专利名称：金钗石斛开花素DnFT基因及其克隆方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及金钗石斛开花素fe/T基因及其克隆方法、含有ito/T基因的重组表达载体、ito/T基因编码的多肽，以及ito/T基因在促进植物提取开花中的应用。
背景技术：
站SM输{ Dlnobile Lindl)是常用名贵中药材，除了药用价值外，金钗石斛因其花形优美，花色变化多端，花姿优美，清香宜人，花期长，常作为盆栽供室内欣赏，用于桌饰、吊挂，也为良好的切花材料，很受各国人民的喜爱，而成为世界著名的观赏花卉，在国际花卉市场中占有重要的地位。但是其生长周期特别长，因此能够促进兰花开花就能够获得较大的市场价值。
拟南芥的四条开花诱导途径为光周期途径、春化途径、自主途径和GA(赤霉素)途径。光周期诱导途径包括光受体基因，生理种基因，开花时间基因及分生组织决定基因。植物中的光受体主要可分为三类光敏色素(photochi^mes)、隐花色素(cryptochromes)、向光蛋白(phototropin)。光敏色素 PHYA (PHYT0CHR0ME A)等和光受体CRY2 (CYRPT0CHR0ME2)等首先感受光信号，并将光信号传递给下游生物钟基因CCAl {CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED I) ,TOCl {TIMING OF CHLOROPHYLL A/B BING PROTEIN
I)和 LATE ELONGATED HYPOCOTYL)等(Michaels，2OO5 ；Aaron，2OO9),生物钟基因调控下游基因仍(《awrAw )基因表达，进而通过调控开花整合因子/T、5·化7等基因的表达而调控开花(Abe，2005 ；Bohlenius, 2006 ；Moon, 2005)。拟南芥/T是光周期途径、春化途径和自主途径这些开花诱导途径共同下游靶基因，可见/T基因不仅在高等植物光周期途径中起主要开花信号传导作用，还参与调节其他开花途径的开花信号传导到顶端诱导花芽分化，说明/T在开花诱导综合途径中起重要的枢纽整合作用，是影响拟南芥开花时间的关键基因。FT基因就是人们所寻找的开花素基因，其编码蛋白含有磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)的结构域。光周期途径中，在LD(长日照)条件下，CO调节/T基因在韧皮部的伴细胞表达，FT蛋白的分子量为23KD的小蛋白，小于胞间连丝允许通过的蛋白分子量限制，意味着FT蛋白可以在韧皮部自由通行。FT蛋白通过筛管运输到茎尖分生组织SAM，与bZIP转录因子FD通过蛋白质互作形成复合体，激活下游分生组织特异基因AdA AdAZZT等促进开花及花形态建成。(Michaels，2005 ;Yoo，2005 ；Laurent,2007 ；Franziska. 2008)。不同的植物可能采用与拟南芥类似或截然不同的分子机制来调控开花时间。水稻中的Hd3a与FT同源，编码蛋白属PEBP家族基因，Hd3a是水稻中的开花素基因，表达模式及功能与/T基因相似，在叶片的韧皮部组织中表达，通过维管组织运输到SAM促进开花(Laurent,2007 ；Bohlenius,2006 ;Ryo,2005)。水稻的{SeI)是拟南芥CO的同源基因，在LD条件下水稻的抑制^土的表达从而抑制开花(Izawa，2002 ;Kojima，2002)，这与拟南芥的仍基因在LD下促进/T的表达从而促进开花完全相反。/T同源基因并非都具有/T基因相同的功能。在拟南芥中/T的同源基因包括FT,MFT (Mother of FT and TFLI), ATC,BFT (Brother of FT ), TSF (.Twins sister ofFT), TFLl {Terminal Flower I )六个家族成员。TFLl与FT具有很高的同源性，但它是一个开花抑制因子，改变TFLl蛋白的一个氨基酸，就会把TFLl转变成开花激活因子，TFLl也可以像FT蛋白通过韧皮部运送到顶端分生组织中，但是TFLl在顶端分生组织中的大量表达，会抑制Z/T和的表达从而抑制拟南芥开花(HanZawa，2005)。不同的植物可能采用与拟南芥类似或截然不同的分子机制来调控开花时间，而且即便是在拟南芥中/T同源基因并非都具有/T基因相同的功能，因此，研究金钗石斛的/T基因(fe/T)在整个成花诱导综合调控网络中所起的作用，以及fe/T基因在成花诱导过程的作用，对于对将来利用如/T基因来改良花卉得到生长周期缩短的花卉新品种具有十分重要的实践意义
发明内容
本发明的一个目的在于提供金钗石斛开花素fe/T基因。本发明的另一个目的在于提供由上述金钗石斛开花素fe/T基因编码的多肽。本发明的另一个目的在于提供含有上述金钗石斛开花素fe/T基因的重组表达载体。本发明的另一个目的在于提供上述金钗石斛开花素fe/T基因在促进植物提取开花中的应用。本发明的另一个目的在于提供上述金钗石斛开花素fe/T基因的克隆方法。本发明所采用的技术方案是
金钗石斛开花素如/T基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。金钗石斛开花素ito/T基因编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。含有金钗石斛开花素fe/T基因的重组表达载体。所述重组表达载体中的载体为pCAMBIA1302表达载体。金钗石斛开花素如/T基因在促进植物提前开花中的应用。所述植物为拟南芥。金钗石斛开花素fe/T基因的克隆方法，包括如下步骤
