专利名称：用于诊断和治疗的金属-放射性核素标记的蛋白质与糖蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及在诊断和治疗领域有用的放射性核素标记的生物物质，特别是涉及供体原子是氮和硫的金属螯合物。
放射性标记化合物在医学诊断和治疗中是很重要的工具。这样一些化合物被用于各种技术中，包括深部静脉血栓的诊断、淋巴结病理学的研究，以及肿瘤的探测、分期和治疗。一些这样的化合物采用了像锝-99m这样的金属放射性核素。当在体内施用放射性核素时，希望该放射性核素集中于靶器官或癌部位。因此，通常将放射性核素配制得使之能与特定的器官或组织优先结合或为其优先吸收。具有重要意义的是能够准确地将放射性核素引导到预先选定的部位上，以减少针对周围的或较远组织的背景辐射，减少剂量，使体内成像时背景减至最小，並使不希望的副作用减至最小。为此，对涉及可以结合放射性核素的特异配位体或受体的方法特别感兴趣。
有关的出版物包括Khaw等人，“J.Nucl.Med.”(1982)23∶1011;Rhodes，B.A.，“Sem.Nucl.Med”(1974)4∶281;Davison等人，“Inorg.Chem.”(1981)20∶1629;以及Byrne和Tolman，“J.Nucl.Med.”(1983)24∶126。特别可参见Fritzberg等人，同上(J.Nucl.Med.)(1981)22∶258;以及Fritzberg等人，同上(1982)23∶17对乙二胺羧酸衍生物的巯基乙酰基衍生物的描述。还可参见美国专利No.4，444，6901984年6月25日提交的流水号为624，098的待批申请公开了用于闪烁法和评价肾功能的巯基乙酰基甘氨酰甘氨酰基甘氨酸(mercaptoacetylglycylglycylglycine)的锝衍生物。1985年1月14日提交的流水号为692，000的待批申请公开了用于诊断和治疗的金属-放射性核素标记的蛋白质，其中的金属螯合物是二硫二酰胺羧酸及其衍生物。
金属-放射性核素标记的蛋白质、碳水化合物和糖蛋白用于各种病理状况的诊断和治疗。与蛋白质、碳水化合物或糖蛋白结合的、特殊螯合了的放射性核素络合物被用于诊断各种生理状况的诊断，包括淋巴结病理学、深部静脉血栓和肿瘤的探测和分期。以蛋白质和糖蛋白形式的螯合放射性核素用于肿瘤的放射性治疗。
具体地说，本发明的放射性核素标记的蛋白质，碳水化合物和糖蛋白由诸如活化的羧酸基团或多配位体螯合物的伯胺基团这样的官能团分别与蛋白质的游离氨基或末端氨基，或者与碳水化合物或糖蛋白的先形成的醛部分反应形成的。该醛部分可由高碘酸盐或其它氧化剂与碳水化合物或糖蛋白中的糖单元反应而生成。本发明的螯合物一般是具有一个硫原子和三个氮原子、能与像例如99mTcO3+，99mTcO2+，ReO3+或ReO+2这样的金属放射性核素结合的多配位体有机化合物(N3S螯合物)。对于本说明书和所附权利要求来说，术语“碳水化合物”应当考虑包括碳水化合物类(包括寡聚糖)、糖蛋白的碳水化合物部分或任何其它的碳水化合物部分。
图1A至1I描述了本发明9种“N3S”螯合物的化学结构。在这9个给出的化合物中，硫保护基团(PG)以及蛋白质结合基团和其它一些取代基有所不同。
提供了改进的方法和组合物，涉及到用于与蛋白质、碳水化合物和糖蛋白结合的螯合物的前体和衍生物。还公开和讨论了产生的与放射性核素络合的多肽结合物和碳水化合物结合物以及这些结合物在放射性成像和放射性治疗中的用途。
这些金属螯合物是三氮硫代螯合物，其中提供电子与金属原子或离子形成键的杂原子是由二个或三个碳原子、最好是二个隔开，並且硫可以是被取代的或未被取代的。在本发明的另一个具体方案中，末端的供体氮原子通过一个键合基团，通常是亚烷基，与一个氨基(伯氨或仲氨)基团连接、或与一个非氧代-羰基(羧基或它的衍生物)基团，通常是酸或活性酯连接。该酯在含水介质中与氮基能生成酰胺键。该螯合物在其链上、特别是沿S-N方向的氮原子的左边(即在下面结构式中用“X”标记的一个或多个位置，由此生成酰胺键)还具有0至3个羰基。该螯合物一般具有总数为8至26的碳原子，通常是8至20个碳原子。各种取代基会对该螯合物加上更多的碳原子。
该螯合物可以以各种方式与多肽或碳水化合物键合。如果该螯合体末端是羧基或它的衍生物，则该羧基可以用碳二亚胺和醇活化，形成活性酯，或者可以已经包含与多肽或氨基糖中有的氨基反应形成酰胺键的活性酯基团。另外一方面，如果螯合体以氨基为末端，则该氨基可用于与醛基反应(该醛基可由高碘酸盐对糖的甘醇裂解得到)生成一种席夫(Schiff)碱或环亚胺，或者在有利于还原性胺化作用的条件下生成伯胺或叔胺或环亚胺键。
大部分这些金属螯合物会具有以下的结构式(Ⅰ)
其中T是H或者一个硫保护基团;
每个X独立地代表H2或O;
每个R独立地代表选自于氢、烷基、双二烷基、除半胱氨酸外的氨基酸的非烷基侧链(当R是烷基时包括烷基侧链)以及-(CH2)n-Z的一个取代基;
Z代表-COOH、一个结合基团，或者靶化合物;
