专利名称：基于蛋白质三聚化模序的高分泌性三聚体蛋白的表达方法
技术领域：
本发明涉及一种外源蛋白的表达方法，尤其涉及一种高分泌性三聚体蛋白的表达 方法，属于三聚体蛋白的表达领域。
背景技术：
绝大多数分泌性蛋白质的氨基端都有一段15 35个氨基酸的信号肽 (signalp印tide)，其功能是引导新生的蛋白质多肽链穿过内质网膜进入内质网腔内。信号 肽在穿越内质网膜后即被内质网腔内的信号肽酶水解切除，此时新生多肽链开始折叠及其 他一系列修饰过程，再通过囊泡系统进入高尔基体完成进一步修饰，最终形成成熟的分泌 蛋白。可见，对于分泌性蛋白而言，只有确保信号肽及时准确地切除，才能在细胞内生成足 够量的活性蛋白，并最终获得理想的分泌产量(Li，Y.，et al. ,Viral liposomes released from insect cells infected withrecombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus. J Virol,1993. 67(7) :p. 4415-20. Kypr, J. and J. Mrazek, Unusual codon usage ofHIV. Nature, 1987. 327(6117) :p. 20.)。因此筛选具有 相对实用性广和可高效率引导蛋白质分泌表达的信号肽序列是优化蛋白质外源表达的关 键策略之一。基于信号肽可介导蛋白质分泌及可在不同蛋白质间互通使用的特点，可以通 过优化信号肽序列或引入外源高分泌性信号肽来提高目的蛋白的产量和分泌效率。人组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)的信号肽(Met -Asp-Ala-Met-Lys-Arg-Gly-Leu-Cys-Cys-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Gly-Ala-Val-Phe-Val-Ser-Pro-Ser)是目前应用最广泛的外源性信号肽之一。tPA信号肽具有强分泌信号肽的典 型特征1)信号肽N端有两个正电荷氨基酸，介导信号肽与内质网膜信号肽受体的识别；2) 序列中部主要由疏水氨基酸组成疏水核心，具有形成α螺旋的倾向，有利于信号肽与脂质 双层作用，引导新生肽穿过内质网膜；3)序列C末端靠近切割处主要由极性氨基酸组成，形 成β折叠，容易断裂，符合信号肽酶的切割位点的特点。由于上述特征，tPA信号肽往往作 为外源性信号肽应用于人体内或体外人类细胞系中目的蛋白的分泌表达。Chapman等首次将tPA信号肽作为外源性分泌信号应用于HIV-1包膜糖蛋 白(envelope glycoprotein, Env)的体外表达，其构建策略是删除目的蛋白的信号肽 序列，将tPA信号肽引入目的蛋白的氨基端。用tPA信号肽替换Env原有信号肽后， Env 蛋白分泌水平显著上升(Chapman, B. S.，et al.，Effect of intron A fromhuman cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expressionin mammalian cells. Nucleic Acids Res，1991. 19 (14) :p. 3979-86.)。随后的研究进一 步表明，tPA引导的Env蛋白的免疫原性明显强于野生株Env蛋白(Pfeiffer，Τ.，et al. , Effects of signal peptide exchange on HIV-I glycoprotein expression and viral infect ivity in mammalian cells. FEBS Lett, 2006. 580 (15) :p. 3775-8.)。截止目 前，tPA信号肽也广泛用于结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、轮状病毒、日本脑炎病毒、痘苗病 毒、流感病毒、人乳头瘤病毒等多种细菌、病毒的结构蛋白的分泌表达，均不同程度地提高了目的蛋白的表达量和免疫原性。2003年，中国国家知识产权局公开了四个SARS冠状病毒结构蛋白的表达质粒 pVPH(CN1449827)、pVPM(CN1449828)、pVPS (CN1449829)、pVPS2 (CN1449831)。其构建策略 是将tPA信号序列插入SARS病毒M基因、HE基因、S基因或S蛋白抗原决定簇基因的N末 端，再将融合基因克隆至原核或真核表达载体，作为SARS病毒的DNA疫苗候选。上述关于tPA信号肽的应用和专利主要利用了 tPA信号肽的高效分泌特性，其研 究对象是蛋白质的一个亚基或一个亚单位，获得的目的蛋白以分泌形式表达至细胞外。但 是，对于天然状态下以三聚体形式存在的蛋白质，如HIV-IEnv蛋白、SARS病毒S蛋白、流感 病毒血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)等，除了需要实现蛋白的分泌表达之外，还必须考虑 如何模拟和维持蛋白质的天然三聚体结构，以便研究蛋白质的结构和生物学功能、提高蛋 白质的免疫原性。