专利名称：小麦生长素合成基因TaYUCCA1序列及其应用和植物表达载体的制作方法
TaYUCCAl§H*
(Triticum aestivum L.) ^ TMi^jR'n'J$36l3 TaYUCCAl tfttMMXftXXWm&TK
(Wang and Li, 2008) /J^>7jaS^#tf WWft YUCCA(flavinmonooxygenase-like enzyme, FM0)EKj^ixll' IAA(indole-3-acetic acid)EKlKI^BI (Zhao et al. ,2001) Zhao ^ (2001) yuccam^#4* YUCCA 1-Mif (GC-MS)IAA#￡ YUCCA, YUCCA2.YUCCA4 fR YUCCA6 % YUCCA1J±Jt^tii YUCCA2>YUCCA4 JiJc YUCCA6 yuccal (35S: :YUCCA1) W#-$ife yuclyuc4> yuc2yuc6m&mw yucca(Cheng et al. ,2006)o
YUCCAYUCCAic 11 'NcM (Zhao et al. ,2001 ;Cheng et al. , 2006) ￡7fOsYUCCA^S (0sYUCCAl-7) , ^ OsYUCCAlIAA(Yamamoto et al. , 2007) Gallavotti et al. (2008)YUCCA4>- xmmmyucca
A p
TaYUCCAl mu
发明内容
本发明的目的旨在提供一种小麦生长素合成基因TaYUCCAl，同时提供一种该基因 在获得株型改变的转基因拟南芥中的应用，并应用于生产其它具有明显株型改变的转基因 植物。本发明提供的核苷酸序列及氨基酸序列来自小麦。本发明根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麦的EST序列设计引物， 利用聚合酶链式反应(PCR)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因克隆等技术，从小麦 (Triticum aestivum L.)中分离出编码合成生长素的TaYUCCAl基因序列，其基因核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。具体方法如下本发明根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麦的EST序列，设计一 对引物；从小麦幼苗中提取小麦基因组DNA ;从小麦幼苗中提取总RNA，然后反转录成cDNA ； 分别用小麦基因组DNA和cDNA为模板进行常规聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到 PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选重组子，进行序列测定。获得了小麦 生长素合成基因TaYUCCAl的基因序列和cDNA序列。该基因TaYUCCAl的基因序列为1448bp，含4个外显子序列，分别为612bp、234bp、 123bp和180bp ；cDNA序列为1149bp，编码382个氨基酸残基。将TaYUCCAl编码的氨基酸 序列与已知的来自拟南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPIl)的YUCCA基因编码的氨基酸序列进 行聚类分析表明，TaYUCCAl与拟南芥的YUCCA10和YUCCA11有较高的同源性。该结果表明 这个基因为生长素合成基因YUCCA在小麦中的同源基因。除了提供TaYUCCAl基因序列外，本发明的另一个目的是提供一种改变植株形态 的方法，但也包括与生长素参与调控的其它生物学性状的改变。该方法包括用本发明的 TaYUCCAl基因的表达载体转化植物。所述转化是通过农杆菌介导的方法进行。所用表达载 体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、电穿孔等导入植 物细胞。该基因的DNA序列如下CGCTACGAGT TGTGATGGAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC 60TCGCMCTGC AGCATGCGTT AGCCMTTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA 120ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCMCCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA 180GGGMTTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCM 240AGMCACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT 300ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCMTGG AAMTATTGG TCCATCATGG 360CGCACGACAT GGCAMGTGC AAMTAGTTA ATTACAGGGC AMGTTTCTT GTTGTGGCM 420GTGGTMGM TAGTGTTGAG MTATTCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAMC TTTCCGGGTG 480TGGCCATCCA TTCATCATGT TACAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG MCGTGTTGG 540TCATCGGATC TGGTMCTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA 600ATACTTCTAT MTTATACGA AGTCCGGTAT GTATACTATA TGTGACTTTA ACTGCAMTC 660TCTTTTATAG ATCTTATTTT ATCTTGCATA TTGTAAMGA TGGTGACCCT TTTGTGACTG 720CAGATTCATG TMTGACAM GGMTTMTC CGACTAGGGA TGACACTAGT CCATTATCTT 780
CCACTAAAGA TGATAGATGG TCTCCTTTTG ATGATGGCAA ATGCCGTATT CGGGGACCTC 840
TCTAGGCATG GCATCACAAG ACCAGAAAAG GGTCCATTTG TGCTGAAGTC GGAAACTGGT 900
CGATCCGCAG TGATTGATGT TGGCACCATA GGGTTAATCA AGAAAGACAA AATTAAAGTG 960