n是1至4的一个整数;以及R′是H2;-(CH2)n-Z;或者具有一个或多个极性基团取代的烷基基团;
其中该化合物包含至少一个-(CH2)n-Z取代基。
当Z是-NH2时，n应当至少是2。当Z是不同于-COOH的其它基团时，n最好是3。
硫保护基团可选自于烷基、芳基、酰基(最好是紫草酰基或苯酰基)、具有1至7个左右碳原子的硫代酰基，以及具有1至10左右个碳原子的有机硫代基团。
对于R基团来说，烷基基团一般有1至7个碳，1至4个碳较好，最好是甲基。
取代基Z的例子包括但不限于-NH2，-NHNH2，-COOH，羧酸酯、亚胺酸酯，异硫代氰酸基团，马来酰亚胺基，其它的迈克尔(Michael)受体基团，
其中W1是至少具有两个氨基酸的多肽，W2和W3独立地代表了氮与其碳原子结合的碳水化合物。“碳水化合物”包括完全由糖单元及糖蛋白和含有氨基酸、核酸或除碳水化合物部分外的其它部分的别的分子组成的纯碳水化合物。通常W2′和W3′是碳水化合物，即多糖，或糖蛋白的碳水化合物部分。具有特别意义的是免疫球蛋白和受体的碳水化合物部分，如果至少一个糖化物单元含有一个氧代或者被氧化而得到一个氧代、亦即醛基基团时，就形成与该碳水化合物结合键。
碳水化合物与该螯合物之间的键合是通过仲胺或叔胺进行的，取决于该碳水化合物的性质以及该螯合络合物与该碳水化合物之间反应的化学计量，形成亚胺键或胺键。
典型地，W1′是具有至少两个氨基酸的一种寡肽，或是具有至少约1000分子量的多肽，通常分子量至少约2000，通常低于1.6兆道尔顿，更一般是低于约800千道尔顿。特别具有意义的是受体，例如，免疫球蛋白，多克隆抗体或单克隆抗体或它们的特异结合片段或者其它天然存在的受体，例如T-细胞受体。酶、激素和对底物或细胞显示出特异结合的其它化合物也具有意义。
T代表氢或一个硫保护基团。可以使用任何一个适宜的硫保护基团，包括已知的烷基、芳基、酰基(最好是紫草酰基或苯酰基)，或具有1至7左右个碳的硫代醛基;或具有1至10左右个碳的有机硫代基。
在本发明的一个具体实施方案中，该硫保护基团，当它与要被保护的硫原子一起被考虑时，是一个半硫代乙缩醛基团。适宜的半硫代乙缩醛基包括但不限于具有以下化学式的那些基团，其中的硫原子是螯合物中的硫原子-S-CH2-O-CH2-CH(CH3)2-S-CH2-O-(CH2)2-OCH3-SCH2OCH3较好的半硫代乙缩醛基一般具有以下的化学式，其中的硫原子是螯合物的硫原子
其中R3是低级烷基，最好是2至5碳原子，而R4是低级烷基，最好是1至3个碳原子。另外一方面，R3和R4可以与该化学式中的碳原子和氧原子一起被考虑，以形成一个非芳香环，除了化学式中表示的碳原子和氧原子外，最好包含3至7个碳原子。R5代表氢或低级烷，其中烷基基团最好具有1至3个碳原子。这些较好的半硫代乙缩醛的实例包括但不限于
使用半硫代乙缩醛保护基的优点在于不需要去除该硫-保护基团的分离步骤。在放射性标记期间，在所谓金属缔合酸裂解时，该硫-保护基团从该化合物中被取代;即在酸性pH下，在有金属放射性同位素存在时该保护基团被取代，而该同位素被螯合物结合。于是简化了放射性标记程序，这对于在使用前不久在医院实验室里对该螯合物进行放射性标记是特别有益。此外，避免了碱性pH条件和与某些已知的标记方法有关的严格条件。因此，该螯合物上的碱-敏感基团经受得住放射性标记步骤而保持完整。这样一些碱性不稳定基团包括任何一个由于暴露于碱性pH中会被破坏、水解或受其它不利影响的基团。某些蛋白质结合基团，包括酯、异硫氰酸盐，马来酰亚胺和其它迈克尔受体，它们相对来说都是碱性不稳定的。于是可以制备一种放射性标记螯合物，而作为随后使螯合体与靶化合物(例如一种抗体)结合的蛋白结合基团仍保持完整无损。
作为另一种选择，可以用乙酰胺甲基硫-保护基团。这种基团由以下化学式表示
在pH约为3至6的反应混合物中，在50℃下进行放射性标记时，该乙酰胺甲基从该螯合物中被取代。使用乙酰胺甲基基团一般能改善螯合物的水溶性，这在该化合物在放射性标记之前要连接到蛋白质或其它生物靶部分时是令人希望的。蛋白质结合反应最好是含水的反应混合物，因为有机溶剂会使蛋白质变性或者损害蛋白质。
可以使用各种各样的硫保护基团，它们中间的一些在下面的实例10中要被讲到。
本发明较好的螯合物一般具有以下的化学式(Ⅱ)
其中M是放射性核素离子，可能有1个或2个氧原子与之结合，特别是如果该金属是Tc或Re时;
其它符号与前面化学式(Ⅰ)时描述的一样。
各种金属离子或络合物离子可以用作放射性核素。这些金属包括但不限于铜，例如64Cu和67Cu;锝，如99mTc;铼，如186Re和188Re;铅，如203Pb和212Pb;钯，如109Pd;铋，如212Bi和金，如198Au。金属可以以离子形式存在，例如64Cu2+和67Cu2+(铜可以以Cu+在含硫配位体上终止)或者在结合到螯合物中时以氧化了的形式存在，如99mTCO+3，186或188ReO3+。