然而，截止目前，国内尚无以tPA作为外源信号肽引导三聚体蛋白分泌表 达的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服三聚体蛋白质在表达过程中所存在的分泌效 率不高、三聚体产物比例小，纯度低等问题，提供一种可广泛应用的分泌性三聚体蛋白质的 表达方法，该方法所表达的目的蛋白能高效分泌表达，同时还可模拟和维持蛋白的三聚体 构象，三聚体产物比例大，纯度高。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种高分泌性三聚体蛋白的表达方法，包括以下步骤(1)将tPA信号肽基因序列、目的蛋白基因和蛋白质三聚化模序基因序列连接在 一起，三者位于同一读码框内，得到融合基因；其中，目的蛋白的N末端与tPA信号肽相连， 目的蛋白的C末端与蛋白质三聚化模序N末端相连；(2)将步骤(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表达载体，构建得到融合蛋 白的原核或真核表达载体；(3)利用原核或真核表达系统，体内或体外表达融合蛋白，即得。上述表达方法中，所述的蛋白质三聚化模序的氨基酸序列为SEQ ID NO :2所示，编 码蛋白质三聚化模序的基因序列可以为SEQ ID NO 1所示；该三聚化模序(MTI)的三聚化 趋势强，三聚化程度高，分子量小，对目的蛋白的结构影响很小，可广泛应用于三聚化蛋白 质的表达。所述的tPA信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO 4所示；编码该tPA信号肽的基因 序列为SEQ ID NO 3所示。当然，含有tPA信号肽基因序列(SEQ ID NO 3)和蛋白质三聚化模序基因序列 (SEQ ID NO 1)的任何一种重组原核或真核表达载体都落在本发明的保护范围之内。本发明通过向目的蛋白的氨基端引入一个组织性纤溶酶原激活物tPA的信号肽 序列以及向目的蛋白的羧基端引入一个三聚化蛋白模序MTI，形成一个新组合，实现目的蛋 白在原核或真核细胞高水平分泌及三聚化表达。本发明方法的主要优点和应用1、本发明表达方法可广泛用于天然构象为三聚体的蛋白质的结构和功能研究。
2、本发明所涉及的表达方法可用于天然以三聚体形式存在的蛋白质的表达，进而 筛选与三聚体目的蛋白相互作用的配体分子。3、本发明表达方法可用于构建和表达天然以三聚体形式存在的病毒表面抗原，产 物可作为DNA免疫原，用于体内表达，构建候选基因疫苗；表达产物可作为蛋白免疫原，构 建候选亚单位疫苗，有潜在的远期社会和经济效益。4、本发明表达方法可用于天然以三聚体形式存在的病毒表面蛋白的表达，表达产 物可用于诊断试剂的开发并应用于病毒性疾病的诊断，将产生较大的经济效益。
图1是tPA信号肽和三聚化模序MTI引入目的蛋白的模式图；图2是将融合蛋白基因引入表达载体的模式图；图3A-3D是目的蛋白在293T细胞瞬时表达及鉴定的结果图；其中，图3A是目的蛋 白在细胞裂解产物中的检测结果(以GAPDH为内参照)；图3B是目的蛋白在培养上清中的 检测结果；图3C是细胞裂解产物中目的蛋白的相对化学发光(ECL)信号强度，以HAlwt转 染细胞中目的蛋白的信号强度为100%。图3D是细胞培养上清中目的蛋白的相对化学发光 信号强度，以HAlwt转染后的培养上清中目的蛋白的信号强度为100% ；图4A-4B是融合蛋白表达载体瞬时转染293T细胞后三聚化融合蛋白在细胞培 养上清中分泌表达及鉴定的结果图；其中，图4A是非还原PAGE的检测结果；图4B是图 HAl-MTI泳道中各个聚合形式目的蛋白相对百分比构成。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证 的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1本实施例所述的三聚化模序MTI的氨基酸序列是=Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-L yS-Glu-Glu-IIe-Ala-Lys-IIe-LyS-Glu-Glu-IIe-Ala-Lys-IIe-Lys-Glu-Lys-IIe-Ala-Gl u-IIe-Glu-Lys-Arg-IIe-Ala-Glu-IIe-Glu-Lys-Arg-IIe-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ ID No 2)。本实施例所述的tPA信号肽的氨基酸序列是=Met-Asp-Ala-Met-Lys-Arg-Gly-Le u-Cys-Cys-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Gly-Ala-Val-Phe-Val-Ser-Ala-Ser(SEQ ID No :4)。