特异性结合穿孔素的核酸适配体及其应用
【专利摘要】本发明公开了特异性结合穿孔素的核酸适配体及其应用，穿孔素适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.8所示，该适配体能够与穿孔素蛋白发生特异结合，因此可以用于穿孔素蛋白纯化和浓缩，也可以与治疗药物结合后作为靶向穿孔素蛋白的药物，还可以作为穿孔素蛋白定量或定性检测试剂，应用前景广泛。
【专利说明】
特异性结合穿孔素的核酸适配体及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于适体领域，具体设及特异性结合穿孔素的核酸适配体，还设及该适配 体的应用。
【背景技术】
[0002] 穿孔素（perforin，又称成孔蛋白pore-formin甜rotein，简称：PFP)是一种分子量 为67kD，存在于细胞毒性T淋己细胞(CTL)和NK细胞胞质的细胞毒颗粒中的糖蛋白，又称C9 相关蛋白或溶细胞素（cytolysin)，成熟的穿孔素分子由534个氨基酸残基组成，分子量为 56-75kDa，IP为6.4，穿孔素分子中央部位170-390之间的氨基酸序列与〔9328-560氨酸酸序 列约有20%同源性。穿孔素的作用是效应细胞与祀细胞接触时，释放的穿孔素通过聚合作 用而在祀细胞表面形成多聚穿孔素管状通道，从而介导杀伤作用，导致祀细胞溶解破坏。因 此穿孔素蛋白的检测可协助了解活化免疫细胞的数量，从而反映出机体细胞免疫功能状 态，为临床医生选择最佳的治疗方案、观察治疗效果和判断愈后提供帮助。
[0003] 目前，穿孔素的测定方法主要有免疫组化法化P)、酶联免疫法化LISA)等免疫学检 测法。依赖抗体的免疫学检测法操作简单、灵敏度高，适用于检测大量样品，无需大型昂贵 仪器设备的优点，但假阳性率比较高，定量不够准确。且抗体试剂的储存条件较寡核巧酸严 苛，稳定性差。寡核巧酸适配体能与各种有机物或无机物祀标分子高特异性、高亲和力结 合，还具有分子量小，免疫原性低，稳定性好，制备和标记方便等优点。作为抗体分子的前景 性替代分子，在疾病的诊断和治疗中发挥重要的作用。但迄今尚无针对穿孔素的适配体报 道或公开，因此实有必要开发一种可特异性结合穿孔素的核酸适配体。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供特异性结合穿孔素的核酸适配体;本发明 的目的之二在于提供特异性结合穿孔素的核酸适配体在制备检测穿孔素蛋白试剂中的应 用;本发明的目的之Ξ在于提供特异性结合穿孔素的核酸适配体在纯化和浓缩穿孔素蛋白 中的应用;本发明的目的之四在于提供特异性结合穿孔素的核酸适配体在制备祀向穿孔素 蛋白的药物中的应用;本发明的目的之五在于提供特异性结合穿孔素的核酸适配体修饰的 电极;本发明的目的之六在于提供电极在检测穿孔素蛋白中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1、特异性结合穿孔素的核酸适配体，所述适配体的核巧酸序列如SEQ ID NO.3~ 沈Q IDN0.8所示。
[0007] 优选的，所述适配体与穿孔素蛋白特异结合。
[000引更优选的，所述适配体的至少一个核巧酸被修饰。
[0009] 更优选的，所述适配体5'端修饰琉基。
[0010] 2、所述特异性结合穿孔素的核酸适配体在制备检测穿孔素蛋白试剂中的应用。
[0011] 3、所述特异性结合穿孔素的核酸适配体在纯化和浓缩穿孔素蛋白中的应用。
[0012] 4、所述特异性结合穿孔素的核酸适配体在制备祀向穿孔素蛋白的药物中的应用。
