专利名称：一个海带雌配子体特异性分子标记fsml-1488的染色体定位的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，是有关海带雌配子体一个特异性FSML-1488(female-specific marker of Laminaria japonica Areschノ分ナ不不I己仕染色体上白勺定n。
背景技术：
悔荀1ySaccharinajaponica (Areschoug) C. E. Lane, C. Mayes, Druehl et G.ff. Saunders, comb. nov. ^^{Laminaria japonica Aresch.)隶偶揭藻| J (Phaeophyta)、海带目(Laminariales)，是我国海水养殖业中重要的经济海藻之一。海带生活史具有明显的异型世代交替。孢子体(即人们通常所食用的主要部分)成熟时，带片上单室孢子囊的孢子母细胞经过减数分裂及多次分裂，产生32个单倍性侧生双鞭毛的同型游动孢子；它们在释放后不久附着于基质上，当生长环境适宜吋，分别发育成雌、雄配子体，且性别比为I: I (Schreiber, 1930)。这个性别比结果预示着海带可能存在着类似高等植物単性花那样的性别决定系统。Evans (1963, 1965)对掌状海带(Z.)等几物种进行染色体研究,在雌配子体中发现两个较小和一个较大的染色体，并推测那个较大的染色体可能是它们的性染色体。另外，大量単性生殖的实验结果(戴继勋和方宗熙，1976 ;方宗熙等，1978 ；Motomura,1991 ;戴继励等，1992 ；Lewis et al. , 1993)证实,海带雌配子体经无融合单性生埴产生的孢子体能形成孢子囊和游动孢子，且这些游动孢子能正常发育均成为雌配子体，说明海带普遍存在着“孤雌生殖”现象。根据这些研究結果，方宗熙等(1978)推测海带存在类似X/Y性别决定系统，其中二倍性的孢子体为XY型，而单倍性的雌、雄配子体分别为X型和Y型。但遗憾的是，戴继勋和方宗熙(1977)、Yabu & Yasui (1991)以及刘宇等(2012)在利用细胞学方法观察海带染色体时，虽证实海带染色体小且雌配子体(大小在O. 78-2. 61 μ m之间)稍微大雄配子体(大小在O. 57-2. 17 μ m之间)，它们多呈短杆状或点状，但这些报道都显示在雌配子体中均没有发现到显著的大型性染色体。据此可以推测，海带可能存在性染色体，但它与常染色体在形态上没有明显的差异。分子标记已广泛应用于高等植物的性别鉴定(Jiang & Sink, 1997; Gunter etal. , 2003a; 2003b; Stehlik & Blattner, 2004; Xu et al. , 2004; Yakubov et al.,2005; Chaves-Bedoya & Nunez, 2007; Li et al. , 2010; Samantaray et al. , 2010)。但至今鲜有藻类性别相关分子标记的报道。Sim et al. (2007)认为随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术可用于弓长氏'江萬changii)雌、雄株及孢子体的鉴定。Martinez et al. (1999)利用RAPD技术从细江蓠((Jraci/ariagracilis)中分别获得I个雌性相关PCR标记和2个雄性相关分子标记。最近，通过微卫星引物筛选，Shan & Pang (2010)从裙带菜(fet/aria pinnatifida)キ敬篇一个与雌配子体相关的分子标记。本课题组所根据地钱polymorpha L. )Y染色体特异序列(GenBank登录号ΑΒ069714)设计引物，从海带雌配子体中扩增出一条差异片段，并在国际上率先将该片段成功转化为ー个命名为FRML-494的SCAR标记(Liu et al.，2009);但这些性别相关分子标记能否特异地定位于染色体上，将直接影响到这些标记在海带无性繁殖系育苗与育种方面有关雌、雄配子体的鉴定以及在海带配子体性别分化、性别染色体等基础理论的深入研究。突光原位杂交(fluorescencein situ hybridization,FISH)技术是建立在原位杂交(i/ situ hybridization)技术的原理与操作方法基础上(Gall and Pardue, 1969;John et al. , 1969)，首先在哺乳动物的研究中被开发出来(Pinkel ei a人，1986)，它是利用荧光物质标记好的DNA或RNA探针与细胞染色体的核酸进行杂交,检测后者在细胞内的存在及其数量和结构改变的方法。