专利名称：治疗白血病的的制作方法
技术领域：
本发明属于制药工程领域，特别涉及一种利用GM-CSF与其细胞表面受体的结合作为白血病靶向治疗的131I标记GM-CSF蛋白质的制备方法。
背景技术：
白血病是危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤。急性髓性系白血病(acute myeloid leukemia，AML)起病急，病死率高，虽然近十几年干细胞移植在AML的应用使一半的患者获得长期生存，但仍有约50％的患者因为难治或复发而死亡。
白血病细胞多药耐药(MDR)和微量残留白血病是难治和复发的主要原因。目前采用结合化疗药物或生物毒素的单克隆抗体以增强肿瘤杀伤力、克服白血病细胞多药耐药和消灭微量残留白血病的作用，已开始临床治疗试验。但是这些方法有以下局限性①每一个肿瘤细胞都需表达靶抗原。②溶酶体的内化作用使药物降解。③许多肿瘤细胞具有多药耐药性。④体内产生抗毒素抗体。⑤剂量限制性毛细血管渗漏综合征。因此单克隆抗体有制作复杂，仅对单一的表面抗原起靶向作用、抗原抗体结合的解离常数较大的缺点。
在肿瘤的治疗中放射免疫治疗即用单克隆抗体结合放射性同位素进行治疗(radioimmunotherapy，RIT)具有两点优势①核衰变释放的射线能杀灭邻近的肿瘤细胞无论它是否表达靶抗原。②克服了肿瘤细胞的多药耐药性(参见文南Frankel AE，Sievers EL，Scheinberg DA.Cell surface receptor-targetedtherapy of acute myeloid leukemia.Cancer Biother Radiopharm，2000，15(5)459-476.)。与传统的分次、短时、高剂量外照射放疗相比，RIT为持续性较低剂量内放射治疗，核素半衰期不同持续数天到数周，避免肿瘤细胞在放疗间隔期DNA的修复。虽然RIT比传统放疗剂量小，但是白血病和淋巴瘤细胞与实体瘤细胞不同它们受放射率的影响很小。且还存在一种放射率反向效应，即受到持续低剂量辐射的细胞被阻止在细胞周期G2期，G2/M期的细胞对射线最敏感，因此细胞聚集在该阶段也就增加了放射性细胞毒作用。此外，RIT对肿瘤细胞具有相对的特异性杀伤作用，减少了对正常组织的损害(参见文献Oliver W.Press.Physics for practitionersthe use of radiolabeled monoclonalantibodies in B-cell Non-Hodgkin’s lymphoma.Semin Hematol，2000，37(suppl 7)2-8.)目前国外用于AML放射免疫治疗(RIT)的制剂是131I标记的抗CD33和抗CD45鼠型单克隆抗体，对难治性和复发性的AML有较好反应。对微小残留白血病及骨髓移植前的预处理也是一种有效的治疗手段。但单抗价高，且在人体内鼠型抗体致人抗鼠抗体产生，不能多次重复使用，因此，疗效受到限制。
技术内容本发明的目的，是提供一种治疗白血病的131I标记GM-CSF蛋白质的制备方法。所述蛋白质采用GM-CSF作为新的载体携带131I治疗AML，保证RIT制剂的组织特异性杀伤力和抗AML耐药性，避免在人体内产生人抗鼠抗体，可以多次重复使用，并且成本低。
采用本发明方法可以制备治疗白血病的放射性同位素标记GM-CSF蛋白质。其方法是采用同位素交换法或化学合成法或生物合成法，将治疗髓性白血病的放射性同位素标记粒单系集落刺激因子GM-CSF蛋白质，放射性同位素包括67Cu、125I、131I、90Y、186Re、188Re、212Bi、211At。
优选地，采用化学合成法中的氯胺-T法或乳过氧化物酶法(LPO)或固相氧化法或联胺标记法将131I标记GM-CSF蛋白质。