[0013] 5、利用所述特异性结合穿孔素的核酸适配体修饰的电极。
[0014] 优选的，所述电极由W下方法制备:将特异性结合穿孔素的核酸适配体5'端修饰 琉基后然后结合到锻金的玻碳电极表面，然后用己烧琉醇封闭，获得穿孔素适配体修饰电 极。
[0015] 6、所述电极在检测穿孔素蛋白中的应用。
[0016] 本发明的有益效果在于:本发明公开了特异性结合穿孔素的核酸适配体，该适配 体能够与穿孔素蛋白特异结合，为穿孔素蛋白纯化和浓缩，祀向穿孔素蛋白的药物W及定 量或定性检测穿孔素蛋白提供了祀分子，同时为了解活化免疫细胞的数量，反映机体细胞 免疫功能状态提供了工具，也为临床医生选择最佳的治疗方案、观察治疗效果和判断愈后 提供帮助。
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018] 图1为穿孔素核酸适配体1的二级结构。
[0019] 图2为穿孔素核酸适配体2的二级结构。
[0020] 图3为穿孔素核酸适配体3的二级结构。
[0021] 图4为穿孔素核酸适配体4的二级结构。
[0022] 图5为穿孔素核酸适配体5的二级结构。
[0023] 图6为穿孔素核酸适配体6的二级结构。
[0024] 图7为穿孔素核酸适配体1修饰电极检测伏安曲线图（A中a表示裸电极伏安曲线 图，b表示锻金电极伏安曲线图，C表示修饰穿孔素核酸适配体1后己烧琉醇封闭伏安曲线 图，d表示表示修饰穿孔素核酸适配体1后己烧琉醇封闭电极与穿孔素反应伏安曲线图；B中 1表示修饰穿孔素核酸适配体1后己烧琉醇封闭伏安曲线图，2表示修饰穿孔素核酸适配体1 后己烧琉醇封闭电极与INF-丫反应伏安曲线图，3表示修饰穿孔素核酸适配体1后己烧琉醇 封闭电极与BSA反应伏安曲线图，4表示修饰穿孔素核酸适配体1后己烧琉醇封闭电极与穿 孔素反应伏安曲线图）。
[0025] 图8为穿孔素核酸适配体2修饰电极检测伏安曲线图（A中a表示裸电极伏安曲线 图，b表示锻金电极伏安曲线图，C表示修饰穿孔素核酸适配体2后己烧琉醇封闭伏安曲线 图，d表示表示修饰穿孔素核酸适配体2后己烧琉醇封闭电极与穿孔素反应伏安曲线图；B中 1表示修饰穿孔素核酸适配体2后己烧琉醇封闭伏安曲线图，2表示修饰穿孔素核酸适配体2 后己烧琉醇封闭电极与INF-丫反应伏安曲线图，3表示修饰穿孔素核酸适配体2后己烧琉醇 封闭电极与BSA反应伏安曲线图，4表示修饰穿孔素核酸适配体2后己烧琉醇封闭电极与穿 孔素反应伏安曲线图）。
[0026] 图9为穿孔素核酸适配体3修饰电极检测伏安曲线图（A中a表示裸电极伏安曲线 图，b表示锻金电极伏安曲线图，C表示修饰穿孔素核酸适配体3后己烧琉醇封闭伏安曲线 图，d表示表示修饰穿孔素核酸适配体3后己烧琉醇封闭电极与穿孔素反应伏安曲线图；B中 1表示修饰穿孔素核酸适配体3后己烧琉醇封闭伏安曲线图，2表示修饰穿孔素核酸适配体3 后己烧琉醇封闭电极与INF-丫反应伏安曲线图，3表示修饰穿孔素核酸适配体3后己烧琉醇 封闭电极与BSA反应伏安曲线图，4表示修饰穿孔素核酸适配体3后己烧琉醇封闭电极与穿 孔素反应伏安曲线图）。
[0027] 图10为穿孔素核酸适配体4修饰电极检测伏安曲线图（A中a表示裸电极伏安曲线 图，b表示锻金电极伏安曲线图，C表示修饰穿孔素核酸适配体4后己烧琉醇封闭伏安曲线 图，d表示表示修饰穿孔素核酸适配体4后己烧琉醇封闭电极与穿孔素反应伏安曲线图；B中 1表示修饰穿孔素核酸适配体4后己烧琉醇封闭伏安曲线图，2表示修饰穿孔素核酸适配体4 后己烧琉醇封闭电极与INF-丫反应伏安曲线图，3表示修饰穿孔素核酸适配体4后己烧琉醇 封闭电极与BSA反应伏安曲线图，4表示修饰穿孔素核酸适配体4后己烧琉醇封闭电极与穿 孔素反应伏安曲线图）。