自从Le et a人(1989)及Schwarzacher et al. (1989) 在植物中成功应用FISH技术后，这种功能強大的手段已广泛运用于高等植物基因组分析中(參见综述 Lavania, 1998; Jiang & Gill, 2006; Schwarzacher & Heslop-Harrison,2011)，因为它能够使目标DNA序列无论在有丝分裂还是在減数分裂的染色体上，都能进行物理绘图。因而可用于高等植物性别相关基因或DNA标记的定位(Ueda & Tanaka，1995;Mariotti et al. , 2009)及性染色体的鉴定(Shibata et al. , 1999; 2000 ;Hobza etal. , 2004; Lan et al. , 2006)等研究。但FISH技术至今还没有用于目标DNA序列在藻类染色体上的定位。中国专利文献CN101280339B公开了ー个能辨别海带雌配子体的SCAR分子标记，可以对海带配子体性别进行快速有效的鉴定，也可对单性海带孢子体亲本来源及其后代的性别进行鉴定。中国专利文献CN101280340B公开了能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记，可以对海带配子体性別、単性生殖海带孢子体亲本来源及其后代性别进行鉴定，也可以在细胞核分子水平上对海带性别分化进行研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法，包括以下步骤
Cl)带有目标片段FSML-1488质粒DNA的制备通过CTAB法提取海带配子体DNA后，利用PCR技术扩增到长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488的片段，然后TA克隆后转化至大肠杆菌中，最后提取质粒获得目标片段质粒DNA，所述的目标片段FSML-1488的序列为 SEQ ID NO. 5 ；
(2)海带配子体染色体的制备利用混合酶液，即纤维素酶、果胶酶、离析酶及鲍鱼酶，处理海带配子体细胞，以DAPI染色，获得分裂相比较好的高质量染色体；
(3)探针的制备对提取的质粒获得目标片段FSML-1488质粒DNA利用切ロ平法进行緑色生物素标记探针；
(4)荧光原位杂交按照荧光原位杂交的常规方法进行雌配子体特异性FSML-1488分子标记的染色体定位。所述的步骤(2)中的混合酶液为纤维素酶、果胶酶、离析酶和鲍鱼酶的混合酶液，其中纤维素酶、果胶酶、离析酶和鲍鱼酶的比例为2:1:1:1. 5,混合酶液的浓度为10 mg/mL。
所述的用于扩增海带雌配子体基因组DNA的引物对的序列正向引物SEQ IDNO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4。本发明优点在干
本发明利用各种工具酶，如离析酶、鲍鱼酶、纤维素酶、果胶酶等的优化配合以获得海带孢子体和配子体原生质体的基础上，制备高质量的染色体，突破FISH技术在藻类学研究中的技术“瓶颈”，成功地将ー个长为1488 bp的海带雌配子体特异性FSML-1488分子标记定位在染色体上。
图I.海带雌配子体ISSR差异分子标记的电泳图 谱。1-5泳道不同个体的雄配子体；6-10泳道不同个体的雌配子体；11泳道空白对照；12泳道GeneRuler 100 bp DNAMarker Plus。图2.海带雌配子体FSML-1488分子标记的电泳图谱。1_10泳道不同个体的雄配子体；12-21泳道不同个体的雌配子体；22泳道空白对照；11和23泳道D2000的DNA标准。图3.海带配子体DNA酶切电泳图谱(左)及Southern杂交图谱(右)。Ml D2000的DNA标准；M2 :1 kb的DNA标准；I 和I早是使用Pstl酶切的基因组DNA ；2 和2早是使用沿ο I和Afoi I双酶切的基因组DNA。图4Α.长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雌配子体中期核上的原位杂交图谱，染色体用DAPI负染。箭号所指为绿色杂交信号。图4B.长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雌配子体间期核上的原位杂交图谱，间期核用DAPI负染。緑色区域为杂交信号。图4C.长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雄配子体中期核上的原位杂交图谱，染色体用DAPI负染。