更优选地，采用氯胺-T法合成131I-GM-CSF。具体方法见实施例1。制备131I-GM-CSF的放射性同位素I131的放射性活度为1mCi/L-400mCi/L，GM-CSF的反应浓度为0.1g/L-10g/L。
本发明的最佳技术方案是制备131I-GM-CSF的GM-CSF剂量为100-300μg(0.5g/L-0.9g/L)，131I放射性活度为4-8mCi(10mCi/L-40mCi/L)。在所述条件下，反应总体积较小，标记率较高，可以获得高放射性浓度的产品，并且有效保证了131I-GMCSF的免疫活性。
本发明采用急性髓性白血病细胞株HL60，该细胞缺失p53，高表达bcl-2和bcl-xl，结合位点为322个/细胞。
本发明的有益效果是1.利用GM-CSF与其细胞表面受体的结合作为白血病靶向治疗的一种新的载体，在急性髓性细胞白血病的治疗中，通过GM-CSF与含有该受体的白血病细胞结合把放射性131I带入相应的位置，利用I131所放射的β粒子的细胞毒性作用杀灭瘤细胞。这种细胞毒性作用可贯穿多层细胞，对靶细胞和邻近细胞都能发挥效应，属于低剂量、近距离放射性同位素的治疗(内放射治疗)。
采用131I标记的GM-CSF治疗急性早幼粒细胞白血病小鼠模型，测定131I-GM-CSF在体内的分布、对白血病的靶向治疗效果、毒副作用的产生。
2.131I是一种易于标记、且标记后对抗体生物学特性影响较小的放射性核素，它的物理半衰期为8.04天，有效半衰期为7.6天，合适的半衰期使得131I有足够的时间浓聚于病灶和保证有相当数量的放射性核素在病灶部位衰变，而且它发射的射线有较高的传能线密度(LET)且在生物组织内射程较短，因此使用I131可获得更高的疗效并能减少毒副作用。
3.131I-GM-CSF下调p53、上调bc1-2和bcl-xl，通过线粒体途径诱导HL60细胞凋亡，具有抗髓性白血病细胞的作用。
4.由于GM-CSF能促进细胞进入增殖周期，增加细胞对射线的敏感性，因此131I-GMCSF诱导凋亡的作用大于131I。
5.由于131I-GM-CSF能明显降低HL60细胞bcl-2和bcl-xl的表达，其可以通过抑制凋亡克服MDR(细胞多药耐药)，131I-GM-CSF与化疗药物有协同作用。
6.动物试验131I-GM-CSF在骨髓和瘤肿块的放射性浓度最高，在其他正常组织中放射性浓度低，说明131I-GM-CSF具有组织特异性杀伤作用。
7.白血病动物模型试验结果131I-GM-CSF治疗组生存期较对照组明显延长，从动物试验水平进一步说明131I-GM-CSF具有抗髓性白血病细胞的作用。
图1为HL-60细胞凋亡相关基因的表达；图2为急性早幼粒细胞白血病小鼠生存曲线；图3为131I-GM-CSF在急性早幼粒细胞白血病小鼠中生物学分布(用药后30分钟)图4为131I-GM-CSF在急性早幼粒细胞白血病小鼠中生物学分布(用药后4小时)具体实施方式
为了进一步说明用131I标记GM-CSF蛋白质的制备方法，参照下列实施例说明，这些实施例是为了进一步进行解释，而不以任何方式限制本发明。
本实施例是I131标记GM-CSF蛋白质的制备方法，并且采用该蛋白质凋亡HL60细胞的动物实验和结果。
材料
1.131I由重医附一院核医学科提供，GM-CSF(健白，由北京北医联合医药有限公司提供)。
氯胺-T、交联葡聚糖G-50购自北京邦定生物医学公司。
胎牛血清购自杭州四季青工程有限公司。
牛血清白蛋白购自北京晶美生物技术有限公司。
2.细胞培养HL-60人髓系白血病细胞株，重庆市儿童医院临床免疫室常规传代培养.该细胞在RPMI-1640培养基(内含10-20％灭活胎牛血清.青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，谷酰胺1Mm)，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下进行悬浮培养。