1)提取金钗石斛花芽总RNA，反转录得到CDNA；
2)利用3’ RACE特异性引物进行3 ’ RACE
FT 3' -RACE 1st Primer 5/ -CAACGACCAGCGCGACATTT-3' (SEQ ID NO:3)，
FT 3' -RACE 2nd Primer 5/ - AGTGTGCTATGAGAGCCCTC -3/ (SEQ ID N0:4)；
3)利用5'RACE特异性引物与锚定引物，采用5'端加接头的方法进行5' RACE Ft5raceprimerl 5/ -AAATGTCGCGCTGGTCGTTG-3' (SEQ ID N0:5),
Ft5raceprimer2 5/ -TTGGACTTGGAGCATCTGGA-3' (SEQ ID N0:6),
锚定引物5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIGGGIGGGIIG -3' (SEQ ID NO:7);
4)以引物qcFt upprimer 5 ' -AGATGAGTAGAGAGAGAGACCC-3 ' (SEQ ID NO:8)，qcFtdownprimer 5/ -CAGTCTTGCATTCTTCTTCCG-3' (SEQ ID NO:9)扩增ito/T基因的 cDNA全长。本发明的有益效果在于
本发明克隆得到了金钗石斛的开花素如/T基因，并且验证金钗石斛中的开花素fe/T基因确实能够起到促进开花的作用。本发明可以为如/T基因在金钗石斛的成花诱导过程中的作用提供理论基础，并为金钗石斛的开花诱导途径网络的建立提供理论依据，这可为将来利用如/T基因来改良金钗石斛或其他花卉，得到生长周期缩短的花卉新品种提供新的基因资源。
图I是DnFT cDNA片段:V RACE扩增产物电泳图(M DNA DL 2000分子量标准；
1=PCR产物；2 PUC19质粒；3 :重组质粒；4 :重组质粒EcoR I/Hind III酶切产物)；
图2是DnFT cDNA片段5' RACE扩增产物电泳图(M maker ；1 5/ RACE产物)；
图3是表达载体质粒酶切鉴定图(M Marker; 1,2 :重组质粒酶切)；
图 4 是 17d 的 35S: \DnFT 拟南芥表型(a，e Col ；b, f 35S: : ηΓΤ~3 ；c, g 35S: \DnFT-IQ ；d, h 35S: \DnFT~2A)；
图5是25d的35S: -.DnFT拟南芥表型。(从左到右依次为Col，35S: -.DnFT- ,,35S: :fe/T-10，35S: \DnFT~2A)；
图6是15d35S: 拟南芥的ito/T，APl，LFY表达水平的RT-PCR检测结果图(I col ；
235S: : ηΓΤ~3 ；3 35S: \DnFT-IQ ；4 35S: \DnFTD。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002,北京科学出版社)。实施例I
一、金钗石斛DnFT基因的克隆 I、引物设计
已构建的cDNA文库经测序、比对验证其中有两个FT同源序列，根据已得到的cDNA片段序列，利用生物软件Primer Premier 5. O,在靠近片段序列的3'端设计2条特异引物FT3' -RACE 1st Primer和FT 3' -RACE 2nd Primer,在靠近片段序列的5’端设计2条特异引物 Ft5raceprimerl 和 Ft5raceprimer2 (表 I)。.................................................................................................................................................... <—I—^ ^ ^ ^ ^ ^ j l 物印列..................................................................................................................................................^
侧I侧利I
................................................................................................................................f............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................E
π.ΠΛα: bt Primer I Si- CAACCL^CCAtiCCiCXiACAlTT i SliQ ID NO:3 )|
................................................................................... ................................................*..........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