图4D.长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雄配子体间期核上的原位杂交图谱，间期核用DAPI负染。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I特异性分子标记FSML-1488的提取和鉴定 I)取鲜重为O. I g的海带配子体无性繁殖系。2)在液氮中轻轻地将配子体无性繁殖系研磨成粉末后，立即转移入预热的O. 6 mLCTAB提取缓冲液中，该缓冲液含有重量体积比为3%的CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)、I. 4M NaCl,20 mM EDTAUO mM pH为7. 8的Tris-HCl和重量体积比为2%的巯基こ醇，于涡旋混勻仪上混勻I min。3) 65°C温浴30 60 min,姆10 min颠倒摇动I次。4)加入等体积的体积比为24:1的氯仿异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀3-5 min,至出现乳化层为止。5)室温下12 000 rpm (转/分钟)离心10 min,上清液转移到另ー灭菌的离心管中。6)向离心管中加入2/3体积_20°C预冷的异丙醇，颠倒混匀，至出现沉淀为止。7)-20°C下放置15 min左右后,8 000 rpm离心10 min。沉淀于70%こ醇洗漆并在无菌操作台中通风干燥后，溶解于200 μ L灭菌的CldH2O中。8)待完全溶解后加入1/3体积的7. 5 M的醋酸铵和2倍体积_20°C预冷的无水こ醇。颠倒混匀，至出现沉淀为止。9)-20°C下放置15 min以上，12 000 rpm离心10 min后，再用70%的こ醇洗涤沉淀。最后将沉淀溶解于4(Γ100 μ L左右的灭菌ddH20，-20°c保存备用。10)从加拿大British Columbia大学购置的引物中，选择10条引物，通过优化PCR反应条件，最后确定反应程序为先进行ー轮94°C变性3 min ;接着45个循环包括94°C变性 45s、50 54°C退火 I. 5 min，72°C延伸 Imin ;最后在 72°C下延伸 10 min。25 μ L 的 PCR 反应体系2· 5 μ L 10XPCR缓冲液[50 mM KCl，10 mM Tris-Cl (pH 8. 3)，I. 5 2. 5 mM Mg2+，100 μ M dNTP], O. 2 μ M ISSR 引物，L I 单位 Taq DNA 聚合酶，30 ngDNA 模板。PCR 产物用2. 0%的琼脂糖凝胶电泳，溴化こ锭染色，凝胶成像系统进行观察和拍照。在10对引物中，发现引物UBC809 (SEQ ID NO. I)可以自雌配子体中扩增出一条大小在1500 bp左右的差异条带(图I)。11)使用北京艾德莱公司的DNA胶回收试剂盒，參照商家实验步骤说明操作。将海带雌、雄配子体基因组DNA扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，使雌、雄差异片段与其他扩增条带尽可能分开，然后用干净的刀片割下差异条带，放入2.0 mL离心管中。12)每100 mg凝胶加入500 μ L溶胶缓冲液，55°C温浴10 min,使凝胶彻底融化。13)将融化的液体倒入吸附柱中，静置I min，12000 rpm离心30 S，弃收集管中液体。14)加入700 μ L漂洗液，12000 rpm室温离心30 S。弃收集管液体。重复此步一次。15)倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，12 000 rpm室温离心2min。16)将吸附柱柱放入一个新的I. 5 mL的离心管中，超净工作台风干吸附柱EC。17)向吸附柱膜中央加40 μ L洗脱液，室温放置2 min, 12 000 rpm室温离心2min,离心管中的液体即为回收的DNA片断，保存于_20°C备用。18)在微量离心管中加入I μ L pMD19_T质粒载体，O. Γθ. 3 pmol待插入DNA片段，再加ddH20至5 μし19)加入5 μ L的连接混合液，16°C反应过夜。20)将上述10 μ L反应液加入至100 μ L的大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻摇动离心管2 3次，充分混匀。冰中放置30 min。