3.实验动物SCID小鼠，雌性，4-5周龄，体重13-17g(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，饲养于清洁级实验动物房。
实施例1131I-GMCSF的制备、纯化和鉴定1.制备采用氯胺-T法。
①按GM-CSF量分五大组，每大组根据Na131I的剂量分若干小组，共17组。每一组设4个平行对照。
②加入Chloramine T 10μg/5μl(0.05mmol/LPBS液临时配置)，在T为22℃下孵育2min。
③加入Na2S2O580μg/40μl，反应3min。
2纯化柱层析法交联葡聚糖sephadex G-50(用0.05M的pH7.4的磷酸缓冲液平衡，1.0cm×35cm)流速0.5ml/min(每滴10-15秒)。用3％KI溶液70μg/35μl和牛血清白蛋白(1000μg/100μl)于加样前冲柱，以稀释放射性碘，减少吸附。收集洗脱液1ml/瓶(1ml约7滴)。分别在活度计上测量。测定结果有3个峰，其中10ml以内出现第一个峰是131I-GM-CSF产品峰。
3鉴定用薄板层析法。
①标记率取反应液少许点在层析板上，在甲醇/氯仿＝7/5系统中层析，晾干后，分段测量。
标记率(％)＝(0-放射峰)cpm之和/总cpm之和×100％。
②放化纯度取少许第一峰收集液点层析板上，在上述层析系统中上层析，分段测量。
放化纯度(％)＝(0-放射峰)cpm之和/总cpm之和×100％。
③放射性浓度(Bq/ml)取1ml产品，测其放射性活度，4测定免疫活性细胞免疫结合率测定法制备含不同数量(5-10)×106/0.1ml]的HL-60细胞(至相对过量)加入定量的131I-GM-CSF，37℃孵育1h，测总计数cpm，以0.5％的牛血清白蛋白洗涤液离心洗涤2次，10min/次，弃上清液，测沉淀细胞的cpm，免疫结合率＝沉淀细胞cpm/总计数cpm×100％。以1/结合百分率为纵坐标，1/受体浓度为横坐标，获得一直线；延长直线与纵坐标的交点的倒数乘以100，该数值即为标记的131I-GM-CSF结合活性。
结论采用氯胺-T法进行GM-CSF的I131标记，放射性同位素I131的放射性活度为1mCi/L-400mCi/L，GM-CSF的反应浓度为0.1g/L-10g/L。最佳制备131I-GM-CSF的GM-CSF剂量为100-300μg(0.5g/L-0.9g/L)，131I放射性活度为4-8mCi(10mCi/L-40mCi/L)。纸层析法测定其标记率为55-75％，放化纯度为94-96％，细胞免疫结合率测定法测定免疫活性为83-94％。在所述条件下，反应总体积较小，标记率较高，可以获得高放射性浓度的产品，并且有效保证了131I-GMCSF的免疫活性。见表1。
表1
实施例2体外细胞试验(1)细胞毒性检测调节HL60细胞浓度为0.5×105。实验分为三组①131I-GMCSF组每孔先加入7.5ng饱和量的GM-CSF(含3×1010个GM-CSF分子，是每孔细胞总结合位点的104倍)，然后加入131I溶液，使其放射性浓度分别为18.5×1010、18.5×109、18.5×108、18.5×107、18.5×106Bq/L。
②131I组按以上浓度只加131I溶液。
③空白对照组加入同体积生理盐水。每组每放射性浓度设4个平行孔。培养72小时，用MTT法测细胞活性。记录各孔的A490nm值，按每组每一浓度的均值，求细胞存活率(处理组A490nm值/对照组A490nm值×100％)。