FT 3n4iAVli 2nd Priiiw | 5。AC]I(5TCMTAI(}ACiACiCtCTC ~y i SIiQ 10 NCM >|
FlSniccprimcr I| 5i-/\AAlXriI,iM(K'T(KtT(,CiTTCi-.V i 11) NO:5 )I
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Fi5rac€|iriiiRi*2I ΓΓ(;( Λ€Τ—Τ0( Λ ()\Τ(:Τ(;0AJ < ShQ ID NC):6I
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2、金钗石斛ito/T基因 3' RACE 和 5' RACE (I)3' RACE
利用CTAB方法提取的金钗石斛花芽总RNA，反转录得到cDNA，3 '末端使用Takara3' Full RACE Core Set Kit试剂盒巢式法进行扩增，引物为FT 3' -RACE 1st Primer(SEQ ID NO:3)和 FT 3' -RACE 2nd Primer (SEQ ID NO:4)。PCR 反应条件如下
反转录反应
IOXRNA PCR BufferI μ I
Mgcl2 (25mM)2μ I
dNTP Mixture (IOMm)I μ I
AMV reverse transcriptasexl0. 5 μ I
RNase inhitor (40u/μ I)0.25 μ I
Oligo dT-3site Adaptor Primer (2. 5 μ m)0. 5 μ I
20 d 花芽 RNAO. 5 μ I
RNase Free dH204. 25 μ I
Total10 μ I
按以下条件进行RT反应
30 °CIOmin
50 °C30min
95 °C5min
5°C5min
PCR反应采用巢式PCR 第一次PCR反应体系如下
IOXEx Taq Buffer5 μ I
5U/u I Ex Taq (TaKaRa)O. 25 μ I
20umol/L FT 3' -RACE 1st Primer0. 5 μ I
20 μ mol/L 3 site Adaptor Primer0. 5 μ I
反转录反应液10 μ I
ddH2033. 75 μ I
第一次PCR反应液稀释10-100倍后作为模板，用3' 二回巢式引物进行第二次PCR反 应。第二次PCR反应体系如下
IOXEx Taq Buffer5 μ I5U/y I Ex Taq (TaKaRa)O. 25 μ I
I Ommo I/L dNTPI μ I
20 μ mol/L FT 3' -RACE 2nd PrimerO. 5 μ I
20 μ mol/L 3 site Adaptor Primer0. 5 μ I
I次PCR反应产物稀释50倍10 μ I
ddH2032. 75 μ I
3' RACE克隆电泳结果如图I所示，目的基因片段用Takara的回收纯化试剂盒回收。(2)5' RACE
5' RACE采用5'端加接头的方法进行扩增。PCR反应条件如下
反转录反应
模板RNAI μ I
dNTP Miture (IOMm)I μ I
Oligd(T) 16 Primer (2. 5 μ m)I μ I
ddH207 μ I
65 0C 反应 5min，冰浴 2 min。上述反应体系10 μ I 5X primer script Tm Buffer 4 μ I
RNase inhitor0. 5 μ I
Primer script Reverse TranscriptaseI μ I
ddH204. 5 μ I
按以下条件进行RT反应
50 °C30min
70 °C15min
cDNA纯化，加接头 cDNA25 μ I
5 X TdT Buffer10 μ I
O.1%BSA5 μ I
IOmMdCTP2. 5 μ I
TdT2 μ I
ddH205· 5 μ I
37°C反应Ih之后产物进行纯化。米用5' RACE 引物 FtSraceprimerl (SEQ ID N0:5)> Ft5raceprimer2 (SEQ IDN0:6)与锚定引物5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIGGGIGGGIIG -3' (SEQ IDN0:7，序列中I表示次黄嘌呤)，进行巢式扩增，将3’ RACE的Adaptor Primer换成锚定引物,其余步骤同:V RACE。51 RACE克隆电泳结果如图2所示，目的基因片段用Takara的回收纯化试剂盒回收。(3)扩增全长
根据3' RACE、5' RACE结果拼接得到的序列，分析后分别在3' UTR和5' UTR设计两对特异引物(qcFt upprimer和qcFtdownprimer)用来扩增全长。qcFt upprimer 5/ -AGATGAGTAGAGAGAGAGACCC-3; (SEQ ID NO:8)qcFtdownprimer 5/ -CAGTCTTGCATTCTTCTTCCG-3' (SEQ ID N0:9)
克隆步骤同cDNA 3' RACE第一次PCR反应。ito/T序列大小528 bp (SEQ ID NO 1),编码176个氨基酸(SEQ ID NO :2)，在氨基酸水平上与文心兰的/T基因同源性达到90%，与欧洲山杨/T基因同源性达到83%。二、DnFT植物表达载体重组子的构建和拟南芥转化