代表本发明螯合物分子式中的虚线该分子式中表示的金属放射性核素M与硫和三个氮原子之间的四个配位共价键。
因此，该金属放射性核素在本发明螯合物中是通过比较稳定的键链合的。
与该螯合体连接的多肽或碳水化合物可以变化很宽，取决于结合到该螯合体上的放射性核素的使用性质。碳水化合物可以是诸如多糖、糖蛋白或如上所述的、包含碳水化合物部分的其它一些化合物。
多肽例如可以是配位体或受体。配位体可以包括像多肽、激素、淋巴因子、生长因子、肽或碳水化合物底物、尤其是与表面膜受体结合的化合物、该络合物可能仍然与该表面结合或成为被吞摄物。表面膜受体、抗体、酶、天然存在的受体，外源凝集素等都属受体之列。特别有意义的是免疫球蛋白状的化合物或其结合片段，例如Fab，F(ab′)2，和抗体的Fv片段和T-细胞受体。
于是，把本发明的螯合物连接到一种起着将这种放射性核素螯合物送到哺乳动物宿主或人宿主内一个所希望的靶部位作用的靶化合物(通常是前面指出的多肽或碳水化合物中的一种)上。这里所用的术语“多肽”包括多肽、蛋白质或其片段。可以修饰这些蛋白质和多肽只要保留该放射性标记了的多肽在预期的诊断和治疗应用中所必需的生物活性。例如，可以使用修饰的抗体或其片段，只要与所需抗体的结合仍然存在。利用诸如基因工程或蛋白质工程这样的技术可以产生修饰的蛋白质。
靶化合物在体内与所希望的靶部位结合，由此将该诊断或治疗用的放射性核素送到该靶部位。靶部位的一个例子是癌部位。已经鉴别出许多与各种各样类型的癌细胞相关联的抗原，还知道了对这些癌细胞-相关抗原中的一些特异的单克隆抗体，这样一些抗体就是适合于用作靶化合物的许多多肽的例子。在与癌细胞结合的单克隆抗体中，有抗-ATC，或其它白细胞介素-2受体抗体;抗250千道尔顿的人黑素瘤-相关蛋白多糖的9，2，27和NR-MI-05;抗37-40千道尔顿的全癌(Pancarcinoma)糖蛋白的NR-Lu-10;以及抗一种尚未鉴别的肿瘤相关抗原的OVB3。
螯合物可以进行放射性标记，生成相应的放射性核素金属螯合体，该螯合体然后被连接到“先形成螯合体方法”中的靶部分上。另一个制备放射性标记的靶部分的方法是“后形成螯合体方法”，在该方法中，螯合物首先被接到蛋白质或碳水化合物靶分子上。生成的结合物然后再与放射性核素反应，生成结合到靶分子上的放射性核素金属螯合体。
结合基团“Z”是为了将螯合体或螯合化合物结合于其上而会与所希望的靶化合物上的基团起反应的一个功能基团。使用时选取该结合基团将随靶化合物的性质(如靶化合物是蛋白质还是碳水化合物)而改变。
蛋白质含有各种各样的功能基团;如羧酸(COOH)或游离胺(-NH2)基团，它们可供用于与螯合体上适当的功能基团“Z”反应从而将该螯合体与该蛋白结合起来。例如，螯合体上的活性酯与蛋白质的赖氨酸残基上的游离胺基团反应形成酰胺键。另一方面，蛋白质和/或螯合体可以被衍生以便露出或连接上另外的有反应活性的功能团。这种衍生作用可以包括连接如由伊里诺斯州Rockford的Pierce化学公司可得到的许多联结剂分子中的任何一种(见Pierce公司1986-1987商品总目录313-354页)。另外，衍生作用可以涉及对蛋白质的化学处理(蛋白质可以是抗体)。在抗体或抗体片段上产生游离的硫氢基基团的方法也是已知的(见美国专利No.4，659，839)。螯合体上的马来酰亚胺结合基团与该硫氢基(硫醇)基团是可反应的。
另一方面，当靶化合物是碳水化合物时，衍生作用可能涉及对该碳水化合物的处理;例如用高碘酸盐对糖蛋白抗体的糖部分的乙二醇裂解而产生游离的醛基。该抗体上的这个游离醛基基团可以与该螯合体上的游离胺或肼结合基团反应，将该螯合体结合到抗体上(见美国专利No.4，671，958)。
酯是在与多肽靶化合物反应的较好的结合物基团之列。可以用作用“Z”表示的结合基团的酯是那些在一个含水介质中提供与多肽共价键合、酰胺键合的酯。优先用这一种或另一种有反应活性取决于具体的放射性核素、蛋白质和结合作用的条件，这在多肽化学技术领域中是知道的。发现适用的常见酯是邻-和对-硝基苯基，2-氯-4-硝基苯基，氰甲基，2-巯基吡啶基，羟苯三唑，N-羟基琥珀酰亚胺，三氯苯基，四氟苯基，硫代苯基，四氟硫代苯基，邻-硝苯基-对-磺苯基，N-羟基酞酰亚胺等。这些酯多半是由羧酸酯与活化的苯酚，特别是硝基活化苯酚，或以羟胺为基础的环形化合物反应形成。因为其它羟基化合物可以得到，所以它们在本发明中也可找到应用。可以利用像甲基亚胺酸酯这样的亚胺酸酯来得到脒键。
螯合体由像甘氨酰甘氨酰基甘氨酸这样的三肽和醋酸的S-保护活性酯合成。例如，N-羟基酞酰亚胺S-苯酰硫代乙酰甘氨酰甘氨酰基甘氨酸(S-苯酰基MAG3)。在合成本发明化合物时可以采用包括有各种各样侧链的氨基酸。
取决于该特定的金属，制备金属螯合物要采用各种条件和技术。为了制备锝螯合物，以羧酸盐，活化酯或胺形式的螯合物在有还原剂、例如亚锡离子或二亚硫酸盐存在下，在普通条件下与高锝酸盐溶液结合，由此形成以稳定盐形式的锝螯合物。可以由不同的路线形成铼螯合物。例如，利用次磷酸和浓Hol于95℃下将高铼酸盐还原成六氯化铼(Ⅳ)，生成六氯化铼。在室温下，在90%乙二胺中将六氯化铼转化成铼的二氧代二乙胺氯化物。在碱性pH条件下，在有所研究的螯合剂存在的情况下，铼的二氧代二乙胺氯化物迅迅地与N3S螯合物交换。