AGCATATCCT CGGTCAAACA TACATAGTAT AAGAAATTTA GTTTCATATA TGACAAGTTA1020
TAGTTTTTAA CCTGCTGTAG GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG1080
AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA1140
GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGGTAATAA GATAAACTGA GATTTGAATT TCATGCACTG1200
TAACTTCTCT AGATGCAAGA CTTGTTATAT GTTCTTAATC GAGTAAGATT TGCAAGTGCA1260
GAATGATGAG GACATGCTTA ATAGCGATGG CGTGCCCAAG AGGGAATTCC CTAATCATTG1320
GAAAGGGGCA AATGGGCTCT ACTGTGCCGG GTTAGGGAGA AGGGGATTGG CCGGTATTGC1380
CATGGATGCT AAGAACATCG CCAATGACAT TAAACGCAGC ATAGACTCTA TGTGCAGCTA1440
AAATAGCA1448
tJ cDNA:
CGCTACGAGT TGTg| TG|gAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC60
TCGCAACTGC AGCATGCGTT AGCCAATTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA 120
ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCAACCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA 180
GGGAATTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCAA240
AGAACACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT300
ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCAATGG AAAATATTGG TCCATCATGG360
CGCACGACAT GGCAAAGTGC AAAATAGTTA ATTACAGGGC AAAGTTTCTT GTTGTGGCAA420
GTGGTGAGAA TAGTGTTGAG AATATCCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAAAC TTTCCGGGTG480
TGGCCATCCA TTCATCATGT TATAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG AACGTGTTGG540
TCATCGGATC TGGTAACTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA600
ATACTTCTAT AATTATACGA AGTCCGATTC ATGTAATGAC AAAGGAATTA ATCCGACTAG660
GGATGACACT AGTCCATTAT CTTCCACTAA AGATGATAGA TGGTCTCCTT TTGATGATGG720
CAAATGCCGT ATTCGGGGAC CTCTCTAGGC ATGGCATCAC AAGACCAGAA AAGGGTCCAT780
TTGTGCTGAA GTCGGAAACT GGTCGATCCG CAGTGATTGA TGTTGGCACC ATAGGGTTAA840
TCAAGAAAGA CAAAATTAAA GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG900
AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA960
GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGAATGATG AGGACATGCT TAATAGCGAT GGCGTGCCCA1020
AGAAGGAATT CCCTAATCAT TGGAAAGGGG CAAATGGGCT CTACTGTGCC GGGTTAGGGA1080
GAAGGGGATT GGCCGGTATT GCCATGGATG CTAAGAACAT CGCCAATGAC ATTAAACGCA1140
GCATAGACTC TATGTGCAGC TAAAATAGCA1170
:
Met Glu Giù Val Val Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu
151015
Ala Thr Ala Ala Cys Val Ser Gin Phe Ser Ile Pro Tyr Val Ile Val
202530
Glu Arg Glu Asn Cys Ser Ala Ser Leu Trp Arg Asn Arg Thr Tyr Asp
354045
Arg Leu Lys Leu His Leu Ala Arg Glu Phe Cys Glu Leu Pro His Met
505560
Pro Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Thr Tyr Ile Pro Lys Asn Thr Phe Val
65707580
Lys Tyr Val Asp Asp Tyr Ile Glu Cys Phe Ala Ile His Thr Arg Tyr
859095
Leu Thr Val Val Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Phe Asn Gly Lys Tyr Trp
100105110
Ser Ile Met Ala His Asp Met Ala Lys Cys Lys Ile Val Asn Tyr Arg
115120125
Ala Lys Phe Leu Val Val Ala Ser Gly Glu Asn Ser Val Glu Asn Ile
130135140
Pro Val Val Pro Gly Leu Glu Asn Phe Pro Gly Val Ala Ile His Ser
145150155160
