用于诊断结直肠癌的蛋白质标记和所述标记作为所述癌症类型治疗的药物靶点的用途的制作方法

专利名称：用于诊断结直肠癌的蛋白质标记和所述标记作为所述癌症类型治疗的药物靶点的用途的制作方法
用于诊断结直肠癌的蛋白质标记和 所述标记作为所述癌症类型治疗的药物靶点的用途发明背景本发明总的涉及与结直肠癌相关表达的蛋白质，鉴定该蛋白质的 方法，筛选药物的方法，该药物影响该蛋白质的表达或活性，以及用 于治疗和预防结直肠癌的治疗性化合物。发明背景结直肠癌(CRC)是发达国家如US中的第三大癌症类型，并且是 第二大癌症相关死亡的原因。对于男性和女性，已经估算产生CRC的 终身风险接近6%。对于筛选，CRC是合适的疾病，因为它是具有长无 症状潜伏期的常见恶性疾病，并且如果在早期发现，具有高存活率。 因为累积的证据强烈地表明癌症由所谓的腺瘤引起，通过检测腺瘤和 导致除去它们的筛选程序可获得CRC的预防。结直肠癌(CRC)是用来表示在结肠或直肠中产生的癌症的术语。 结肠和直肠是消化系统的一部分，消化系统也称为胃肠道或GI系统。 消化系统处理食物用于能量和除去固体废物的主要部分(粪便物或粪 便)。食物在咀嚼和吞咽后，通过食道到达胃。食物在胃中得到部分 分解，然后送往小肠，也称为小的肠道。词语"小"指的是小肠的直 径，其比大肠的直径窄。实际上，小肠是消化系统的最长部分。小肠 继续分解食物并吸收大部分的营养素。小肠在右下腹连接结肠。结肠 分成三个部分上升的(右侧)，横向的和下降的(左侧)。结肠tehn 在左下腹连接直肠。结肠的功能是从食物继续吸收水和矿物质并作为 废物的存储地方。该过程后留下的废物是粪便，并进入直肠中，直肠 是消化系统的最后一个部分。粪便从直肠通过肛门排出体外。结肠和直肠的壁具有几层组织。CRC在最内层开始并可以通过一些或全部其他层生长。知道一些关于这些层的知识是重要的，因为结 直肠癌的阶段(扩散程度)很大程度上取决于入侵这些层有多深。结肠癌和直肠癌总地称为结直肠癌(CRC)，具有许多共同的特征，并在 此一起讨论。在大多数人中，结直肠癌在数年的时间段内緩慢发展。 在真实的癌症产生之前，组织或肿瘤的生长通常作为非癌息肉开始， 其最终变成癌症。息肉在结肠或直肠的内层上产生。特定种类的息肉， 称为腺瘤息肉或腺瘤，具有成为癌的潜能。存在其他类型的息肉，称 为增生性和炎性息肉。通常不认为炎性息肉和增生性息肉是癌症前的。 但是一些医生认为一些增生性息肉可能是癌症前的病变或是人更可能 产生腺瘤息肉和癌症的信号，特别是如果它们生长于右侧或升结肠中。 另一种癌症前情况称为发育异常。这通常在患病如溃疡性结肠炎的人 群中看到，溃疡性结肠炎引起结肠的慢性炎症。一旦在息肉内形成癌症，其最终开始生长至结肠或直肠的壁中。 一旦它们在壁中，癌细胞可以生长至血管或淋巴管中。淋巴管是薄的 微小通道，带走已经移出血管外的胞外流体和白细胞。它们首先排进 附近的淋巴结中，淋巴结是帮助对抗感染的豆形结构。当癌细胞扩散 至血管中时，它们可以移动至身体的远侧部分。将这种扩散过程称为 转移。超过95%的结直肠癌是腺癌。这些是排列于结肠和直肠壁内层 的腺细胞的癌症。在结肠和直肠中也可能产生其他不太常见类型的肿 瘤，如 类癌一这些癌症产生于肠的专门化激素产生细胞。