一、流感病毒血凝素蛋白HAl亚基与MTI的融合重组体的构建1、获取目的基因首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68 (购自美国ATCC)总RNA， 以获得的总RNA为模板，进行RT反应产生cDNA ；再以cDNA为模板，利用引物HAlUP (TACAGGA TCCGCCATGAAGACTATCATTGCT)和 HA1D0WN(TCTAGCTAGCAGTTTGTTTCTCTGGTACATTTCGC)PCR 扩 增保留天然信号肽的HAl基因，或利用引物HAlEUP (CGACGAATTCCAAAAACTTCCT GGAAATGAC) 和引物HA1D0WN PCR扩增删除信号肽序列的HAl基因。反应条件为98°C 15s，60°C 10s， 72°C 2min，共 30 个循环，DNA聚合酶为 PrimeStar HS DNA Polymerase (购自日本TaKaRa)。2、融合重组体的构建再将纯化后的天然HAl基因克隆至载体pcDNA3. 1⑴(购自 美国Invitrogen)获得天然HAl蛋白表达载体HAlwt ；将编码MTI蛋白的基因(GGAGGTTCTG
5GAGGGATTAAAGAGGAGATTGCCAAAATCAAAGAAGAAATAGCTAAGATCAAAGAGAAGATAGCTGAGATTGAAAAG AGAATCGCAGAAATTGAMAGAGAATTGCTGGCGGTTGTTGC) (SEQ ID No 1)合成于载体 pcDNA3. 1 (+) 的多克隆位点EcoR I, Xho I之间获得载体pcMTI，再将tPA信号肽编码基因(ATGGATGCAA TGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGGCCAGC) (SEQ ID No 3)合成 至pcMTI上获得载体pcT-MTI，再将纯化后的不含信号肽序列的HAl基因克隆至pcT-MTI上 获得融合蛋白表达载体HAl-MTI，其中tPA基因C末端与HAl基因的N末端相连，HAl基因 的C末端与MTI的N末端相连，三者位于同一读码框内。二、融合蛋白的表达1、真核细胞转染实验将人胚肾293T细胞(购自美国ATCC)以5X105个/孔的密 度铺于6孔板内，置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积 的85% -90%时，将4μ g HAl重组质粒HAlwt或重组质粒HAl-MTI转染至293T细胞内，所 用的转染试剂为Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。2、表达产物的收获转染后72h，将Iml 293T细胞培养上清转移至2. Oml离心管 内，3000 Xg离心5min，弃去细胞碎片，将离心上清分装于0. 5ml离心管中，于_40°C保存。 用PBS简单洗涤细胞层，消化并收获细胞沉淀。向细胞沉淀中加入ΙΟΟμ IlXlysis buffer 裂解细胞，10000 Xg离心lOmin，将离心上清转移至0. 5ml离心管中，于_40°C保存。三、利用特异性抗体通过western blotting方法检测产物中的重组蛋白1、SDS-PAGE电泳向100 μ 1收获的细胞裂解产物或细胞上清中加入 20 μ 16X loading buffer (0. 35M Tris-HCl ρΗ6· 8，30 % 甘油，10 % SDS，0· 012 % 溴酚蓝， 6% β-巯基乙醇)，充分混勻，100°C煮沸5min后，4°C 8000Xg，离心lOmin，取40μ 1离心 上清加载至12% SDS-PAGE凝胶中，160V电泳lh。细胞裂解产物以GAPDH为内参照调整样 品上样量，培养上清各泳道总蛋白上样量为250 μ g。2、非还原PAGE电泳向125 μ 1收获的细胞上清中力Π入25 μ 1 6Xnon-reducedloading buffer (0. 35M Tris-HCl ρΗ6· 8，30 % 甘油，10 % SDS，0· 012 % 溴酚蓝)，充分混勻，100°C煮沸2min后，4°C 8000Xg,离心lOmin，蛋白样品加载至8 % SDS-PAGE凝胶中，160V电泳lh。各泳道总蛋白上样量均为900 μ g。3,ffestern blotting 电泳结束后，将蛋白质转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉于 37°C封闭2h。封闭后的PVDF膜与兔抗HA单克隆抗体(1 1000，购自美国CST)于4°C过 夜孵育，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG于37°C孵育lh。加入过氧化物酶 底物，显示蛋白条带。实验结果如图3、图4所示。图3是目的蛋白在293T细胞瞬时表达及鉴定的结果图。其中，图3A是目的蛋 白在细胞裂解产物中的检测结果(以GAPDH为内参照)，图3B是目的蛋白在培养上清中 的检测结果(各泳道总蛋白上样量均为250yg)。各自的第一泳道是天然形式目的蛋白 HAl (60KD)；各自的第二泳道是tPA信号肽替换及引入MTI后表达的目的蛋白HAl (60KD)； 各自的第三泳道是阴性对照。图3C是细胞裂解产物中目的蛋白的相对化学发光(ECL)信号 强度，以HAlwt转染细胞中目的蛋白的信号强度为100%。图3D是细胞培养上清中目的蛋 白的相对化学发光信号强度，以HAlwt转染后的培养上清中目的蛋白的信号强度为100%。从图3可见，转染72h后，HAl-MTI转染组细胞内目的蛋白表达量较HAlwt转染组