[0028] 图11为穿孔素核酸适配体5修饰电极检测伏安曲线图（A中a表示裸电极伏安曲线 图，b表示锻金电极伏安曲线图，C表示修饰穿孔素核酸适配体5后己烧琉醇封闭伏安曲线 图，d表示表示修饰穿孔素核酸适配体5后己烧琉醇封闭电极与穿孔素反应伏安曲线图；B中 1表示修饰穿孔素核酸适配体5后己烧琉醇封闭伏安曲线图，2表示修饰穿孔素核酸适配体5 后己烧琉醇封闭电极与INF-丫反应伏安曲线图，3表示修饰穿孔素核酸适配体5后己烧琉醇 封闭电极与BSA反应伏安曲线图，4表示修饰穿孔素核酸适配体5后己烧琉醇封闭电极与穿 孔素反应伏安曲线图）。
[0029] 图12为穿孔素核酸适配体6修饰电极检测伏安曲线图（A中a表示裸电极伏安曲线 图，b表示锻金电极伏安曲线图，C表示修饰穿孔素核酸适配体6后己烧琉醇封闭伏安曲线 图，d表示表示修饰穿孔素核酸适配体6后己烧琉醇封闭电极与穿孔素反应伏安曲线图；B中 1表示修饰穿孔素核酸适配体6后己烧琉醇封闭伏安曲线图，2表示修饰穿孔素核酸适配体6 后己烧琉醇封闭电极与INF-丫反应伏安曲线图，3表示修饰穿孔素核酸适配体6后己烧琉醇 封闭电极与BSA反应伏安曲线图，4表示修饰穿孔素核酸适配体6后己烧琉醇封闭电极与穿 孔素反应伏安曲线图）。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第Ξ版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0031] 实施例1、簇基磁珠包被穿孔素蛋白
[0032] 取1ml富马酸二甲醋（dimethyl formaide)溶解的含2Xl〇Vml簇基磁珠至EP管， 放磁力架4分钟，小屯、弃去上清加2ml浓度为O.lmol/L憐酸钢(PH7.4)，混匀30秒，静置10分 钟;放磁力架2分钟，小屯、去上清;再用2ml浓度为0.1mol/L憐酸钢重悬磁珠;放置磁力架2分 钟，小屯、去上清，加入60化1浓度为0.1mol/L憐酸钢，加入60化1穿孔素蛋白浓度为Img/ml的 溶液，加600μ1浓度为3mol/L硫酸锭，混匀；37°C解育20小时，慢摇，然后放磁力架4分钟，并 小屯、颠倒磁力架W保证收集到全部磁珠，吸出上清保存。
[00削用封闭有蛋白的PBS洗包被磁珠4次，再用1.8ml封闭有蛋白的PBS重悬磁珠。利用 Life technology的如bit2.0系统，通过标准曲线测定解育后收集上清中各自的蛋白含量， 计算穿孔素蛋白包被的效率。
[0034]实施例2、穿孔素特异性结合寡核巧酸适配体的SELEX筛选
[0035] 构建长度为81个nt的随机ssDNA文库（（由北京全式金生物技术有限公司合成），具 体序列如下：5'-cccctgcaggtgattttgctcaagt-(N35)-agtatcgctaatcaggcggat-3'，两端为 固定序列，中间35N代表35个随机核巧酸，库容量大约为l〇w，库的序列为P81SS库。
[0036] 然后将随机寡聚ssDNA文库用如下引物进行扩增：
[0037] P81-SP:5'-cccctgcaggtgattttgctcaagt-3'（沈Q ID NO.1);
[0038] P8l-AP:5，-Biotin-atccgcctgat1:agcga1:act-3,（沈Q ID N0.2);