21)冰浴后将离心管转入42°C水浴90 S，立即冰浴Γ5 min。22)加入890 μ L的LB液体培养基，37°C下150 rpm的速度振荡培养60 min。(每升LB液体培养基含10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，最后用5 M的NaOH调节PH到7. O后，用蒸馏水定容至一升，灭菌即可)。23)取O. I mL含有连接产物的菌液涂布于LB琼脂平板培养基上培养，37°C培养过、夜，形成单菌落。LB琼脂平板制备在每100 mL LB液体培养基中加4 g琼脂粉，待灭菌的琼脂培养基冷却到50°C左右时加入4 mg的5-溴-4-氯-3-卩引哚-β -半乳糖苷(Χ-Gal)、
2.4 mg的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和10 mg的氨节青霉素(Amp+),制作成X_Gal、IPTG、Amp+平板培养基，摇匀后倒平板。24)挑选LB固体培养基上白色菌落，接种到2 mL的含氨苄青霉素的LB液体培养基中。25) 37で下200 rpm的速度震荡培养过夜。26)取I μ L菌液作为模板DNA，进行PCR反应。25 μ L反应体系含12. 5 μ L天根2XTaq PCR MasterMix [O. I 单位Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μΜ 的上下游引物各 0.5 μ L, I μ L 菌液模板 DNA。 扩增程序包括94°C预变性3 min，紧接着按照94°C变性45 s、52°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序进行30个循环，最后72°C延伸10 min。PCR反应结束后，取产物6 μ L在I. 0%的琼脂糖凝胶电泳。27)将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序。28)根据测序结果SEQ ID NO. 2，将正向引物向3’ -端及反向引物向5’ -端分别延长至32和29个碱基，获得FSML-1488特异引物的序列正向引物SEQ ID N0.3和反向引物 SEQ ID NO. 4。29)对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增。25 μ L反应体系含12. 5 μ L天根 2 X Taq PCR MasterMix [O. I 单位 Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μ M的上、下游引物各(λ 5 μ L, I μ L菌液模板DNA。扩增程序包括94°C预变性3 min，紧接着按照94°C变性45 s、65°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序进行30个循环，最后72°C延伸10 min。扩增结果在I. 0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照。30)按照11)-27)步骤进行DNA胶回收、连接转化、白色菌落筛选、插入片段的确认等，最后将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序，获得能鉴定海带雌配子体的ー个FSML-1488分子标记，序列參见SEQ ID NO. 5。31) Southern杂交证实FSML-1488分子标记的特异性结果如图3所示。具体Southern杂交步骤如下
I)按照Thermo公司的North2South杂交试剂盒操作说明书标记探针将 20 μ L 生物素标记的 N4-dCTP (Biotin-dUTP)与 80 yL 的 5XdNTP mix (I mMdATP, I mM dTTP, I mM dGTP, I mM dCTP)充分混合备用。①将100 ng目的片段的PCR纯化产物于离心管中稀释至24 μ L，作为模板DNA;
②加10μ L Heptanucleotide mix引物于上述离心管中，煮沸5 min以变性,然后迅速在冰水混合物放置5 min以退火；
③加10 μ L N4-dCTP 与 5 X dNTP mix(l mM dATP, I mM dTTP, I mM dGTP, I mM dCTP)混合物，5 μ L反应缓冲液，I μ L Klenow酶(10U/ μ L)混合；
④37°C温育 60min ；