在用于标记大分子肽和蛋白质时，最好与所包括的结合基团生成金属络合物。这种先形成方法允许在受控条件下，在最初存在金属离子的无机络合物和该螯合物之间发生金属离子的交换。放射性金属从不稳定的无机络合物交换到已与抗体(后形成方法)结合的螯合体，造成由于该抗体或其它大分子蛋白质上的电子供体基团(氮、氧和硫原子)而引起的不同量的非特异结合的放射性。
对于先形成螯合物的方法，已螯合的羧酸可以以酯的形式存在或者按照常规方法被酸化。用这种酯的情况下，可以制备一种不稳定的络合物如Tc-99m葡萄糖酸盐，将它用于与N3S活化酯进行交换，生成适于和蛋白质结合的放射性核素络合物。另一方面，在一个含水介质中，在至少存在化学计算量、最好是过量的酯化羟基化合物的情况下，可以用水溶性碳二亚胺如EDCI对羧酸活化。可以采用适当的缓冲水溶液。可以通过加入醋酸盐将未反应的碳二亚胺转化成尿素。这种含水介质然后可以在不用进一步纯化的情况下直接用于与多肽结合。多肽(如蛋白质)最好加到含酯的水溶液介质中，其浓度适宜，pH为弱碱性，通常约大于7.5，小于约10.5，並使反应进行足够的时间，使所有的活化酯或是与多肽反应，或者基本上完全水解。通常，这个时间是小于6小时左右但大于1分钟，温度范围从约0至50℃，通常不超过40℃。根据具体的活化酯、pH、多肽的活度等选择这些具体的条件。
可以用高碘酸盐氧化糖蛋白中的碳水化合物部分，得到结合时要利用的醛基。蛋白质被缓冲在pH5.5的醋酸盐溶液中，並在室温下与高碘酸钠反应约1分钟。用甘油中止反应后，该蛋白质通过一个凝胶过滤柱被纯化。
在有弱酸存在的情况下，最好是在能提供还原性胺化作用的含有钠的氰硼氢化物的水溶液中，胺可以与二乙醛缩合。
在无金属离子存在的情况下，某些应用将螯合剂(N3S)与多肽或碳水化合物结合可能更为合适。例如，由于本发明所考虑的一些放射性核素(如99mTc)具有比较短的半衰期，所以，希望先制备与多肽或碳水化合物部分结合的螯合剂，然后在施用前不久将该与多肽或碳水化合物部分结合的螯合物与有关的放射性核素反应。例如，羧酸基团与多肽键合生成一种酰胺键，接着以弱络合的形式加入该放射性核素金属。另一方面，对于具有游离伯胺基团的螯合物，如前面讨论过的那样，可以通过伯胺与碳水化合物部分键合，接着在弱还原性条件下用高碘酸盐处理该碳水化合物部分以形成一个仲胺或叔胺键而使N3S螯合物与碳水化合物部分键合，在这一步骤之后，接着与放射性核素进行适当的反应以生成所希望的放射性标记了的碳水化合物部分。
如前所述，最初，该金属离子可以非特异地和特异地与多肽或碳水化合物结合。然而，N3S配位体中心应当形成具有比非特异部位更高稳定性的螯合物，所以金属离子在平衡条件下会迁移到N3S螯合基团上。未与N3S螯合基团结合的那些金属离子可以在温和的条件下用螯合剂如EDTA或非离子洗涤剂洗脱掉。
金属离子可以很方便地以弱螯合离子的形式或在有弱螯合基团，像葡萄糖酸盐这样的糖醛酸盐或酒合酸盐，存在的情况下被加入。
所讨论的螯合物要对哺乳动物宿主施用，一般通过静脉、动脉、腹膜、肿瘤内等注射施用，取决于需要该放射性核素的具体部位。一般，对宿主注入0.1至2毫升，取决于宿主的大小，大约每公斤宿主约0.001至50微居里。对于人宿主，剂量通常是约10-50毫居 70公斤宿主，更常用的剂量约为25-35毫居里/70公斤宿主。对于更低等的哺乳动物，如小鼠，对生物分布研究用1-50微居里，而对成像研究要使用高达500微居里或更高。在施用这种放射性核素之后，取决于其目的，可以通过检测从该放射性核素特异结合的部位(一个或多个)的放射性辐射以各种方式处理宿主进行探测或治疗。
以下提供的实例用于示例说明而不是对发明的限制。
例ⅠS-被保护的巯基乙酰基甘氨酰甘氨酰基甘氨酸(RMAG3)的合成RSCH2COOSucc+H-Gly-Gly-Gly-OH→RMAG3将一份S-被保护的硫代乙醇酸琥珀酰亚胺酯(1当量)加入到含有三乙胺(每毫摩尔gly-gly-gly-OH10毫升溶剂和3当量NEt3)的乙腈-水(80∶20)中的甘氨酰甘氨酰基甘氨酸溶液中。该溶液在室温下搅拌2小时，在真空中除去溶剂，並将残余物溶于5-10毫升水中，用盐酸酸化(PH＝3-4)。在(a)和(b)情况下，经放置结晶出产品。
在(c)情况下，得不到沉淀。蒸发该水溶液至干燥，通过用CH3CN∶H2O(95∶5)作为提洗剂的硅胶闪色谱法分离出产品。
用不同的保护基团将该反应进行五次Ra＝C6H5CORb＝P-CootBu(C6H4)-CO-Rc＝
或其它半硫代乙缩醛保护基团
例Ⅱ制备S-苯酰基-MAG3-四氟苯基酯将0.5克(3毫摩尔)2，3，5，6-四氟苯酚和0.68克(3.3毫摩尔)N，N′-二环己基碳二亚胺加入到在150毫升无水四氟呋喃中的1.1克(3毫摩尔)S-苯酰基-MAG3悬浮液中，並在室温下搅拌72小时。
