Sigma ;碱性蛋白酶购买于庞博生物技术有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。需要说明的是，本发明所用的碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶。酶活范围为20万u/g，购买于庞博生物技术有限公司。
I. 2实验仪器设备
紫外可见分光光度计，UV-2450 ;精密pH计，PHS-3C ；电脑微波超声波组合催化合成/萃取仪，XH-300A ;真空冷冻干燥机，FD-80。需要说明的是，本发明所使用的电脑微波超声波组合催化合成/萃取仪(XH-300A)购买于北京祥鹄科技发展有限公司。使用的紫外可见分光光度计(UV-2450)购买与岛津国际贸易(上海)有限公司。2.实验方法
2.1超声波-微波辅助酶解制备抗氧化肽
用去离子水配制浓度为5 mg/mL的鲑鱼胶原蛋白溶液,并调节到酶的最适pH值8. 2,然后加入碱性蛋白酶，放入40°C的水浴中先酶解5min，然后用电脑微波超声波组合催化合成仪对其进行超声波-微波处理。总酶解反应时间达2h时100°C灭酶，离心分离，取上清液为抗氧化肽粗品，检测其超氧阴离子自由基清除率。以抗氧化肽清除超氧阴离子自由基的能力为指标，将微波功率固定，先研究超声功率、超声波-微波处理时间、超声-微波处理温度3个单因素的影响，确定各自的取值范围。在单因素实验的基础上，确定3因素3水平的范围，用响应面法进行数据回归分析以及显著性检验，然后研究微波功率对抗氧化肽清除超氧阴离子自由基的影响，确定了超声-微波辅助酶解制备抗氧化肽的最优条件。2.2邻苯三酚反应体系测定波长确定
取0. 5mol/Ltris-Hcl缓冲液(pH 8. 2) 5mL,置于25°C水浴中预热20 min,分别加入ImL配好的样品蛋白溶液5mg/mL再加3. 7mL去离子和0.3 mL ,3 mmol/L邻苯三酹溶液,混匀后于25°C水浴中，以HCl为空白，在200-500 nm近紫外光区用UV-2450紫外分光光度计分别在反应时间为3、6、8、I Imin进行快速扫描测定其吸收波长。2. 3超氧阴离子自由基清除率的检测
取0. 5mol/L Tris-Hcl缓冲液(pH 8. 2) 5mL，置于25°C水浴中预热20 min，分别加入I mL配好的样品蛋白溶液5mg/mL再加3. 7mL去离子水和0.3 mL ,3 mmol/L邻苯三酹溶液，混匀后于25°C水浴中，以HCl为空白，测定其吸光度。清除率=(A0-Ai)/A。X 100%
(A0为空白的吸光度值，Ai为样品的吸光度值)。3.结果与分析3. I邻苯三酚反应体系的吸收光谱与测定波长确定
邻苯三酚自氧化过程为链式反应，在碱性条件下能够迅速自氧化，产生稳定浓度的超氧阴离子自由基(O2 ·_ )与中间物，中间物又与超氧阴离子自由基反应，得到一种带有顔色的中间产物，此物在紫外区有吸收。邻苯三酚自氧化被广泛应用于抗氧化剂初步筛选及各种抗氧化物质清除超氧阴离子自由基的抗氧化能力的评价，该法在实际应用时检测波长、检测时间对检测结果影响显著。以HCl为空白，在200-500 nm近紫外光区用UV-2450紫外分光光度计分别在反应时间为3、6、8、llmin进行快速扫描測定其吸光度，结果如图I所示。从图I可以看出在3 8分钟之内邻苯三酚自氧化反应体系最大吸收波长为327nm，反应体系最大吸收波长随反应时间的变化不显著，可以用327nm作为邻苯三酚自氧化反应体系的检测波长。在3 8分钟之内反应体系的吸光值也不随反应时间而变化，说明在此时间内有色中间产物的积累是稳定的，确定反应时间在8分钟之内。3. 2单因素实验
3. 2. I超声-微波处理时间对超氧阴离子自由基清除率的影响固定微波功率500W，超声波功率250W，超声-微波温度为50°C，条件下，考察超声-微波处理时间对抗氧化肽清除超氧阴离子自由基能力的影响。如图2所见，随着超声-微波处理时间的增加，抗氧化肽清除超氧阴离子自由基能力逐渐増大，在Smin时达到最大。超过8min，清除率降低。这主要是由于在Smin前，超声波-微波处理后，使得蛋白质_酶体系更加均匀，促进了底物与酶的结合。同时使某些具有抗氧化性的氨基酸暴露使其超氧阴离子自由基清除能力增强。8min后清除率降低，可能是由于随着超声-微波处理时间的延长酶-蛋白体系已经饱和，继续超声-微波处理，由于空化作用、机械作用使得已经结合的但还未及时酶解的酶-蛋白体系破坏，从而使得超氧阴离子自由基清除率下降。3. 2. 2超声功率对超氧阴离子自由基清除率的影响
固定微波功率500W，超声波-微波处理温度50°C，超声-微波作用时间8min条件下，考察超声功率对抗氧化肽清除超氧阴离子自由基能力的影响。如图3所示，在较低功率的超声波-微波处理后，可以提高超氧阴离子清除率，但是当超声功率増加到150W后其清除率反而降低。这可能是由于超声功率増加后超声波的热效应及瞬态空化作用増加，使酶的活性受到影响甚至结构破坏，从而抑制了酶解，造成清除率降低。3. 2. 3超声-微波处理温度对超氧阴离子自由基清除率的影响