Ser Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Asp Tyr Ser Gly Arg Asn Val Leu Val
165170175
Ile Gly Ser Gly Asn Ser Gly Met Glu Ile Ala Tyr Asp Leu Ala Ser
180185190
His Gly Ala Asn Thr Ser Ile Ile Ile Arg Ser Pro Ile His Val Met
195200205
Thr Lys Glu Leu Ile Arg Leu Gly Met Thr Leu Val His Tyr Leu Pro
210215220
Leu Lys Met Ile Asp Gly Leu Leu Leu Met Met Ala Asn Ala Val Phe
225230235240
Gly Asp Leu Ser Arg His Gly Ile Thr Arg Pro Glu Lys Gly Pro Phe
245250255
Val Leu Lys Ser Glu Thr Gly Arg Ser Ala Val Ile Asp Val Gly Thr
260265270
Ile Gly Leu Ile Lys Lys Asp Lys Ile Lys Val His Gly Arg Ile Thr
275280285
Lys Ile Lys Gly Lys Thr Ile Glu Phe Glu Gly Gly Lys Glu Ala Ser
290295300
Phe Asp Alalie Val Phe Ala Thr Gly Tyr Lys Ser Thr Thr Asn Ser
305310315320
Trp Leu Lys Asn Asp Glu Asp Met Leu Asn Ser Asp Gly Val Pro Lys
325330335
Lys Glu Phe Pro Asn His Trp Lys Gly Ala Asn Gly Leu Tyr Cys Ala
340345350Gly Leu Gly Arg Arg Gly Leu Ala Gly He Ala Met Asp Ala Lys Asn355360365He Ala Asn Asp He Lys Arg Ser He Asp Ser Met Cys Ser370380本发明提供了小麦新 型生长素合成基因TaYUCCAl在其它植物中应用的方法，可以改变转基因植物株型。步骤为(a)利用如上述的TaYUCCAl基因，将其cDNA序列置于pR0K2载体的CaMV 35S启动子之后，构建植物表达载体pR0K2-TaYUCCAl。对于单子叶植物如小麦、水稻、玉米等的转化用的载体的构建，可以采用类似的方法将cDNA序列置于本领域人员熟知的Ubi等组成型启动子或组织特异型启动子之后，构建植物表达载体。(b)采用本领域熟知的方法如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。本发明涉及一种植物表达载体，包含有权利要求I所述的核苷酸序列SEQ.ID. NO. 2，用于改变植物株型，尤其是株高、叶型等。本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于农杆菌介导的转化法、基因枪法、电击法、显微注射法、脂质体介导法、PEG介导的转化法、花粉管通道法等，得到株型改变的转基因植物。本发明人根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麦的EST序列设计引物，利用聚合酶链式反应(PCR)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因克隆等技术，从小麦(Triticum aestivum)中分离出编码合成生长素的TaYUCCAl基因序列。进一步构建植物表达载体，转化模式植物拟南芥。与野生型植物相比，转基因植物株型改变，表现下胚轴加长、株闻提闻、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提闻的症状。本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。基于拟南芥生长速度快、生长周期短、遗传转化效率高、基因组已经测序、已经作为生物学研究的模式植物等优点，在下述实施例中以拟南芥为例对本发明进行了详细的说明，但本发明中TaYUCCAl基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它株型改变的转基因植物，包括用于形态改变的植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。本发明对采用浸花法获得的T2代转基因拟南芥进行形态分析发现，转基因拟南芥中TaYUCCAl的过量表达能显著改变其株型。可将该基因转化小麦、水稻、玉米、棉花等农作物、需要改变株型的花卉植物或其它植物，改变其株型，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会效益。
图I.小麦 TaYUCCAl 的基因组 DNA 扩增电泳图。M, Marker DL2000 ；A, TaYUCCAl的基因全长片段。图 2.小麦 TaYUCCAl 的 cDNA 扩增电泳图。M，Marker DL2000 ；B, TaYUCCAl 的 cDNA全长片段。
图3.小麦中TaYUCCAl氨基酸序列与几种其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚类结果。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为0sYUCCAl (水稻，BAD68007)、0sYUCCA2 (水稻，AAU43964)、0sYUCCA3 (水稻，BAD87432)、0sYUCCA4 (水稻，BAB32703)、0sYUCCA5 (水稻，ABA99096)、0sYUCCA6 (水稻，BAC80117)、0sYUCCA7 (水稻，CAE76085)、YUCCAl (拟南芥，At4g32540)、YUCCA2(拟南芥，At4gl3260)、YUCCA3 (拟南芥，Atlg04610)、YUCCA4(拟南芥，At5gll320)、YUCCA5(拟南芥，At5g43890)、YUCCA6 (拟南芥，At5g25620)、YUCCA7 (拟南芥，At2g33230)、YUCCA8 (拟南芥，At4g04610)、YUCCA9 (拟南芥，Atlg04180)、YUCCA 10 (拟南芥，Atlg48910)、YUCCAlI (拟南芥，Atlg21430)、ZmSPIl (玉米，ACI43575)。图4.小麦中TaYUCCAl氨基酸序列与几种其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚类结果。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为0sYUCCA4(水稻，BAB32703)、YUCCA 10 (拟南芥，Atlg48910)、YUCCAlI (拟南芥，Atlg21430)、ZmSPIl (玉米，ACI43575)。图5.构建的植物表达载体示意图。