⑤加2 μ L 的 EDTA 液(500 nM, pH 8. 0)使 Klenow 酶失活。II)基因组DNA酶切将提取纯化的海带配子体基因组DNA，选择分子标记内没有限制性内切酶位点的内切酶进行酶切。本研究经预实验后确定使用ー组单酶切及一组由办ol和#oil组成的双酶切。III)转膜
①基因组DNA酶切后电泳，观察并照相，记下弥散DNA的区域；
②将凝胶置于O.2 M的HCl中处理10 min ；
③弃去HCl溶液，使用去离子水漂洗2次，随后将凝胶浸泡于20mL体积的变性液(O. 5M NaOH, I. 5 M NaCl)中，30 min后再将凝胶于中和液浸泡30 min ；
④取ー瓷盘，加入转移液(20XSSC含175.3 g NaCl、88. 2 g柠檬酸钠、800 mL水、调PH 7、定容至I L)，上置ー块玻璃板作为平台，玻璃板表面铺ー层滤纸，滤纸的两边浸没在转移液中，驱出玻璃板和滤纸间的气泡；
⑤根据胶的大小裁剪大小ー样的滤纸2张先在转移液中浸没5min，然后铺在玻璃板上，将凝胶放到滤纸上，再在凝胶上放置尼龙膜(和胶ー样大小并预先在去离子水中浸没10min，后在转移液中浸没5 min)，尼龙膜上再放入2层滤纸并驱赶气泡；
⑥在滤纸上放置15cm高的吸水纸，使用玻璃板压平，并在玻璃板上放置O. 5 kg的重物。转膜10 h，期间每间隔2 h更换新的吸水纸；
⑦转膜完毕，移去吸水纸，将膜放在6XSSC溶液中浸泡5min，用滤纸吸干液体，放在新的滤纸上，80°C烤膜45 min。IV)杂交
①预杂交将转好的膜置于杂交管中，点样面朝上，加杂交液(至少O.I mL/cm2)并确保膜可被杂交液均勻覆盖，80 rpm室温下预杂交30 min ；
②热变性探针煮沸探针10min使其变性，然后迅速置于冰水混合物中退火10 min；
③杂交在杂交液中加入已经变性的DNA探针，使其浓度达到30ng/mL，充分混匀，80rpm, 55 °C杂交过夜。V)严谨洗膜
①预先将冷藏的N0rth2S0Uth杂交严谨洗膜液缓慢升温至室温，加入等体积的去离子水；
②将膜转移到新的杂交管中使用①步骤的严谨洗膜液洗膜3次，毎次用20mL洗膜液洗膜15 min。VI)化学发光法检测杂交信号
预先将冷藏的封闭液、4X漂洗缓冲液及底物平衡液缓慢升温至室温，并配置IX漂洗缓冲液。①封闭弃严谨洗膜液，加入15 mL封闭液，42°C振荡洗膜封闭15 min ；
②配置1:300(66. 7 μ L稳定的亲和素标记的HRP加入到20 mL的封闭液中)的抗体稀释液；
③抗体孵育弃封闭液，加入抗体稀释液。室温轻轻振荡15min ；
④洗膜用20mL的IX漂洗缓冲液淋洗膜，再用20 mL的IX漂洗缓冲液室温振荡 轻柔漂洗膜4次，毎次5 min；
⑤平衡将杂交膜移入新的培养皿中，使用30mL的底物平衡液轻轻振荡5 min ；⑥底物工作液的配置(暗室里面操作)I:I等体积混合North2South Luminol/Enhanser溶液和N0rth2S0uth 过氧化物酶稳定溶液作为底物发光工作液；
⑦将湿润的膜放入新的培养皿中，加入⑥步骤的底物工作液(暗室中操作)5min，确保工作液淹没杂交膜；
⑧将膜从培养皿中取出，滤纸吸干膜表面液体。用保鲜膜包好杂交膜；
⑨把包好的杂交膜放在暗盒里，放入柯达X光胶片，曝光2min，(暗室操作)；
⑩从暗盒取出柯达X光片，进行显影和定影。X光片的条带结果如图3所示。
实施例2特异性分子标记FSML-1488的染色体定位
海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位的步骤包括
(I)带有目标片段(SEQ ID NO. 5)质粒DNA的制备
通过CTAB法提取海带配子体DNA后，利用PCR技术扩增到长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488的片段，然后TA克隆后转化至大肠杆菌中，最后提取质粒获得目标片段(SEQ ID NO. 5)质粒 DNA。(2)海带配子体染色体的制备
利用纤维素酶、果胶酶、离析酶及鲍鱼酶并优化组合以处理海带配子体细胞，以DAPI染色，获得分裂相比较好的高质量染色体。(3)探针的制备
对提取的质粒获得目标片段(SEQ ID NO. 5)质粒DNA利用切ロ平法进行绿色生物素标记探针。(4)荧光原位杂交
按照荧光原位杂交的常规方法进行雌配子体特异性FSML-1488分子标记的染色体定位。带有目标片段(SEQ ID NO. 5)质粒DNA的制备
I.I海带配子体DNA的提取