固定微波功率500W，超声波功率150W，超声-微波作用时间8min条件下，考察超声-微波处理温度对抗氧化肽清除超氧阴离子自由基能力的影响。如图4所示，在40°C以内随着超声-微波处理温度的升高，热效应不断増加，酶解速度加快，从而使超氧阴离子自由基清除率増大，40°C时达到最大，继续升高处理温度，清除率明显下降。这可能是由于随着温度的持续升高瞬时压カ差増大，使空化泡破裂导致空化效应降低，从而使得清除率降低。这与Yasuo Iida所报到的超声场中温度变化对蛋白释放的影响相一致。3. 3超声波-微波辅助酶解制备抗氧化肽响应面实验
3.3. I模型建立
在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken中心设计原理进行实验设计,取超声功率、超声-微波处理时间及处理温度作为3因素水平(结果见表I )，借助MINITAB软件中设计三因素三水平的中心组合设计(结果见表2)，最后用响应面分析法进行回归分析。
表I . Box-Behnken试验因素和水平编码值
权利要求
1.一种超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)酶解底物制备用去离子水配制鲑鱼蛋白溶液做为酶解底物；(2)酶解调节酶解底物的pH值，然后加入碱性蛋白酶，放入水浴中先酶解；(3)超声波-微波辅助酶解打开电脑微波_超声波组合催化合成仪对酶解物进行超 声波-微波辅助酶解，其中超声波的探头插入深度固定不变，微波处理后，继续酶解，灭酶；(4)灭酶后将反应液离心分离，取上清液，冷冻干燥后得抗氧化肽粉剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中微波功率500W、超声功 率100W、超声-微波处理温度为41°C条件下处理9. 7分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中鲑鱼蛋白溶液的浓度为 5 mg/mL0
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中每50mL酶解底物加入 0. 002g碱性蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中碱性蛋白酶的主要酶成 分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，酶活范围为20万u/g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中冷冻干燥的条件 为-8(TC，_2Pa。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超声波-微波协同酶解制备抗氧化 肽的方法包括以下步骤(1)酶解底物制备用去离子水配制浓度为5mg/mL的鲑鱼蛋白溶液50mL做为酶解底物；(2)超声波-微波辅助酶解调节酶解底物的pH值8.2，然后加入碱性蛋白酶0. 002g, 放入41°C的水浴中先酶解5min ；(3)打开电脑微波-超声波组合催化合成仪对酶解物进行超声波_微波辅助酶解，其 中超声波的探头插入深度固定不变，微波功率500W、超声功率100W、超声-微波处理温度为 41°C条件下处理9. 7分钟后，继续酶解，在总酶解反应时间达2h时100°C灭酶；(4)灭酶后将反应液离心分离，取上清液，冷冻干燥后得抗氧化肽粉剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中碱性蛋白酶的酶活范围 为20万u/g。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中冷冻干燥的条件 为-8(TC，_2Pa。
全文摘要
本发明涉及一种超声波-微波协同酶解制备抗氧化肽的方法，包括以下步骤(1)酶解底物制备；(2)加入碱性蛋白酶酶解；(3)超声波-微波辅助酶解；(4)灭酶后将反应液离心分离，取上清液，冷冻干燥后得抗氧化肽粉剂。本发明优点在于将超声波技术、微波技术与酶学生物技术三者相结合。与常规法制备的肽相比，无化学反应，减少了生物活性物质的改变，减少了有机溶剂的利用，利用超声波-微波辅助酶解后缩短酶解时间，而且经实验验证显著提高了鲑鱼肽的抗氧化能力。本发明工艺简单，可产业化生产，具有较高的经济及社会效益。
文档编号C12P21/06GK102649974SQ20121014741
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者史华进, 康俊霞, 康永锋, 李艳, 王磊 申请人:上海海洋大学