减压下除去约100毫升溶剂並过滤出沉淀的二环己基尿素。滤液蒸发至干，残余物溶于约50毫升热乙腈中，使其冷却至室温。滤出结晶固体(大部分是二环己基尿素和一些产品)，滤液被浓缩至约30毫升並在冰浴中冷却。滤出结晶固体(一些二环己基尿素)。
将滤液蒸发至约5毫升，加入无水醚沉淀出产品，得出0.21克产品，熔点172-4℃。
NMR(DMSO-db)δ3.72-3.98(m和s，b，glyCH2X2，S-CH2)，4.36(d，2，glyCH2)，7.62-8.8(m，9，3XNH，C6H5，P-CH(TFP)。
例ⅢaS-苯甲酰-MAG3-四氟苯活性酯的合成φCOSCH2-CO-Gly-Gly-Gly-OH+2，3，5，6-TFP-OH→φCOSCH2COglygly-gly-O-2，3，5，6-TFP在MAG3衍生物的无水THF(20ml/mmol)溶液中，加入等摩尔量的四氟苯和二环己基碳化二亚胺，在室温下搅拌混和物过夜。过滤除去二环己基脲。将滤液溶于CH2CL2，用水洗此溶液后加无水Na2SO4脱水，然后蒸发该溶液至原来体积的三分之一，过滤分离除去沉淀固体，对所得滤液进行蒸发，最后可得到55-60%产率的活性酯(Ra，Rb)。
对于Rb，将已制得的活性酯加入无水三氟乙酸(5mlTFA/1mmol)，並搅拌以除去t-丁基基团。于真空中除去三氟乙酸。再加冷水(5-10ml)，在真空中过滤并且干燥，得到产品。
对于Rc，其反应是在CH3CN∶H2O(4∶1;20ml/mmol)混合液中进行的。在Rc(mmol)的CH3CN∶H2O溶液中加3mmol的2′，3′，5′，6′-四氟苯和3mmol的1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳化二亚胺的盐酸盐，並搅拌8小时。除去溶剂並且用乙酸乙酯进行萃取。有机层用MgSO4干燥，蒸发得到一种油。与乙醚研制得到四氟苯酯。用相似反应可得到Rc的N-羟基琥珀酰亚胺酯。
例ⅢbTHP-S-CH2COGly-Gly-Gly-OSuCC.→THP-S-CH2-CO-Gly-Gly-Gly-CONHNH2在上述得到的琥珀酰亚胺酯的THF溶液(5ml/mmol)中，加入0.2ml肼並搅拌3-4小时，然后除去溶剂，並由硅胶层析法分离制得产物。THP代表一个四氢吡喃基硫保护基团。
用相似的一套反应，制备其它MAG3衍生物，制备中硫以半硫缩醛的形式被保护(Rd，Rc)。
例Ⅲc
(Ⅰ)在tBoc-Gly-Gly-Gly-NH2的THF溶液(25ml/mmol)中加入9ml的BH3THF，将此液进行回流过夜(12-15小时)，再加入2ml乙醇並蒸发至干，整个过程再重复三次，将最终得到的油干燥制成粉末。
(Ⅱ)在保护胺的无水THF溶液(5ml/mmol)中，加入等摩尔S-苯甲酰硫羟基乙醇酸琥珀亚胺酯搅动3-4小时。其TLC显现了一个主要成分及少量杂质。主要成分用硅胶柱层析(EtOAC∶CH3OH∶NEt3)进行纯化。
(Ⅲ)1mmol的上述已保护的化合物用5ml无水三氟乙酸混合并搅拌，搅拌2-3小时后蒸发除去三氟乙酸，得到的油状产物用乙醇溶解再蒸至干，重复该过程两次，最后加入含有5-6当量氯化氢的乙醇，蒸发至干，获得一种粘滞性的油状物，它在乙醚加入后可被固化。
例ⅣTc-99mMAG3-IgG抗体的制备将25μgS-苯甲酰MAG3溶解于0.10ml的1.0M，pH为12.0的碳酸盐缓冲液，然后再加入约1ml其中含有75毫居里Tc-99m的高锝酸盐溶液和1.0ml新配制的连二亚硫酸钠液(10mg/ml)。将混合物加热至100°±4℃保持三分钟，再于冰浴中冷却5分钟。用ITLC法测得获得90-95%Tc-99m MAG3(CH3CN作展开溶剂时，95%的产物在原点;当10%乙酸铵CH3OH(1∶1)作溶剂时99%在溶剂前沿);阴离子交换HPLC(Beckman AX，10微米，0.01M Na2SO4/0.01M Na3PO4，pH7.0)时滞留体积为5.4ml，反相HPLC(BeckmanODS，5微米2%CH3CN/0.01MNa3PO4，pH7.0)滞留体积为7.6ml。
然后对羧酸盐形式的Tc-99M配合物进行酯化取0.2ml的1NHcl，0.30ml的pH6.0的0.2M磷酸盐缓冲液，10mg2，3，5，6-四氟苯(TFP)(溶于0.10ml90%CH3CN液)，12.5mg的EDC(溶于0.1ml的90%CH3CN液)，在室温下混合，使反应进行小时。用ITLC测得Tc-99mMAG3-TFP酯有60-75%的放射性(溶剂为CH3CN时，60-75%在溶剂前沿);阴离子交换HPLC法(Beckman AX，10微米0.01MNa2SO4/0.01MNa3PO4pH7.0)时的滞留体积为3.0ml;反相HPLC法(BeckmanODS，5微米34%CH3CN/0.01MNa3PO4pH7.0)时的滞留体积为6.2ml。利用C18Baker柱将制剂进行纯化，把反应混合物装入柱中，用水洗两次，再用2.0ml的10%C2H5OH/0.01MNa3PO4pH7.0溶液洗8次，产物用CH3CN洗脱，放射化学物质50-60%在Tc-99mMAG3-TFP中，除去CH3CN，这种Tc-99mMAG3-TFP可用于准备结合。