I)取鲜重为O. I g的海带配子体无性繁殖系。2)在液氮中轻轻地将配子体无性繁殖系研磨成粉末后，立即转移入预热的O. 6 mLCTAB提取缓冲液中。该缓冲液含有重量体积比为3%的CTAB、I. 4 M NaCl,20 mM EDTAUOmM的Tris-HCl (pH 7. 8)和重量体积比为2%的巯基こ醇。于涡旋混匀仪上混匀I min。3) 65°C温浴 45 min,姆 10 min 颠倒摇动 I 次。4)加入等体积的体积比为24:1的氯仿异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀3-5 min,至出现乳化层为止。5)室温下12 000 rpm离心10 min,上清液转移到另ー灭菌的离心管中。6)向离心管中加入2/3体积_20°C预冷的异丙醇，颠倒混匀，至出现沉淀为止。7)-20°C下放置15 min左右后,8 000 rpm离心10 min。沉淀于70%こ醇洗漆并在无菌操作台中通风干燥后，溶解于200 μ L灭菌的CldH2O中。8)待完全溶解后加入1/3体积的7. 5 M的醋酸铵和2倍体积_20°C预冷的无水こ醇。颠倒混匀，至出现沉淀为止。9)-20°C下放置15 min以上，12 000 rpm离心10 min后，再用70%的こ醇洗涤沉淀。最后将沉淀溶解于4(Γ100 μ L左右的灭菌ddH20，-20°c保存备用。
目标片段的PCR扩增
使用一对正向引物和反向引物(正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ ID NO. 4)，对海带配子体基因组DNA进行PCR扩增。25 μ L反应体系含12. 5 μ L天根2 Taq PCR MasterMix[O. I 单位 Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM KC1，3mM MgCl2], 10 μ M的上、下游引物各0.5 μ L, I μ L菌液模板DNA。扩增程序包括94°C预变性3 min，紧接着按照94°C变性45 s、65°C退火45 S、72°C延伸I. 5 min的程序进行30个循环，最后72°C延伸10 min。扩增结果在I. 0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察与拍照。克隆及大肠杆菌转化
使用北京艾德莱公司的DNA胶回收试剂盒，參照商家实验步骤说明操作。将海带雌、雄配子体基因组DNA扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，使雌、雄差异片段与其他扩增条带尽可能分开，然后用干净的刀片割下差异条带，放入2. O mL离心管中。 I)每100 mg凝胶加入500 μ L溶胶缓冲液，55°C温浴10 min,使凝胶彻底融化。2)将融化的液体倒入吸附柱中，静置I min，12 000 rpm离心30 S，弃收集管中液体。3)加入700 μ L漂洗液，12 000 rpm室温离心30 S。弃收集管液体。重复此步一次。4)倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，12 000 rpm室温离心2min。5)将吸附柱柱放入一个新的I. 5 mL的离心管中，超净工作台风干吸附柱EC。6)向吸附柱膜中央加40 μ L洗脱液,室温放置2 min, 12 000 rpm室温离心2 min,离心管中的液体即为回收的DNA片断，保存于-20°C备用。7)在微量离心管中加入I μ L pMD19-T质粒载体，O. 1-0. 3 pmol待插入DNA片段，再加ddH20至5 μし8)加入5 μ L的连接混合液，16°C反应过夜。9)将上述10 μ L反应液加入至100 μ L的大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻摇动离心管2-3次，充分混匀。冰中放置30 min。10)冰浴后将离心管转入42°C水浴90 S，立即冰浴3_5 min。11)加入890 μ L的LB液体培养基，37°C下150 rpm的速度振荡培养60 min。(每升LB液体培养基含10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，最后用5 M的NaOH调节pH到7. O后,用蒸懼水定容至I L,灭菌即可)