[0039] 随机ssDNA文库（首轮筛选量为2000pmol，相当于2个OD随机库）用1ml IX选择缓 冲液溶解于EP管（1%BSA包被，4°C封闭过夜），95°C变性5min;变性后立即置于0°C放置 lOmin。然后将ssDNA文库与BSA封闭的EP管37°C解育比，去除与管壁结合的ssDNA，混匀包被 了穿孔素蛋白的磁珠溶液，取1〇化1于DEPC处理的BSA包被的EP管中，用15化1结合缓冲液洗 涂3次。ssDNA与包被了穿孔素蛋白的磁珠混匀，同时加入酵母tRNA竞争结合，37°C反应化。 置磁力架3~4min，吸弃上清，用IX洗涂选择缓冲液洗去未结合的ssDNA，如此重复3次。置 磁力架3~4min，吸弃上清，管中加入20化1去离子水，100°C加热5min置磁力架2min，取上清 为模板，进行PCR扩增。
[0040] 配置PCR体系：模板化1，引物P81-SP(20uM)0.扣1，引物P81-AP(20uM)0.5yl，dNTP (各2.5mM)4μl，10XBuffer?^l，TaqDNA聚合酶0.25μl，地20 37.7扣l(总体系为50ul)。按 如下条件，在PCR仪上扩增:95°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸45s，共 33个循环;72°C总延伸lOmin。扩增后将PCR产物转移置一个1.5ml离屯、管中，加入2倍体积的 DNA Binding Buffer。将混合液全部转移到核酸纯化柱内，6,000g离屯、Imin，弃去接液管内 液体。向核酸纯化柱内加65化1 Wash Buffer，于12，OOOg离屯、60s，并弃去接液管内液体，重 复2次，再次于12,000g离屯、Imin，然后将核酸纯化柱转移到无菌的1.5ml离屯、管。并向纯化 柱内加入50μ1 Elution Buffer于室溫静置Imin，12,000g离屯、Imin，1.5ml离屯、管内溶液中 含有目的DM片段。
[0041 ]将20化1 2 X磁珠结合一洗涂缓冲液重悬链霉亲和素磁珠 M-280,使链霉亲和素磁 珠的终浓度为扣lg/μL，加入20化1上一步纯化含有目的DNA片段的溶液，室溫（18~25°C)摇 床结合20min，上磁力架1~2min，吸弃上清。用1 X磁珠结合一洗涂缓冲液洗涂2~3次。加入 5化1 lOOmM化0H于37°C解育30min，使dsDNA解链，上磁力架，含生物素的一条ssDNA仍留在 链霉亲和素磁珠上并吸附于管壁，而另一条不带生物素的ssDNA存在于上清中，分离出上清 中ssDNA即为下一轮筛选的富集库，如此反复进行12个循环。
[0042] 克隆测序及序列分析：
[0043] 将第12轮筛选得到的寡核巧酸适配体富集库用无修饰的引物扩增，PCR产物经纯 化后用pMD-19T Cloning Vecto;r(Takara Biotech.Co.,Ltd)克隆并转化到氯化巧感受态 细胞E. ColiD册α中。在含50yg/mL氨节青霉素的固体培养基上培养18小时后，通过"蓝-白斑 筛选"，随机挑选3 0个白色阳性克隆于L B液体培养基中培养，并用试剂盒 (GenerayBiotech. Co. ,Ltd.)提取质粒，送至上海生工生物技术公司测序。测序成功获得的 6条寡核巧酸适配体序列，如SEQID NO.3~SEQ ID NO.8所示，分别命名为穿孔素核酸适配 体1~6,具体序列如下：
[0044] 其中穿孔素核酸适配体 1 为5'-gtcgggcagggttcggcgtatcgtgtcgggtca-3'（沈Q ID NO.3)；
[0045] 穿孔素核酸适配体2为5'-gtgtgatcgctggtggattcctggccgcgtacaac-3'（SEQ ID NO.4)；