图6.部分转基因植株的 PCR 鉴定结果。M =Marker DL2000 ；CK+ :pR0K2_TaYUCCAl质粒作为阳性对照；CK-:非转基因对照；1_5 :转基因拟南芥各株系。图7 :过量表达TaYUCCAl的转基因拟南芥可以提高株高，叶片细长卷曲。A :示转基因拟南芥生长50天时株高可达60厘米；B :示生长20天时的野生型拟南芥，叶片椭圆形；C :示生长20天的转基因拟南芥，叶片细长卷曲。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施方式(一)小麦新型生长素合成基因TaYUCCAl基因序列I.小麦基因组DNA的提取利用CTAB法从小麦三叶期幼苗中提取小麦DNA ；2. TaYUCCAl基因序列的获得根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麦的EST序列，设计一对引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’ ；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。以小麦基因组DNA为模板进行PCR反应获得TaYUCCAl基因。50 反应体系中含第一链 cDNA 产物 l、25ii I 的 LA GC Taq DNA 聚合酶缓冲液 GC buffer IUu I I Ommol/L的dNTP、分别加IiU 50iimol/L的上游引物和下游引物、0. 5iil LA GC Taq DNA聚合酶，其余用灭菌双蒸水补齐。反应程序为950C 3min ;然后运行 35 个循环94°C lmin,50°C lmin,72°C°C 2min ;最后于72°C 延伸 5min。反应完毕后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，得到约1.5kb的条带(图1)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝胶回收试剂盒说明纯化回收该片段。取回收的PCR产物4 yl与克隆载体PMD18-T连接，操作步骤按照TaRaKa公司产品pMD18_T Vector说明书进行。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，在含有氨苄青霉素^Omg/L)、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至含有氨苄青霉素的LB液体培养液中培养8h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样碱法小量提取质粒DNA，质粒PCR和酶切鉴定正确后进行序列测定。3.同源检索利用BLAST软件将分离出的全长TaYUCCAl序列与GenBank中的序列进行比较。实施方式(二)小麦新型生长素合成基因TaYUCCAl基因cDNA序列的克隆1. RNA 的提取用 Roche Applied Science 公司 Tripure Isolation Reagent 总RNA提取试剂盒提取小麦三叶期幼苗总RNA2. cDNA第一链的合成按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒说明书进行。在0. 2ml离心管中加入试剂
Total RNA5. 0 n I
01igo(dT)l81.0 nl
2XES Reaction Mix10. 0 u I
ES Reverse Transcriptase I. 0 uI
Rnase-free Water to20. 0 U I轻轻混匀，稍离心后，42°C保温50min，70°C加热15min。然后_20°C保存备用。3. cDNA全长序列的获得根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCAl-7)和小麦的EST序列，设计一对引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3，；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。以上述的cDNA为模板进行PCR反应获得TaYUCCAl基因cDNA序列。50 反应体系中含第一链cDNA产物4 ill、25 ill的LA GC Taq DNA聚合酶缓冲液GC buffer IUu I
IOmmo I/L的dNTP、分别加Iul 50 u mol/L的上游引物和下游引物、0. 5u I LA GC Taq DNA聚合酶，其余用灭菌双蒸水补齐。反应程序为950C 3min ;然后运行 35 个循环94°C lmin,50°C lmin,72°C lmin30sec ;最后于72°C 延伸 5min。反应完毕后，过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，得到约I. 2kb的条带(图2)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝胶回收试剂盒说明纯化回收该片段。取回收的PCR产物4 yl与克隆载体PMD18-T连接，操作步骤按照TaRaKa公司产品pMD18_T Vector说明书进行。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，在含有氨苄青霉素^0mg/L)、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至含有氨苄青霉素的LB液体培养液中培养8h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样碱法小量提取质粒DNA，质粒PCR和酶切鉴定正确后进行序列测定。4.同源检索利用BLAST软件将分离出的全长TaYUCCAl的cDNA序列与GenBank中的序列进行比较。将TaYUCCAI编码的氨基酸序列与已知的来自拟南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPIl)的YUCCA基因编码的氨基酸序列进行聚类分析表明，TaYUCCAl与拟南芥的YUCCA10和YUCCA11有较高的同源性(图3)。该结果表明这个基因为生长素合成基因YUCCA在小麦中的同源基因。