通过在含有Tc-99m活性余留物中加入1.2mg/ml的，在0.2M磷酸盐缓冲液(pH9.5)中的抗黑素瘤IgG溶液进行该配合物活性酯的结合作用。30分钟后，40-50%的放射性被结合到抗体上。通过PD-10凝胶过滤柱得到纯度为97%的Tc-99MMAG3-抗体。
例ⅤMAGGG的制备(琥珀亚胺苯甲酰缩硫醇乙酰甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸)在50ml园底烧瓶中，将0.37g(1mmole)的苯甲酰缩硫醇乙酰甘氨酰甘氨酰甘氨酸和0.126克(1.1mmole)N-羟基琥珀亚胺溶解于约25ml的四氢呋喃液中，在冰浴中冷却至5-10℃，在此溶液中再加0.23克(1.1mmole)的N，N′-二环己基碳化二亚胺。升高该溶液温度至室温，搅拌48小时，用TLC跟踪整个反应过程。过滤除去沉淀物，滤液在真空中蒸发至干。残留物重新溶于50-60ml的二氯甲烷，过滤该溶液並于真空下蒸发至干。将所得到的残留物在加温下溶于5-6ml的乙醇，结晶3-4小时。通过过滤回收琥珀亚胺-MAGGG结晶。
例Ⅵ抗体螯合物-结合物的制备于5.0ml的DMF中溶解4.25mg四氟苯基MAGGG以制备四氟苯基MAGGG原液，取该原液0.060ml加入到0.54ml的含有浓度为5.5mg/ml在0.10M磷酸盐、0.15MNacl、pH7.0的溶液中的单克隆抗体中。配位体与抗体之比为50∶1。室温下搅动3小时以后，该反应混合物由通过PD-10凝胶过滤柱进行纯化。
将全部反应混合物在事先用PBS平衡的SephadexG-25柱上纯化(1.5Cm×50Cm塑料柱，用PBS洗脱)，以1.2ml为单位收集组份，並合并在280nm处吸光率大于0.1的组份，合并后的组份在4Psi下用一个具有AmiconPM10膜的Amicon过滤器浓缩到最后体积为0.5至1.0ml。
与抗体结合的螯合物量的测定可以方便地通过用0.1NNaOH从配体中除去苯甲酰基团並将得到的游离巯基基团与Ellman氏试剂反应来进行。
例Ⅶ螯合物与单克隆抗体结合物的分析螯合物与单克隆抗体结合物(实例6)样本的制备是在一试管中加入至多400μl，若需要可用无氧的水调至400μl而成的，必要时，如实例6制备的样本，可用不含氧的水稀释。在试管中再加入磷酸盐缓冲液(500μl;0.1M磷酸钠，1mMEOT，pH7.27)和100μl的0.5M盐酸羟胺(HA，用不含氧的水配制)然后在室温下放置1小时，加入20μl的5μl缓冲液和9μl的Ellman氏试剂(DTNB;5，5′-二硫二(2-硝基苯酸))溶液，5分钟后，于413nm处测定反应混合物的吸光率。
与单克隆抗体结合的螯合物的量的测室方法有两种。一种是省去与单克隆抗体结合的螯合物，如上一样制备一个空白对照，並于412nm处进行分析。可以用已发表的消光系数(Riddles，etal.，94Anal.Biochem.75(1979))应用下列公式来计算游离硫的浓度〔硫浓度〕＝〔A412(样本)-A412(空白)〕×(稀释因子)/14.150M-1另一种方法是建立一个标准曲线。在该缓冲液中配制0.25mM高纯度半胱氨酸的溶液，用于进行螯合物结合分析(此标准溶液应当是当天新配制的)，半胱氨酸的一系列标准稀释液如上所说的那样与HA和DTNB反应，构成半胱氨酸的摩尔数对412nm处的吸光率的标准曲线。因而，与抗体结合的螯合物的量可直接从该标准曲线上查得。
例Ⅷ螯合物-结合抗体的放射性标记a.酒石酸锝-99m的制备在含有0.10mg氯化锡和75mg酒石酸钠的0.6ml的小指管酒石酸锡溶液中，加入0.50mlTc-99M高锝酸钠(2-4mg)。此溶液在室温下平衡三分钟，必要时可用TLC测定产生酒石酸锝99M反应的程度。
取几小滴上面制备的放射性溶液点在两条GelmanITLC-SG条带的起点(标记的)。其中一条立即用盐水溶液展开，另一条带则在氮气中待起点干燥后，用甲乙酮(MEK)展开。当溶剂前沿抵达条带的75%长度处，从展开液中取出条带，並对溶剂前沿进行标记，从起点和前沿的中间裁开。再对这四片中的每一片的放射性用标准记数技术进行测定。因为高锝酸钠的Rf值在MEK系统中为1，在盐水系统中为0;而酒石酸锝的Rf值在MEK系统中为0，在盐水系统中为1;二氧化锝的Rf值在两种系统中均为0;所以酒石酸锝99-m的分数率可用下列等式算出分数率(Tc-99m酒石酸盐)＝1.00- (C1MEK)/(COMEK+C1MEK) + (C0盐水)/(C0盐水＋C1盐水)其中C1和C0分别代表在这两种溶剂下前沿和起点处的放射性计数，MEK和盐水两下标代表展开液。当酒石酸锝-99m的分数率大于或等于0.85时即可使用。