结果见表2。131I和131I-GMCSF对HL-60细胞作用24小时的IC50分别为5.1×108Bq/L和7.9×108Bq/L。所有处理组的A490与空白对照组A490比较P＜0.05，差异有显著性。当放射性浓度≥18.5×108Bq/L时两处理组细胞存活率无统计学差异；当放射性浓度＜18.5×108Bq/L时131I-GMCSF组细胞存活率低于131I组，差异有显著性。
表2.131I-GMCSF 对HL-60细胞毒作用Tab 1.The cytotoxic effect of131I-GMCSF on HL60 cell
(2)细胞凋亡检测 TUNEL(脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术)调节细胞密度1×109个/L，放置于24孔板，每孔1ml。仍分3组，131I-GMCSF组和131I组各设2个放射性浓度，分别为37×109Bq/L和37×107Bq/L，空白对照组加入等体积的生理盐水，每组每浓度设平行对照3孔。培养24小时后弃培养液收集细胞，制片干燥，4％多聚甲醛固定，以Triton-100穿透细胞，加TUNEL混合反应物(Roche公司)37℃孵育60分钟，加入POD转换剂，DAB显色后400倍光镜下计数500个细胞，计算具有明显凋亡特征(细胞缩小、核染色质聚集、核碎裂、细胞膜完整等)的细胞百分比。
结果见表3。从表2的结果表明，高浓度的131I-GMCSF与131I都可以促进HL-60细胞凋亡，与空白对照组有显著性差异(P＜0.05)；且131I-GMCSF组比131I组细胞凋亡率高，差异有显著性(P＜0.05)。低浓度的两处理组与空白对照组凋亡率无差异(P＞0.05)。
表3.131I-GMCSF对HL-60细胞凋亡的影响Tab 2。The apoptosis rate of HL60 induced by131I-GMCSF
TUNEL实验证实131I-GMCSF能够引起HL60细胞明显的凋亡，并且凋亡率高于单纯的131I(p＜0.05)。其原因是GMCSF能促进G0期细胞进入增殖期，增加了细胞对周期依赖性药物敏感性。
(3)细胞周期检测细胞周期的检测分3组，131I-GM-CSF组和131I组放射性浓度为37×108Bq/L，空白对照组加入等体积的生理盐水，每组设平行对照3孔。培养24小时后弃培养液收集细胞，70％冷乙醇2ml固定细胞，PI染色，以Coulter流式细胞仪检测。
131I-GM-CSF组(66.4±5.12％)和131I组(37.91±1.20％)G2/M期细胞较空白对照组(10.35±0.37％)显著增多(P＜0.05)。对G2/M的阻滞作用131I-GMCSF大于131I(P＜0.05)。两处理组的G0/G1细胞与对照组比明显减少(P＜0.05)；但两处理组之间无显著性差异。
(4)免疫组织化学实验检测p53、bel-2、bcl-xl和bax分组及处理方法同上，培养24小时后收集细胞制片干燥，80％丙酮固定，3％过氧化氢甲醇液作用10分钟，经正常羊血清孵育15分钟后，加入p53、bcl-2、bcl-xl和bax单抗(SANTACRUZ公司)于湿盒中4℃过夜，加生物素化二抗作用15分钟，加辣根酶标记链霉亲和素作用15分钟，以DAB显色。细胞核(p53)或细胞浆(bax、bcl-2)被染成黄棕色为阳性细胞。
131I-GM-CSF组(93.67±2.65％)和131I组(86.20±1.13％)细胞P53的表达较空白对照组(7.23±1.50％显著增加(P＜0.005)；两处理组之间差异有显著性(P＜0.05)。bcl-2在131I-GMCSF组(81.80±3.57％)和131I组(94.00±1.18％)细胞的表达低于空白对照组(100±0.00％)，差异有显著性；两处理组间也有显著性差异(P＜0.05)。bax在三组(131I-GMCS组86.43±2.22％；131I组85.37±1.53％；空白对照组85.67±2.211％)的表达无显著性差异(P＞0.05)。bcl-xl在131I-GMCSF组(78.87±6.67％)的表达低于131I组(92.57±1.69％)和空白对照组(98.00±1.00％)，差异有显著性差异；后两组的表达没有统计学上的差异。见图1。