[0046] 穿孔素核酸适配体3为5'-ctggtgcccgcccgatcctccattatttgccccag-3'（SEQ ID NO.5)；
[0047] 穿孔素核酸适配体4为5'-acaagtatagaggtcctggccacccttgcgctcct-3'（SEQ ID NO.6)；
[004引 穿孔素核酸适配体5为5'-ggcttccgctgtcatgcggcttcgcacactaagtc-3'（SEQ ID NO.7)；
[0049] 穿孔素核酸适配体6为5'-gtcgccgtagtatagagcaggtggggtgcggcatt-3'（SEQ ID NO.8)；
[0050] 然后采用DNAMAN软件对寡核巧酸适配体序列进行一级结构分析，获得多条序列的 同源性信息；然后根据穿孔素核酸适配体的核巧酸序列用Zuker DNA folding program对 寡核巧酸适配体序列的二级结构进行分析，结构如图1~6所示。
[0051 ]实施例3、循环伏安法检测穿孔素适配体
[0052] 将筛选到的6条适配体5 '端分别修饰琉基，形成5 ' -SH-(CH2)6-适配体序列-3 '，然 后琉基通过Au-S键化学键将适配体结合到锻金的玻碳电极表面，然后用己烧琉醇封闭，获 得穿孔素适配体修饰电极。具体步骤为：用润湿的锻金的玻碳电极表面，然后依次用加有 0.3WI1和0.05μπι Ab化粉末的鹿皮对电极进行抛光打磨，每次打磨后将电极用超纯水洗净， 再依次于乙醇和超纯水中超声洗涂5min，处理后的金电极干燥备用；在处理后的金电极表 面滴加20化2μΜ的5 '端分别修饰琉基的溶液，室溫修饰过夜，用超纯水清洗电极，再在电极 表面滴加20化ImM的己烧琉醇溶液，室溫解育40分钟封闭非特异性吸附位点，用超纯水清 洗电极，即得。
[0053] 然后W制得的穿孔素适配体修饰电极为工作电极，饱和甘隶电极为参比电极，销 电极作为对电极，组建电化学生物传感器。将组建的电化学生物传感器连入电化学工作站， 于抑7.4的含2mmol/L K3(CN)6/K4Fe(CN)6和5mmol KC1的PBS中进行循环伏安扫描，工作电 位为-0.3V~0.7V，扫描速度为50mV/s。
[0054] 图7为SEQ ID NO. 3所示穿孔素适配体修饰电极为工作电极检测穿孔素伏安曲线 图，其中A为W裸电极、锻金电极作为对照伏安曲线图；B为WINF-丫、BSA和穿孔素蛋白 (PFP)为检测物伏安曲线图。结果显示，PFP与SEQ ID NO.3所示穿孔素适配体修饰电极作用 后电流减少，表明SEQ ID NO.3所示穿孔素适配体能够与PFP特异结合，因此可W用于检测 穿孔素。
[0055] 图8为SEQ ID NO.4所示穿孔素适配体修饰电极为工作电极检测穿孔素伏安曲线 图，其中A为W裸电极、锻金电极作为对照伏安曲线图；B为WINF-丫、BSA和穿孔素蛋白 (PFP)为检测物伏安曲线图。结果显示，PFP与SEQ ID NO.4所示穿孔素适配体修饰电极作用 后电流减少，表明SEQ ID NO.4所示穿孔素适配体能够与PFP特异结合，因此可W用于检测 穿孔素。
[0056] 图9为SEQ ID NO. 5所示穿孔素适配体修饰电极为工作电极检测穿孔素伏安曲线 图，其中A为W裸电极、锻金电极作为对照伏安曲线图；B为WINF-丫、BSA和穿孔素蛋白 (PFP)为检测物伏安曲线图。结果显示，PFP与SEQ ID NO.5所示穿孔素适配体修饰电极作用 后电流减少，表明SEQ ID NO.5所示穿孔素适配体能够与PFP特异结合，因此可W用于检测 穿孔素。