12)取O. I mL含有连接产物的菌液涂布于LB琼脂平板培养基上培养，37°C培养过夜，形成单菌落。LB琼脂平板制备在每100 mL LB液体培养基中加4 g琼脂粉，待灭菌的琼脂培养基冷却到50°C左右时加入4 mg的5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷(Χ-Gal )、2. 4 mg的异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)和10 mg的氨苄青霉素(Amp+)，制作成X-Gal、IPTG、Amp+平板培养基，摇匀后倒平板。13)挑选LB固体培养基上白色菌落，接种到2 mL的含氨苄青霉素的LB液体培养基中。14) 37°C下200 rpm的速度震荡培养过夜。
15)取I μ L菌液作为模板DNA，进行PCR反应。25 μ L反应体系含12. 5 μ L天根 2 Taq PCR MasterMix [O. I U Taq Polymerase/μ L, 500 μ M dNTP, 20 mM Tris-HCl(pH 8.3),100 mM KC1,3 mM MgCl2], 10 μΜ 的上下游引物各 0.5 μ L, I μ L 菌液模板 DNA。扩增程序包括94°C预变性3 min，紧接着按照94°C变性45 s、52°C退火45 s、72°C延伸I. 5min的程序进行30个循环，最后72°C延伸10 min。PCR反应结束后，取产物6 μ L在I. 0%的琼脂糖凝胶电泳。16)将含有目的片段的菌液送至上海生物工程公司进行测序。质粒的提取
使用北京艾德莱公司的质粒提取试剂盒，按照其操作步骤说明进行质粒提取。I)接种100 μ L含有目的片段的菌液到5 mL的含氨苄青霉素的LB液体培养基 中，过夜培养，提取质粒。2)取5 mL的菌液，离心弃上清。3)用250 μ L的溶液pi重悬浮菌液体。3)加入350 μ L的溶液ρ2温和翻转3次，室温放置4 min。4)加入350 μ L的p3，立刻温和翻转5次，冰山静置4 min, 13 000 rpm离心10min,小心取上清。5)将上ー步的上清小心移入吸附柱(吸附柱要放入收集管中)，13 000 rpm, 30 S，
弃收集管中液体。6)加入700 μ L漂洗液WB，12000 rpm，30 S，弃收集管中废液。7)再次加入500 μ L的漂洗液WB，12000 rpm离心30 S。8)弃收集管中废液，吸附柱放入收集管中离心2 min。9)弃收集管，把吸附柱放入新的离心管中，超净工作台中吹5 min挥发漂洗液中的こ醇。10)向吸附柱中央的吸附膜上加入60 μ L的洗脱液。海带配子体染色体的制备
取适量培养状态良好的海带配子体离心去除多余水分，用灭菌海水清洗2-3次，准备待用。加入O. 02%的秋水仙素振荡摇匀，4°C处理6-12 h，离心得配子体沉淀。加入卡诺固定液(冰醋酸こ醇=1:3)振荡摇匀之后，4°C处理24 h以上。蒸馏水清洗固定后的产物
3-5次，每次2 min，离心取沉淀藻体，放入2 mL离心管并加入适量混合酶液(纤维素酶果胶酶离析酶鲍鱼酶=2:1:1: L 5 (10 mg/mL))，在37°C摇床上于200 r/min酶解18 h。用70%的こ醇终止酶解反应并用蒸馏水清洗酶解产物3-4次以去除こ醇，加入适量4°C保存的冰醋酸，振荡混匀，观察酶解产物是否均匀，取少量酶解产物滴片，自然晾干。取携带有染色体的自然晾干载玻片，在相差显微镜下进行镜检。然后选取具有分散较好的染色体分裂相，加入 15 μ L DAPI (Vector Laboratories, USA)以染色，15 min 后，在 Olympus BX61荧光显微镜(日本)下观察，拍照并进行放大、測量，以计算雌、雄配子体染色体的相对长度。探针的制备
利用切 ロ平移试剂盒(ADVANCE Nick Translation Kit, Sigma-Aldrich)用 ChromaTide Alexa Fluor 488-5-dUTP (绿色生物素标记)(Invitrogen, USA)标记探针。进行突光原位杂交的探针整个过程都要求在冰上进行。以免酶等其他试剂因为温度变化失活或者起不到较好的效果。Nick Translation (质粒 DNA 200 ng/μ L)10 μ L IOXNick Translation Buffer2 μ L Labeled dNTP (I mM)0. 5 μ L Non-Iabeled dNTP (2 mM each mixed)2 μ L
DNA Polymerase I (10 U/μ L)4 μ L
DNase I (100 mU/μ L)0.4 μ L
总体积20 μ L