实施例3.测定131I-GMCSF蛋白质的生物学分布和疗效(1)建立急性早幼粒细胞白血病小鼠模型4-5周龄小鼠经尾静脉输入6×106-1×107个HL-60细胞。接种后每周取血一次。小鼠断尾，用毛细血管微量采血管采血60μl，平均分别加入白细胞稀释液0.39ml、红细胞稀释液0.39ml、血小板稀释液4ml中，取10μl滴入血球计数板常规计数白细胞、红细胞、血小板，同时制备血涂片Giemsa染色，行白细胞分类计数并查找白血病细胞(HL-60细胞)，同时观察SCID小鼠精神、食欲、体重等一般情况。流式细胞分析仪检测骨髓细胞CD33阳性率，取发病小鼠骨髓行染色体检查。
①SCID小鼠发病情况接种HL-60约21-28天左右小鼠均有不同程度发病，小鼠出现精神状态差、活动减少、行动迟缓、食欲下降，体重不增或下降。其中5只小鼠腹部发现实体瘤，腹部膨隆、皮肤红肿、局部有溃破；1只小鼠右眼睑红肿，眼球突出，眼周及右侧面颊肿胀。
②血象从接种后14天起外周血白细胞逐步上升，21-35天可上升至最高约(9.92±1.13)×109/L，中性粒细胞比例无明显变化，维持在(75±2.18)％，21-28天左右起小鼠外周血中发现急性早幼粒白血病细胞(HL-60细胞)，在有核细胞中所占比例为3-11％；接种后21天左右外周血红细胞逐步下降，于治疗前降至(8.81±0.55)×1012/L；外周血小板于接种后21天开始下降，于治疗前降至(142±23.56)×109/L。
③流式细胞分析发病小鼠骨髓细胞中CD33抗原阳性率3.12％-8.85％。④染色体检查发病小鼠骨髓细胞染色体中存在有人HL-60细胞染色体。
(2)生物学分布实验前3d开始给予小鼠质量分数1％碘化钾液封闭甲状腺。发病小鼠24只，按白细胞数量配对分两组。处理组予131I-GM-CSF，对照组予131I和GM-CSF混合液。两组给予的131I剂量均为0.06mCi，均采用尾静脉注射给药。分别于注入后5min、30min、2、4、12及24h各处死2只小鼠，取血、瘤体、肝、脾、肾、脑、肺、股骨和胫腓骨(右侧)并称重。冲洗骨髓腔，冲洗前后长骨样本质量差值为骨髓质量。用甲状腺吸碘功能仪MN-6110(科大创新股份有限公司中佳分公司)测定131I的γ放射性计数，计算各时间点组织摄取率(D％/g)。
结果脾脏和骨髓对131I-GM-CSF摄取于注入后30分钟达峰值，其D％/g均明显高于对照组(t＝3.59、3.9，p＜0.05、0.01)，滞留24h后高于其他脏器。参见图3。此外，对眼部和臀部的实体瘤小鼠分别于注入131I-GM-CSF后2h和4h测定其131I的γ放射性计数，实体瘤的10-1D％/g为520.32、391.46，高于同时间点除外骨髓的其他脏器。参见图4。
(3)疗效检测动物分组及处理治疗前72小时，在小鼠饮用水中加入1％碘化钾以封闭甲状腺对放射性碘的摄取。60只SCID小鼠随机分成3个治疗组及3个对照组，每组10只，接种后28天开始尾静脉给药。治疗组分为小剂量治疗组(I组)、中等剂量治疗组(II组)、大剂量治疗组(III组)，分别经静脉注射0.025mci、0.06mci、0.1mci的I131-GM-CSF(GM-CSF用量约为60μg左右)，每3天一次，共2次。对照组分为I131处理组(IV组)及I131、GM-CSF处理组(V组)，分别经尾静脉注射0.06mci I131及0.06mciI131和GM-CSF60μg，给药方式同前，空白对照组(VI组)未作任何处理。