DnFT觅包/含Bgl II酶切位点的特异引物进行PCR扩增，引物序列如下
Bgl II FT upprimer 5/ -AAAAGATCTATGAGTAGAGAGAGAGACCC-3; (SEQ ID NO:10) Bgl II /FT downprimer: 5' -AAAAGATCTCAGTCTTGCATTCTTCTTCCG-3; (SEQ ID NO:11)PCR产物直接用Bgl II限制性内切酶进行酶切，用Takara回收试剂盒回收产物。pCAMBIA1302表达载体用Bgl II限制性内切酶进行酶切，1%琼脂糖凝胶回收大片段。利用T4DNA连接酶将/T序列插入到pCAMBIA1302表达载体。经酶切鉴定(图3)，重组子再转化农杆菌LBA4404，采用花序轴浸泡法将重组质粒转化拟南芥。三、转基因植株纯合子的筛选、纯合
将经重组子转化的Ttl代拟南芥种子均匀铺布于含Hyg (25 mg/L)的MS培养基上进行筛选，得到抗性苗。抗性苗转移到土壤中成熟结实后得到T1代种子，将其均匀铺布于含Hyg(25 mg/L)的MS培养基筛选，统计并选出抗性苗与非抗性苗的分离比3 :1的即为单位点插入，移栽至土壤中，成熟后单株收种得T2代种子。将单位点插入的T2代种子种植在含Hyg(25 mg/L)的MS培养基的平板上继续筛选直至不再出现抗性与非抗性苗的分离，全部为抗性苗的即为纯合子。本次试验得到28个转基因株系，依次编号为35S: -DnFT-I 28，随机挑选其中的3个单拷贝插入株系i35S: :DnFT~3,35S::DnFT-10,35S: :DnFT~24)用于下面的表型分析及基因表达分析，野生型拟南芥Col作为对照。四、表型分析开花时间的统计
开花标准用Boyes等(2001)所分时期的5. 10期，即第一个花芽可见时期(抽薹)。采用绝对时间(播种至抽薹的天数)和相对时间(抽薹时莲座叶的数目)统计分析。通过对转基因植株和野生型Col的相对开花时间与绝对开花时间进行统计分析，发现35S: :DnFT转基因植株出现特别明显的早花表型。35S: :DnFT~3,35S::DnFT-10,35S: :DnFT_24分别在14d，17d, 13d时抽薹开花(图4 )，比野生型Col分别提前12d，9d，13d开花，开花莲座叶数分别是5片，7片，5片，比野生型Col少5_6片真叶(表
2)。野生型 Col 在 25 于35S: :DnFT-3,35S::DnFT-10,35S: :DnFT-24 已经出现了果荚(图5)。
权利要求
1.金钗石斛开花素如/T基因，其核苷酸序列如SEQID NO: I所示。
2.权利要求I所述的金钗石斛开花素如/T基因编码的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.含有权利要求I所述的金钗石斛开花素如/T基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中的载体为PCAMBIA1302表达载体。
5.权利要求I所述的金钗石斛开花素如/T基因在促进植物提前开花中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。
7.权利要求I所述金钗石斛开花素如/T基因的克隆方法，包括如下步骤 1)提取金钗石斛花芽总RNA，反转录得到cDNA； 2)利用3’ RACE特异性引物进行3 ’ RACE FT 3' -RACE 1st Primer :5' -CAACGACCAGCGCGACATTT-3' (SEQ ID NO:3)，FT 3' -RACE 2nd Primer :5' - AGTGTGCTATGAGAGCCCTC -3' (SEQ ID N0:4)； 3)利用5'RACE特异性引物与锚定引物，采用5'端加接头的方法进行5' RACE Ft5raceprimerl :5' -AAATGTCGCGCTGGTCGTTG-3' (SEQ ID N0:5),Ft5raceprimer2 :5' -TTGGACTTGGAGCATCTGGA-3' (SEQ ID N0:6), 锚定引物5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIGGGIGGGIIG -3' (SEQ ID NO:7); 4)以引物qcFt upprimer 5 ' -AGATGAGTAGAGAGAGAGACCC-3 ' (SEQ ID NO:8)，qcFtdownprimer :5' -CAGTCTTGCATTCTTCTTCCG-3' (SEQ ID NO:9)扩增ito/T基因的 cDNA全长。
全文摘要
本发明公开了金钗石斛开花素DnFT基因及其克隆方法和应用。金钗石斛开花素DnFT基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明还验证了金钗石斛开花素DnFT基因能够促进植物开花，为DnFT基因在金钗石斛的成花诱导过程中的作用提供理论基础，并为金钗石斛的开花诱导途径网络的建立提供理论依据，并可为将来利用DnFT基因来改良金钗石斛或其他花卉，得到生长周期缩短的花卉新品种提供新的基因资源。
文档编号C12N15/63GK102703469SQ201210146970
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者孙姝兰, 李洪清, 李瑞红, 梁山, 王小菁, 王爱珂 申请人:华南师范大学