胃肠间质瘤一这些肿瘤产生于结肠壁中称为"Cajal的间质细 胞"的专门化细胞。 一些是良性的(非癌的)；另一些是恶性的(癌 症的)。尽管这些癌症可以在胃肠道的任何地方发现，但它们通常在 结肠中。 淋巴腺瘤一这些是免疫系统细胞的癌症，通常在淋巴结中产生 的，但也可以开始于结肠和直肠或其他器官中。通常在三种特定模式之一中观察到CRC:散发的，遗传的或家族的。散发疾病，没有家族或遗传的诱因，占据人群中结直肠癌的大约70%。散发结肠癌或CRC在大于50岁的人中是常见的，可能是膳食和 环境因素以及自然老化的结果。低于10%的患者具有结肠癌的遗传诱因。遗传的症状包括其中结 肠息肉是疾病主要表现的那些和其中它们不是的那些。将息肉病症状 细分成家族性腺瘤息肉病和错构性息肉病症状。非息肉病的主要症状 包括遗传的非息肉病结直肠癌(HNPCC) ( Lynch综合症I)和癌症家 族综合症(Lynch综合症II)。尽管不常见，这些综合症提供了对所 有结直肠癌类型生物学的了解。第三和最少了解的CRC产生模式被认为是家族性结肠癌。在受影 响的家族中，结肠癌产生频率太高以致不能认为是散发的结肠癌，而 且不是与遗传的症状相一致的模式。高达25%的所有结肠癌病例可以 属于该类别。认为散发结肠癌的分子基础遵循致癌作用的多步骤模型。该模型 描述了遗传情况的累积，每个情况给受影响的结肠细胞给予选择性的 生长优势。这些改变最终导致不受控制的细胞生长，增殖和无性肺瘤 产生。这些体细胞突变的累积效果是散发CRC的诱因。从该模型得到 四个主要的结论1) 结直肠癌由致癌基因的突变激活和肺瘤抑制基因的灭活引起；2) 恶性转化需要细胞的至少四个或五个基因的体细胞突变。3) 多遗传突变的累积而不是突变的次序决定了肿瘤的生物行为， 尽管APC基因的突变通常发生在过程的早期，而p53抑制基因的突变 通常发生在过程的晚期；和4) 结肠癌的致癌过程的特征适用于其他实体肿瘤，如乳癌和胰腺癌。最常遗传的结肠癌综合症是家族性腺瘤息肉病和HNPCC。这些综 合症中的每一种是特定种系突变的结果。家族性腺瘤息肉病中，种系 突变通常是APC基因， 一种肺瘤抑制基因。在HNPCC中，醒R基因中的一种产生了突变，最常见的是hMLHl或hMSH2。错构性息肉综合症中的几种最近已经与种系突变相关联。 一个实例是Peutz-Jeghers综合症，其由STK11肿瘤抑制基因的异常 引起。各种CRC的筛选程序是容易获得的，包括粪便隐血测试(F0BT)， 软乙状结肠镜，钡灌肠和结肠镜检查。正积极地研究较新的方法，如 仿真结肠镜检查和粪便DNA测试。检测CRC的最佳方法仍然有待研发。与其他筛选形态中的一些相比较时，钡灌肠(双重造影钡灌肠； DCBE)存在潜在的益处，如较低的成本(与结肠镜检查相比较)和较 低的工作时间损失。 一些指向DCBE提高的能力，来更好地将损伤定位 于结肠的特定解剖片段，这是使用结肠镜检查难以做到的。这对于需 要外科手术的那些是重要的情况。最后，DCBE是安全的测试，具有 25, 000之一的预计穿孔率，以及由25, 000之一穿孔引起的死亡率。 在DCBE不利方面应该考虑这些潜在的益处，与结肠镜检查相比较时， 所述不利包括缺乏治疗能力，较低的敏感性和患者不舒适性较高。在1988年首次将结肠镜讨论为CRC的平均风险筛选测试，并且从 那时起成为广泛授让的筛选方法，甚至是一些协会如美国胃肠研究院 (American College of Gastroenterology)的优选测试。腺瘤转化成CRC过程中发生的分子情况理解的进展导致产生了检 测粪便中流出的DNA中突变的测试。粪便中的DNA由细菌和结肠粘膜 的正常脱落物以及息肉和CRC产生。使用分子生物技术扩增粪便中少 量的肺瘤DNA.在近些年来，几组研究人员已经成功地从CRC患者分 离出粪便中的DNA。基于来自可获得研究的集合结果，粪便DNA测试 对于6W的入侵性CRC具有整体敏感性，95%的特异性，对于20%晚期 腺瘤具有敏感性。