b.酒石酸Tc-99m和结合抗体螯合物的反应例6中的抗体MAGGG结合体(在0.40ml，pH8.0的PBS缓冲液中含0.10mg)和酒石酸Tc-99m(0.10ml，0.5-2mg)在50℃下反应60分钟。这时80%的Tc-99m放射性与抗体结合。在对非蛋白结合的放射性校正后，以黑素瘤肿瘤细胞结合的放射性来测定的该制剂的免疫活性为84%。
例Ⅸ在动物体中进行对照研究以确定99mTc-MAG3-NRML-05Fab和99mTc-N2S2-NRML-05对标记小鼠肿瘤的相对能力。这些命名与和抗体Fab片段连接的不同螯合试剂有关。NRML-05是黑色素瘤的一种特异抗体的实验室命名，MAG3是前面实例中描述的N3S螯合试剂，N2S2是具有2个硫、2个氮作为电子受体原子的一个对照螯合试剂，它的代表化合物为4，5-二(2′-硫乙胺)-戊酸。
在以4只小鼠为实验组的小鼠体内注射相同剂量的Tc标记试剂，采用了黑色素变异的无毛小鼠，注射后20小时，处死小鼠取样用γ计数计计数。下列两表列出了所得到的实验数据，表1表示试验组织的剂量/克的百分数，表2表示肿瘤/组织的比例(将肿瘤的剂量/克百分比除以各个组织类型的剂量/克的百分比)。
表1％剂量／克MAG标记 N2S2标记组织平均值标准偏差平数值标准偏差血液0.16 0.010.20 0.03尾0.44 0.110.96 0.89肿瘤2.28 0.523.02 1.12皮肤0.09 0.010.08 0.03肌肉0.04 0.000.35 0.52骨0.12 0.031.02 1.57肺0.78 0.26 10.23 5.49肝0.26 0.010.88 0.34脾0.26 0.070.57 0.31胃0.23 0.140.76 0.51颈0.05 0.010.12 0.05肾1.42 0.210.43 0.07肠0.50 0.330.38 0.17
表2肿瘤／组织比值组织 MAG3标记 N2S2标记血液14.0914.86尾5.344.57肿瘤1.001.00皮肤25.63 64.93肌肉54.89 39.68骨21.03 15.73肺3.470.47肝8.713.66脾9.9831.96胃11.84 31.73颈42.54 29.86肾1.646.94肠5.619.35表中数据表明在肿瘤组织中较好的中靶，不用MAG3作为螯合剂时，肿瘤组织与其他试验组织相比较，它的剂量／克的百分比量高。对照研究时利用N2S2作为螯合试剂时，肺组织中的剂量／克要大于肿瘤中的，过去的和这次研究后的其他研究表明本例中肺组织中的浓度不寻常地高。但其他组织中的浓度值与以前研究结果相符。TC－99m－MAG3螯合结合物的浓度要较N2S2连接的结合物小。另外，胃中低MAG3物质含量是高稳定性的标志，因为作为高锝酸盐的Tc-99m的丢失可以看成是胃组织中较高的放射性。
例Ⅹ还合成了本发明的其他几个N3S螯合物，这些化合物的化学结构如图1所示，这里图1A至1I相当于命名为A至I的9个化合物，每一化合物都有S保护基团(PG)和三个用R，R′和R″表示的替代物(对每一化合物来说应以表格的水平顺序阅读)。
图1中S保护基团的缩写(PG)代表下列基团，其中表示的硫原子是螯合物的硫原子
当螯合物包含一个甲醚基S保护基(如化合物I那样)，螯合物中紧邻S原子的碳(α碳原子)最好使它与取代物-CH2-COOH相连。
TFP表示2、3、5、6-四氟苯基基团。当利用先形成螯合的方法时，该2、3、5、6-四氟苯基酯蛋白结合物基团最好在-(CH3)2-隔离物末端，以便在放射性标记反应过程中，使得TFP的水解(或取代)减少到最小程度。化合物A和B，它们的TFP与一个更短的隔离物连接，更适用于后形成的螯合方法，因为TFP已经和蛋白质反应，並且在这种后形成方法中进行放射性标记时不再经受水解作用。
最佳的螯合物是取代基为-COOH的那些螯合物。
利用上述过程对这些化合物进行放射性标记。放射性标记反应的条件(如pH和温度)随诸如上述化合物中特定S保护基团取代的易难而变化。
利用本发明的化合物，可以很快地与蛋白、碳水化合物和糖蛋白结合，给出用于体内的放射性核素取代了的试剂。能以纯的形式和高的得率提供这些试剂。用于体内时，放射性金属元素以与蛋白质、碳水化合物或糖蛋白螯合物的形式保持稳定。因此，可以很安全地把一种放射性核素送到需要的部位，在那里只有很低量的放射性物质非特异地被对准和结合。
尽管以上为了清楚地理解，以图解和实例的方式比较详细地描述发明，但是该技术领域中的技术人员显然可以作出某些改变和修正，因此，说明部份和实例不应当理解成是对本发明范围的限制，发明的范围以权利要求为准。
权利要求
1.一种结构式如下的化合物
其中T代表H或一个硫保护基团；每个X独立地代表H2或O；每个R独立地代表从H、除半胱氨酸以外的氨基酸的非烷基侧链、烷基、双链二烷基和-(CH)n-Z等基团中选择的一个基团。Z代表-COOH；一个结合基团或一个靶化合物n是1与4之间的任一整数，以及R′代表H2、-(CH2)n-Z或者由一个或多个极基团取代的烷基基团；其中该化合物至少包含一个-(CH2)n-Z的取代基。