TaYUCCAl的氨基酸序列与水稻0sYUCCA4 (BAB32703)、拟南芥YUCCA10(Atlg48910)、YUCCA 11 (Atl g21430)和玉米 ZmSPIl (ACI43575)序列类比分析表明，这几个序列见有多个保守的位点(图4)。5. TaYUCCAl基因内含子分析根据实施方式(一)和实施方式(二)中分别获得的基因序列以及cDNA序列进行比较，分析内含子的信息。实施方式(三)小麦新型生长素合成基因TaYUCCAl的序列见SEQ. ID. NO. USEQ.ID. NO. 2 和 SEQ. ID. NO. 3。实施方式(四)表达载体pR0K2_TaYUCCAl的构建(I)根据分离出的TaYUCCAl基因的cDNA核苷酸序列，设计引物正向引物TaYUCCAlFl :5’ -CGGGGATCCTGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3 (下划线为 BamHI切点)；反向引物TaYUCCAlRl :5’ -CGGGGTACCTTTTAGCTGCACATAGAGTC-3’(下划线为 KpnI切点)。以小麦三叶期幼苗的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应。(2)取PCR产物4 ill与pMD19-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品PMD19-T Simple Vector说明书进行，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，在含有氨苄青霉素^Omg/L)、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至含有氨苄青霉素的LB液体培养液中培养8h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样碱法小量提取质粒DNA，质粒PCR和酶切鉴定正确后进行序列测定。(3)以步骤⑵所得的质粒用限制性内切酶BamH I和Kpa I进行双酶切，回收酶切片段，与用相同酶切并回收的PR0K2表达载体连接。连接体系如下
目的 TaYUCCAl 片段 DNA3. 0 u I 酶切回收的载体PR0K2片段5.0 Ul
IOXT4连接酶缓冲液1.0 Ul
T4连接酶1.0 Ul混匀后于16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。对生长的菌落进行PCR鉴定和测序鉴定。构建成功植物表达载体pR0K2-TaYUCCAl (图5)。(4)将构建好的表达载体pR0K2_TaYUCCAl转化农杆菌GV3101感受态细胞，本发明采用的是冻融法转化农杆菌。实施方式(五)转基因植物的获得(I)野生型拟南芥(Columbia生态型)种子播种于浸透1/2MS培养液的育苗基质中，4°C下春花2-3天。然后转入光照培养箱中23°C下光照培养，16h光照/8h黑暗。(2)挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28°C，250rpm，振荡培养约48小时，至对数生长后期。(3)离心收集菌体，沉淀用渗透液(1/2 MS培养液中含5%蔗糖，0.02% Silwet、L-77)悬浮，菌液OD6tltl在0. 8左右。(4)将未授粉的拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡50sec，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。收获种子。(5)将收获的种子在筛选培养基(1/2MS盐，1%蔗糖，pH5. 7，0. 8%琼脂，卡那霉素50mg/L)上筛选，培养得到抗性植株。(6)根据TaYUCCAl序列设计一对引物正向引物TaYUCCAlF2 5，-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’ ；反向引物TaYUCCAR2 5 ’ -TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3 ’。
提取野生型及抗性植株的基因组DNA，进行常规聚合酶链式反应鉴定(图6)。(7)将T3代纯合株系种子于烧透1/2MS培养液的育苗基质钵上培养。观察植株表型变化。实验证实，转基因拟南芥表现下胚轴加长、株高提高、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提高的症状(图7)。可将该基因转化小麦、玉米、棉花、花卉等农作物，改变植物的株型，提高产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种小麦生长素合成基因TaYUCCAl，其特征在于，其基因核苷酸序列如SEQ.ID. NO. I所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示；其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
2.根据权利要求I所述的小麦生长素合成基因TaYUCCAl，其特征在于，该基因选自小麦。
3.根据权利要求I所述的一种小麦生长素合成基因TaYUCCAl的应用，其特征在于，该基因在拟南芥中过量表达，能改变转基因拟南芥的株型，如下胚轴加长、株闻提闻、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提高的症状。
4.一种植物表达载体,包含有权利要求I所述的核苷酸序列SEQ. ID. NO. 2。
全文摘要
本发明公开了一小麦生长素合成基因TaYUCCA1，其基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。将该基因的全长cDNA序列置于CaMV 35S启动子之后，构建植物表达载体pROK2-TaYUCCA1，转化拟南芥，使该基因在拟南芥中过量表达。实验证实，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥表现下胚轴加长、株高提高、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提高的症状。如将该基因转化小麦、水稻、玉米等农作物、需要改变株型的花卉植物或其它植物，改变其株型，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会效益。
文档编号C12N15/29GK102660556SQ201210146830
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者封德顺, 尹娜, 王洪刚, 马信 申请人:山东农业大学