观察指标治疗后每周取血一次，计数白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)及白细胞分类计数、HL-60细胞，同时观察小鼠生存天数。
①血象结果见表1、2、3、41)HL-60细胞治疗后2周，治疗组外周血HL-60细胞下降，II、III组较I组下降更显著(P＜0.01)，II、III组在治疗后6周可降至最低，部分小鼠外周血HL-60可完全消失。治疗组与对照组存在明显差异(P＜0.01)；治疗后2-3周，HL-60下降较对照组及治疗前下降均更明显(P＜0.01)，治疗组与对照组存在明显差异(P＜0.01)。
2)WBC治疗后1周I、II、III组WBC下降，第2周II、III组降至最低，6组两两比较除I组与IV、V组，II组与III组差异无显著性以外(P＞0.05)，余均有显著差异。治疗前后差异明显(P＜0.01)；3)RBC治疗后4周治疗组红细胞较对照组及治疗前有所增加，尤以II组为著(p＜0.01)。I、II、III组红细胞差别没有统计学意义(p＝0.1285)4)PLT治疗后第2周起，II、III组PLT明显增高，与I组差异显著(P＜0.01)，第3周起II组与III组PLT存在显著差异(P＜0.01)。
在小、中、高剂量治疗组两两比较中可以看到，小剂量治疗组虽可以使外周血WBC及白血病细胞减少，但持续时间较短，甚至最后的生存期与对照组之间也无明显差异，而中、高剂量组对WBC及HL-60细胞的控制则明显优于小剂量组，各指标在这两组之间并无统计学上的差异，表明在0.06mci剂量范围之间疗效存在剂量依赖关系，继续增大剂量则引起骨髓的过度抑制，导致小鼠生存时间或同一时间点小鼠的存活率较中剂量组也有所降低。
治疗组与对照之间在血小板变化上也存在明显不同，治疗后1周左右治疗组的外周血血小板即上升，在中高剂量组尤为显著，上升幅度可为治疗前的数倍，对照组血小板也有所升高但幅度不大且短暂，这与人类白血病治疗中出现的情况相吻合，即血小板升高可以是治疗有效的早期表现，因此131I-GM-CSF对急性早幼粒性白血病是一种有效的治疗方法。
②生存时间最长生存时间63天，最短10天，其中治疗组平均生存时间分别为33.5天、52.5生天、47天。对照组平均生存时间为18.5天、17.7天、14天。对6个处理组进行Log-Rank比较，p＜0.01，处理因素的不同对生存时间有显著性影响。治疗组与对照组两两比较均有明显差异(P＜0.01)，I组与II、III组有差异(P＜0.01)，3个对照组两两比较无差异。参见图2。
结论HL60细胞经131I-GMCSF处理后，细胞发生G2/M期阻滞，细胞凋亡率明显增加，其作用优于单纯的131I。动物实验进一步证实了131I-GMCSF对髓性白血病具有较高的组织特异性杀瘤作用。
表2小鼠接种及治疗前后白细胞变化(×109)
表3小鼠接种及治疗前后红细胞变化(×1012)
表4小鼠治疗后外周血血小板变化(×109)
表5小鼠治疗后HL-60细胞变化(％)
权利要求
一种治疗白血病的131I标记GM-CSF蛋白质的制备方法，其特征在于采用化学合成法将治疗髓性白血病的放射性同位素标记粒单系集落刺激因子，放射性同位素为131I，粒单系集落刺激因子为GM-CSF，制备131I-GM-CSF时GM-CSF的反应浓度为0.1g/L-10g/L，131I放射性活度为1mCi/L-400mCi/L。
全文摘要
本发明属于制药工程领域，是一种治疗白血病的
文档编号C07K1/00GK1751743SQ20051005726
公开日2006年3月29日 申请日期2005年9月12日 优先权日2005年9月12日
发明者娄世峰, 周慷, 陈林, 邓扬嘉, 徐诣之, 张萍, 陈姝, 邓建川, 罗云 申请人:重庆医科大学附属第二医院