2.根据权利要求1的化合物，其中它的硫保护基团是选自于烷基、芳基、酰基、硫代酰基或者是包含1至10个碳原子的有机硫基团。
3.根据权利要求1的化合物，其特征在于它的硫保护基团在与要保护的硫原子一起考虑时是一个半硫缩醛基团。
4.根据权利要求3的化合物，其特征在于该半硫缩醛基团是选自于四氢呋喃基团、二甲基四氢呋喃基团、四氢吡喃基团、二甲基四氢吡喃基团、乙醚基和甲醚基团。
5.根据权利要求1的化合物，其特征在于该硫保护基团是选自于
6.一种具有如下化学结构式的化合物和它的水溶性盐
其中M是一个放射性核素，每个X独立地代表H2或O;每个R独立地代表选自于H、除半胱氨酸以外的一个氨基酸的非烷基侧链、烷基、双链二烷基和-(CH2)n-Z等基团中选出的一个取代基。Z代表-COOH、一个结合基团或一个靶化合物;n代表1与4之间的任何一个整数;以及R′代表H2、-(CH2)n-Z或者具有一个或多个极性基团取代的烷基基团。其中该化合物中至少有一个-(CH2)n-Z取代基团。
7.根据权利要求6的化合物，其特征在于M是选自于99mTc;186Re;67Cu;64Cu;203Pb;212Pb;212Bi和109Pd的一个放射性核素。
8.根据权利要求1或6的化合物，其特征在于至少一个取代基是O。
9.根据权利要求8的化合物，其特征在于所有(三个)取代基X全为O。
10.根据权利要求1或6的化合物，其特征在于它的结合基团是选自于活性酯、亚胺酯、伯胺或仲胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺和其他迈克尔(Michael)受体基团。
11.根据权利要求10的化合物，其特征在于该结合基团是一个2、3、5、6-四氟苯基活性酯基团。
12.根据权利要求1或6的化合物，其特征在于该靶化合物是选自于蛋白质、糖蛋白、碳水化合物或它们的片段。
13.根据权利要求12的化合物，其特征在于该靶化合物是一个单克隆抗体或它的片段。
14.根据权利要求13的化合物，其特征在于该单克隆抗体或其片段是癌细胞特异抗体。
15.根据权利要求1或6的化合物，其特征在于所说化合物至少含有一个-COOH的取代基。
16.根据权利要求1或6的化合物，其特征在于所说化合物包含一个Z是结合基团或靶化合物的取代基-(CH2)n-Z。
17.图1A至1I的化合物。
18.一种对糖蛋白进行放射性核素标记的方法，其特征在于将糖蛋白与一种甘醇裂解剂反应，以裂解能产生二醛或更高的多醛的至少一种糖来提供一种多醛产物;将所说的多醛产物与一种Z为氨、肼或氨基的权利要求1的化合物反应，以产生一种具有螯合物结合于其上的糖蛋白;和将所说的具有螯合物结合于其上的糖蛋白在适合于形成糖蛋白-放射性核素螯合物结合物的条件下与一种放射性核素反应。
19.一种对糖蛋白进行放射性核素标记的方法，其特征在于将所说的糖蛋白与一种甘醇裂解剂反应以裂解能产生二醛或更高多醛的至少一种糖来提供一种多醛产物;将所说的多醛产物与一种Z为氨、肼或胺盐的权利要求6的化合物反应产生一个放射性核素螯合物结合的糖蛋白。
20.一种对多肽进行放射性核素标记的方法，其特征在于将此多肽和一种权利要求6的化合物反应，此化合物有一个与该多肽反应的结合基团，由此使该化合物与该多肽结合。
21.一种对多肽进行放射性核素标记的方法，其特征在于将该多肽与一种权利要求1的化合物反应，该化合物有一个与该多肽反应的结合基团，因此使该化合物能与该多肽结合。与多肽结合了的该化合物和一种放射性核素金属反应，形成一种螯合物-多肽结合物。
22.根据权利要求18、19、20和21的方法，其特征在于该糖蛋白或多肽是一种单克隆抗体或其片段。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于该单克隆抗体或其片段是癌细胞特异的。
24.根据权利要求22的方法，其特征在于该放射性核素是选自于99mTc，186Re，188Re，212Pb，212Bi，198Au和109Pb。
25.根据权利要求6的化合物，其特征在于当用作为活性治疗物质时，该化合物的Z是一个能与靶细胞结合的靶化合物，而M是有治疗效果的放射性核素。
26.根据权利要求6的化合物，其特征在于当用作为活性诊断物质时，该化合物的Z是一个能与靶细胞结合的靶化合物，而M是有诊断效果的放射性核素。
27.根据权利要求25或26的方法，其特征在于该靶细胞是癌细胞，而该靶化合物是一个能与癌细胞结合的单克隆抗体或其片段。
全文摘要
提供了用于结合到多肽及碳水化合物上的螯合放射性核素组合物，结果产生的结合物可用于诊断和治疗。
文档编号C07K16/00GK1034545SQ8810277
公开日1989年8月9日 申请日期1988年3月25日 优先权日1987年3月26日
发明者艾伦R·弗里贝格, 瑟阿卡·卡斯阿, 琼卢斯·范德赫伦, 阿纳斯夫·斯纳维安 申请人:内奥斯公司