一种牡蛎肉抗氧化功能营养液的双酶制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗氧化功能营养液的制备方法，特别涉及双酶酶解的方法。
【背景技术】
[0002]自由基是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物之一。人体内氧自由基的积累是由于人体内生物大分子的降解所致，而在人体细胞内自由基持续地产生与积累是导致各种疾病的主要原因，如羟自由基持续地产生与积累，可直接改变核苷酸、蛋白质的结构，攻击不饱和脂肪酸，是导致癌症、肝炎、帕金森综合征等疾病的主要原因。自由基清除剂可作为抗氧化物不同程度地清除人体内积累的自由基，实验研宄表明，抗氧化剂对因自由羟基、自由氧基的积累而导致的疾病均具有治疗和预防作用。人工合成抗氧化剂因副作用的影响，其使用受到严格限制；而天然抗氧化剂副作用较小。因此，对安全无毒的天然抗氧化物研宄与制备备受科学家们的关注。
[0003]蛋白质水解后生成许多小分子肽和氨基酸，不仅有利于人体吸收，还提高了蛋白质的利用率，研宄发现蛋白质水解后产生的小分子肽具有多种生物活性。目前，蛋白质酶解液的制备，多采用单酶水解。但酶的专一性决定了某种蛋白酶只可能作用于某些肽键或带有某种基团的氨基酸所形成的肽键，单酶水解主要利用端肽酶或内肽酶酶解蛋白质，不足是酶制剂的用量大，水解度较低。而采用复合酶，可以根据不同酶对肽键的酶切位点不同进行有针对性的选择，从而增加酶切位点，高效酶解牡蛎肉制备抗氧化物。
[0004]为了获得高水解度和高抗氧化活性的混合多肽抗氧化营养液，本发明首次采用无花果蛋白酶和风味蛋白酶复合处理牡蛎肉，提出双酶酶解制备抗氧化营养液的方法。无花果蛋白酶，是一种巯基肽链内切酶，具有巯基蛋白酶的特性，其活性部位含半胱氨酸残基，优先水解酪氨酸及苯丙氨酸残基，有较强的蛋白水解能力。风味蛋白酶是一种以端肽酶为主的复合型蛋白酶，在水解蛋白质时，主要发挥端肽酶的作用，从多肽链的末端水解多肽。这两种蛋白酶酶切位点的不同，相互促进，一种蛋白酶切断肽链后，为另外一种蛋白酶提供了更多的酶切位点，提高了底物的水解速度，能够得到较高抗氧化活性的营养液。
[0005]无花果蛋白酶和风味蛋白酶同时酶解原料蛋白质，由于酶的特异性，两种蛋白酶相互作用，互相促进，从而高效地水解蛋白质，得到更多的活性片段。与单酶酶解相比，无花果蛋白酶和风味蛋白酶同时酶解蛋白质，酶解时间短、能耗低，从而大大降低生产成本，且酶解过程简单方便，易于操作，制备的营养液抗氧化活性高。
[0006]目前还未有用无花果蛋白酶和风味蛋白酶同时酶解的方法制备抗氧化物的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种利用双酶制备牡蛎肉抗氧化功能营养液的方法，使得操作简便、抗氧化活性高、能耗低、成本低、周期短，并且能获得较高活性的抗氧化营养液。
[0008]本发明的技术方案是:一种利用双酶制备牡蛎肉抗氧化功能营养液的方法，具体包括以下步骤: I)预处理:将新鲜牡蛎经过采肉、去壳、清洗、沥干、打浆后，得到均浆液，装袋后置于-20°c冻藏备用；
2 )制备酶解底物:取出冻藏均浆液在流动自来水中解冻，调节料水比1:2 (m/V)，搅拌均匀，得酶解底物；
3)酶解:将酶解底物升温到所需的温度，加酶进行双酶酶解，酶解工艺参数为:无花果蛋白酶与风味蛋白酶的质量比例5:1?5:1，总酶量(酶占均浆液质量百分比)4 %?12 %，酶解初始pH为5.5?7.5，酶解温度45°C -55 °C，酶解时间2?6 h ;
4)灭酶:酶解完成，将酶解液在恒温100°C下灭酶处理；
5)冷却:将灭酶完毕的酶解液进行水浴冷却；
6)离心:将冷却后的酶解液在转速6000r/min下进行离心，收集上清液，即成。
[0009]本发明的有益效果是:与之前的牡蛎肉酶解方法相比，本发明首次将无花果蛋白酶和风味蛋白酶相结合酶解牡蛎肉，充分利用无花果蛋白酶和风味蛋白酶酶切位点的不同，两种蛋白酶相互作用，互相促进，一种蛋白酶切断肽链后，为另外一种蛋白酶提供了更多的酶切位点，从而高效地水解蛋白质，既缩短了提取时间，又能得到较高抗氧化活性的营养液。本发明提供的抗氧化功能营养液的双酶制备方法也同样适用于其它贝类的加工，是一项有效开发我国丰富的海产、淡水贝类资源，提高我国海产、淡水贝类资源经济价值的切实可行的技术方法。
【具体实施方式】
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案。
[0010]实施例1