[0057]图10为SEQ ID NO.6所示穿孔素适配体修饰电极为工作电极检测穿孔素伏安曲线 图，其中A为W裸电极、锻金电极作为对照伏安曲线图；B为WINF-丫、BSA和穿孔素蛋白 (PFP)为检测物伏安曲线图。结果显示，PFP与SEQ ID NO.6所示穿孔素适配体修饰电极作用 后电流减少，表明SEQ ID NO.6所示穿孔素适配体能够与PFP特异结合，因此可W用于检测 穿孔素。
[005引图11为SEQ ID NO.7所示穿孔素适配体修饰电极为工作电极检测穿孔素伏安曲线 图，其中A为W裸电极、锻金电极作为对照伏安曲线图；B为WINF-丫、BSA和穿孔素蛋白 (PFP)为检测物伏安曲线图。结果显示，PFP与SEQ ID NO.7所示穿孔素适配体修饰电极作用 后电流减少，表明SEQ ID NO.7所示穿孔素适配体能够与PFP特异结合，因此可W用于检测 穿孔素。
[0059] 图12为SEQ ID NO.8所示穿孔素适配体修饰电极为工作电极检测穿孔素伏安曲线 图，其中A为W裸电极、锻金电极作为对照伏安曲线图；B为WINF-丫、BSA和穿孔素蛋白 (PFP)为检测物伏安曲线图。结果显示，PFP与SEQ ID NO.8所示穿孔素适配体修饰电极作用 后电流减少，表明SEQ ID NO.8所示穿孔素适配体能够与PFP特异结合，因此可W用于检测 穿孔素。
[0060] 上述结果表明，本发明筛选获得的穿孔素适配体均可W作为特异检测穿孔素的配 体，用于了解活化免疫细胞的数量，反映出机体细胞免疫功能状态，为临床医生选择最佳的 治疗方案、观察治疗效果和判断愈后提供帮助。同时由于穿孔素适配体能够与穿孔素蛋白 特异结合，因此可W作为穿孔素蛋白纯化和浓缩的祀标，也可W与相关治疗药物结合后作 为祀向穿孔素蛋白的药物治疗相关疾病。
[0061] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 特异性结合穿孔素的核酸适配体，其特征在于:所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3~SEQ ID NO.8所示。2. 根据权利要求1所述特异性结合穿孔素的核酸适配体，其特征在于:所述适配体与穿 孔素蛋白特异结合。3. 根据权利要求1所述特异性结合穿孔素的核酸适配体，其特征在于:所述适配体的至 少一个核苷酸被修饰。4. 根据权利要求3所述特异性结合穿孔素的核酸适配体，其特征在于:所述适配体5 '端 修饰疏基。5. 权利要求1~4任一项所述特异性结合穿孔素的核酸适配体在制备检测穿孔素蛋白 试剂中的应用。6. 权利要求1~4任一项所述特异性结合穿孔素的核酸适配体在纯化和浓缩穿孔素蛋 白中的应用。7. 权利要求1~4任一项所述特异性结合穿孔素的核酸适配体在制备靶向穿孔素蛋白 的药物中的应用。8. 利用权利要求1~4任一项所述特异性结合穿孔素的核酸适配体修饰的电极。9. 根据权利要求8所述电极，其特征在于:所述电极由以下方法制备:将特异性结合穿 孔素的核酸适配体5'端修饰巯基后然后结合到镀金的玻碳电极表面，然后用己烷巯醇封 闭，获得穿孔素适配体修饰电极。10. 权利要求8或9所述电极在检测穿孔素蛋白中的应用。
【文档编号】C12N15/115GK106011143SQ201610429221
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】孟凡飞, 李毅, 倪丹妮, 蒋兴宇, 刘飞, 蒋栋能, 张立群, 蒲晓允
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第二附属医院