将以上试剂加入I. 5 mL eppendorf管混勻，放入金属浴，15°C恒温2 h。之后加入140μ L ssDNA (Sigma-Aldrich, USA),400 μ L 的 90% こ醇-10% こ酸的混合液，_20°C过夜。 4°C下13 000 rpm离心30 min,除去上清,70%こ醇洗漆。无光,风干。风干后用20 μ L2XSSC[(含 17. 53 g NaCl、8. 82 g 柠檬酸钠、800 mL 水、调 pH 7、定容至 I L)，1XTE (10mM Tris-HCl, I mM EDTA, pH 8.0)]溶液溶解，-20°C存贮。荧光原位杂交
I)利用荧光显微镜观察分裂相比较好海带配子体染色体，取出没有DAPI染色过的若干张片子标记注释，将雌、雄配子体分开。2)在紫外交联仪下进行紫外交联，2次。3)将8 μ L的杂交液[I. 5 μ L+6. 5 μ L (2XSSC, I X TE)]滴在染色体分裂相上。4)盖上塑料盖玻片，100°C，热变性DNA 5 min。5)将加热后的杂交片摆放到塑料收纳盒里，放进55°C恒温培养箱过夜杂交。6)杂交好的片子用2XSSC洗脱液将盖玻片洗脱棹。黑暗中风干。7)在染色体杂交区域滴加15 μ L DAPI染色液，5 min后进行荧光显微镜镜检。请參照附图4，图4A是长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雌配子体中期核上的原位杂交图谱，染色体用DAPI负染。箭号所指为绿色杂交信号。图4B是长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雌配子体间期核上的原位杂交图谱，间期核用DAPI负染。緑色区域为杂交信号。图4C是长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雄配子体中期核上的原位杂交图谱，染色体用DAPI负染。图4D是长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488分子标记在海带雄配子体间期核上的原位杂交图谱，间期核用DAPI负染。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)带有目标片段FSML-1488质粒DNA的制备通过CTAB法提取海带配子体DNA后，利用PCR技术扩增到长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488的片段，然后TA克隆后转化至大肠杆菌中，最后提取质粒获得目标片段质粒DNA，所述的目标片段FSML-1488的序列为 SEQ ID NO. 5 ； (2)海带配子体染色体的制备利用混合酶液，即纤维素酶、果胶酶、离析酶及鲍鱼酶，处理海带配子体细胞，以DAPI染色，获得分裂相比较好的高质量染色体； (3)探针的制备对提取的质粒获得目标片段FSML-1488质粒DNA利用切口平法进行绿色生物素标记探针； (4)荧光原位杂交按照荧光原位杂交的常规方法进行雌配子体特异性FSML-1488分子标记的染色体定位。
2.根据权利要求I所述的FSML-1488的染色体定位方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的混合酶液为纤维素酶、果胶酶、离析酶和鲍鱼酶的混合酶液，其中纤维素酶、果胶酶、离析酶和鲍鱼酶的比例为2:1:1:1. 5，混合酶液的浓度为10 mg/mL。
3.根据权利要求I所述的FSML-1488的染色体定位方法，其特征在于，所述的用于扩增海带雌配子体基因组DNA的引物对的序列正向引物SEQ ID NO. 3和反向引物SEQ IDNO. 4。
全文摘要
本发明涉及一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法，包括以下步骤(1)带有目标片段FSML-1488质粒DNA的制备；(2)海带配子体染色体的制备；(3)探针的制备；(4)荧光原位杂交。本发明优点在于本发明利用各种工具酶，如离析酶、鲍鱼酶、纤维素酶、果胶酶等的优化配合以获得海带孢子体和配子体原生质体的基础上，制备高质量的染色体，突破FISH技术在藻类学研究中的技术“瓶颈”，成功地将一个长为1488bp的海带雌配子体特异性FSML-1488分子标记定位在染色体上。
文档编号C12Q1/68GK102660648SQ201210146700
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者刘宇, 周志刚, 毕燕会, 谷俊刚 申请人:上海海洋大学