将新鲜牡蛎采肉去壳、清洗、沥干，用组织捣碎机进行均浆，均浆液装袋并置于-20°C下冻藏备用；用流动自来水对冷冻的均浆液解冻15min，称取10.0 g均浆液置于100 mL锥形瓶中，按料水比I: 2 (m/V)加入20.0 mL自来水，搅拌均匀，用0.lmol/L NaOH和0.1mol/L HCl调节pH到6.5，无花果蛋白酶和风味蛋白酶按照1:3的比例，总酶量按照10 % (以牡蛎肉均浆液质量计)同时加入。将酶解底物放入水浴锅中45°C保温酶解，并每隔20 min搅拌I次，酶解2 h后，100°C沸水浴下灭酶10 min，将灭酶完毕的酶解液进行水浴冷却10min，冷却后再以6000 r/min离心15 min，取上清液即得到抗氧化营养液，冰箱4 °C冷藏备用。经测定抗氧化营养液的DPPH清除率为72.50%，水解度为23.18%。
[0011]实施例2
将新鲜牡蛎采肉、清洗、沥干，用组织捣碎机进行均浆，均浆液装袋并置于_20°C下冻藏备用；用流动自来水对冷冻的均浆液进行解冻20min，称取10.0 g牡蛎均浆液置于100 mL锥形瓶中，按料水比1: 2 (m/V)加入20.0 mL自来水，用0.lmol/L的NaOH和HCl调节pH到7.0，无花果蛋白酶和风味蛋白酶按照5:1的比例，总酶量按照10 % (以牡蛎肉均浆液质量计)同时加入。将酶解底物放入水浴锅中50°C保温酶解，并每隔20 min搅拌I次，酶解4 h后，100°C沸水浴下灭酶13 min，将灭酶完毕的酶解液进行水浴冷却15 min，冷却后再以6000 r/min离心15 min，取上清液即得到抗氧化营养液，冰箱4 °C冷藏备用。经测定抗氧化营养液的DPPH清除率为79.40%，水解度为24.71%。
[0012]实施例3 将新鲜牡蛎采肉、清洗、沥干，用组织捣碎机进行均浆，均浆液装袋并置于_20°C下冻藏备用；用流动自来水对冷冻的均浆液进行解冻18min，称取10.0 g牡蛎均浆液置于100 mL锥形瓶中，按料水比1: 2 (m/V)加入20.0 mL自来水，用0.lmol/L的NaOH和HCl调节pH到7.0，无花果蛋白酶和风味蛋白酶按照1:1的比例，总加酶量6%(以牡蛎肉均浆液质量计算)，先加入风味蛋白酶，将酶解底物放入水浴锅中50°C保温，并每隔20 min搅拌I次，待酶解3 h后冷却，调节酶解底物pH为6.0，再加入无花果蛋白酶继续55 °C保温酶解，再酶解3 h后，100°C沸水浴下灭酶10 min，将灭酶完毕的酶解液进行水浴冷却10 min，冷却后再以6000 r/min离心25 min，取上清液即得到抗氧化营养液，冰箱4 °C冷藏备用。经测定抗氧化营养液的DPPH清除率为77.40%，水解度为26.35%。
【主权项】
1.一种利用双酶制备牡蛎肉抗氧化功能营养液的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 预处理:将新鲜牡蛎经过采肉去壳、清洗、沥干、打浆后，得到均浆液，装袋后置于-20°c冻藏备用； 制备酶解底物:取出冻藏均浆液在流动自来水中解冻，调节料水比1:2 (m/V)，搅拌均匀，得到酶解底物； 酶解:将酶解底物升温到所需的温度，加酶进行双酶酶解， 酶解工艺参数为:无花果蛋白酶与风味蛋白酶的质量比5:1?1:5，总酶量(酶占均浆液质量百分比)4 %?12 %，酶解初始pH为5.5?7.5，酶解温度45°C -55 °C，酶解时间2 ?6 h ; 灭酶:酶解完成，将酶解液在恒温100 °c下灭酶处理； 冷却:将灭酶完毕的酶解液进行水浴冷却； 离心:将冷却后的酶解液在转速6000 r/min下进行离心，收集上清液，即成。
2.根据权利要求1所述的利用双酶制备牡蛎肉抗氧化功能营养液的方法，其特征在于:所述的冻藏均浆液解冻时间为15~20min，灭酶时间10~13 min，水浴冷却时间10~15min，离心时间为15 ~25min。
【专利摘要】本发明公开了一种利用双酶制备牡蛎肉抗氧化功能营养液的方法。该方法的主要步骤为：1）预处理：将新鲜牡蛎经采肉、去壳、清洗、沥干、打浆后，得到均浆液，装袋后置于-20℃冻藏备用；2）制备酶解底物：取出冻藏均浆液在流动自来水中解冻，调节料水比1:2（m/V），搅拌均匀，得酶解底物；3）酶解：将酶解底物升温到所需的温度，加酶进行双酶酶解，酶解工艺参数为：无花果蛋白酶与风味蛋白酶的质量比例5:1～5:1，总酶量（酶占酶解底物的质量百分比）4%～12%，酶解初始pH为5.5～7.5，酶解温度45℃~55℃，酶解时间2～6h；4）灭酶：酶解完成，将酶解液在恒温100℃下灭酶处理；5）冷却：将灭酶完毕的酶解液进行水浴冷却；6）离心：将冷却后的酶解液在转速6000r/min下进行离心，收集上清液，即成。
【IPC分类】C12P21-06
【公开号】CN104878061
【申请号】CN201510245154
【发明人】段振华, 刘艳, 李园
【申请人】海南大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月15日