6提高2. 25倍(图3A，图3C)，分泌至上清中的目的蛋白较HAlwt转染组提高1. 24倍(图 3B,图 3D)。图4是融合蛋白表达载体瞬时转染293T细胞后三聚化融合蛋白在细胞培养上清 中分泌表达及鉴定的结果图。其中，图4A是非还原PAGE的检测结果，第一泳道是HAlwt转 染组培养上清中检测到的单体形式目的蛋白，第二泳道是HAl-MTI转染组培养上清中检测 到的单体、二聚体和三聚体形式目的蛋白，第三泳道是阴性对照，各泳道总蛋白上样量均为 900 μ g。图4B是HAl-MTI泳道中各个聚合形式目的蛋白相对百分比构成。从图4可见，HAl-MTI转染上清中目的蛋白多以三聚体的形式存在，其构成比为 58 %，具有优势，产物纯度较高。可见，tPA信号肽与三聚化模序MTI组合后，不仅提高目的蛋白在细胞内外的表达 量，同时提高了三聚体蛋白的分泌水平，实现了目的蛋白的高效性三聚化分泌表达。以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性 的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变， 修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
一种高分泌性三聚体蛋白的表达方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将tPA信号肽基因序列、目的蛋白基因序列和蛋白质三聚化模序基因序列连接在一起，得到融合基因；其中，目的蛋白的N末端与tPA信号肽相连，目的蛋白的C末端与蛋白质三聚化模序蛋白N末端相连；(2)将步骤(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表达载体，构建得到融合蛋白原核或真核表达载体；(3)利用原核或真核表达系统，体内或体外表达融合蛋白，即得。
2.按照权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述的蛋白质三聚化模序的氨基酸 序列为SEQ ID NO 2所示。
3.按照权利要求2所述的表达方法，其特征在于，编码蛋白质三聚化模序的基因序列 为 SEQ ID NO 1 所示。
4.按照权利要求1所述的表达方法，其特征在于，所述的tPA信号肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO 4 所示。
5.按照权利要求4所述的表达方法，其特征在于，编码所述tPA信号肽的基因序列为 SEQ ID NO 3 所示。
6.一种重组原核或真核表达载体，其特征在于，包括tPA信号肽基因序列和蛋白质三 聚化模序基因序列。
7.按照权利要求6所述的原核或真核重组表达载体，其特征在于，所述的蛋白质三聚 化模序的基因序列为SEQ ID NO 1所示。
8.按照权利要求6所述的原核或真核重组表达载体，其特征在于，所述的tPA信号肽的 基因序列为SEQ ID NO 3所示。
9.权利要求6-8任何一项所述的重组原核或真核表达载体在表达三聚体蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高分泌性三聚体蛋白的表达方法。该表达方法包括(1)将tPA信号肽基因序列、目的蛋白基因和蛋白质三聚化模序基因序列连接在一起；其中，目的蛋白的N末端与tPA信号肽相连，其C末端与蛋白质三聚化模序蛋白N末端相连；(2)将融合基因克隆至原核或真核表达载体，得到融合蛋白原核或真核表达载体；(3)体内或体外表达融合蛋白，即得。本发明通过向目的蛋白的氨基端引入一个组织性纤溶酶原激活物tPA的信号肽序列以及向其羧基端引入一个三聚化蛋白模序MTI，实现目的蛋白在原核或真核细胞高水平分泌及三聚化表达，获得功能性蛋白。本发明可广泛用于天然以三聚体形式存在的病毒以及其他蛋白在原核或真核细胞的分泌性高水平表达。
文档编号C12N15/79GK101948864SQ20101013309
公开日2011年1月19日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者凌虹, 李妍, 杨丹, 王甲业, 程德春, 陈文江 申请人:哈尔滨医科大学