目前不存在关于总人群中粪便DM测试的公开数据。 粪便DNA测试是具有吸引力的，因为它是肿瘤特异性的，非入侵性的， 不需要肠制剂或饮食限制，并具有使用单个粪便收集物检测整个结肠 长度瘤形成的潜在能力。目前的局限性包括缺乏来自筛选人群的数据， 需要测试精确性来测定需要多少或哪个标记，以及测试的费用。如所述的，目前粪便DNA测试的成本高并远超过FOBT的。限制测试的肿瘤标记数量可以降低成本，但是这可能是在降低灵敏度的代价下。最近，美国癌症协会(ACS)的结直肠癌咨询小组评论了几种可用 的筛选方法(例如，结肠镜检查，粪便隐血测试(F0BT)，免疫化学 粪便测试，胶嚢内镜等)并推断唯一推荐的CRC筛选技术是免疫化学 粪便测试，但是对于可以检测早期肿瘤的改进方法存在强烈的需要 (Levin B等，CA Cancer J Clin. 2003. 53 (1):44-55 )。认识到对于可以用于大规模频繁(一年一次或一年两次)筛选的 改进诊断的需要，几个小组正在对鉴定组织样品或血液中的诊断标记 进行着工作。例如，最近已经将胸腺素oc鉴定为用于结肠癌活体检查细胞的潜 在生物标记，使用新的色谦技术结合SELDI质谦。用于预后的另一个 潜在标记是硫氧还蛋白-1 ，因为它在组织样品中的表达水平与结肠癌 的阶段非常相关。已经表明血清胸苷磷酸酶为预测可切除CRC患者中 发生造血性转移的新标记。单克隆抗体也已经用于检测CD105蛋白(血 管生成的调节剂)及其配体TGF P的血浆水平并且提出CRC患者的预 后。然而，目前所用测试的共同特征是其相对低的预测价值，使得它 们需要补充其他程序，如生物活体检查和/或内窥镜检查。考虑到现有 筛选方法的缺陷，可以推断为了非常高置信度的诊断需要多个蛋白标 记。治疗CRC的最常用方法是通过外科手术除去肺瘤，或通过化疗和 放疗。氟尿嘧啶(5-FU)和甲酰四氢叶酸(LV)常用于化疗中，并且 最近已经引入多种新的试剂，包括伊立替康(CPT-ll)和奥沙利铂， 这些导致治疗的提高。新的时代正在开始，其中治疗离开化疗，并用 新的特定靶向剂来替代.最近使用这些试剂(如抗血管生成药物，酪 氨酸激酶抑制剂和表皮生长因子阻断剂)完成的或正在进行的临床测 试已经提供了鼓舞人心的初步数据。如从以下引用的现有技术中可看出的一样，已知蛋白质组分析能 够鉴定各种蛋白质及其与CRC的相关性。这些蛋白质，就它们自身而言，可以得到上调或下调，是患者中CRC的指示剂。这些蛋白质中一 组的调节模式也可以作为CRC的指示剂。这些蛋白质可以用作治疗CRC 或治疗自身的目标。W005015224公开了诊断结直肠癌的方法，包括步骤a)提供从 个体获得的液体样品，b)在适于所述结合剂和RLA-O之间的复合物形 成的条件下，将所述的样品接触60S酸性核糖体蛋白P0 (RLA-0)的 特定结合剂，和c)使(b)中形成的复合物含量与结直肠癌的诊断相 关联。WO04090550公开了使用几个蛋白质标记诊断人样品中结直肠癌 的方法，标记包括60S酸性核糖体蛋白PO (RLA-O)。这些标记的不 同表达模式表示个体患有结直肠癌和/或预示结直肠癌患者的疾病阶 段。已经通过蛋白质芯片技术使用质傳测试来自健康个体和诊断为结 直肠癌个体的各种组织和血清样品鉴定了标记。W004079368公开了鉴定癌细胞中表达的蛋白质(包括HSP90)的 特定蛋白质组方法。已经通过结直肠肿瘤样品中表达的上调来鉴定每 个标记。使用借此从供体组织的冷冻部分回收蛋白质的方法，可以得 出选定组的正常结肠组织和选自患者的晚期结直肠癌的蛋白质特征， 基于最佳肿瘤组织学和细胞性从新鲜冷冻组织库选择供体组织。W000055633公开了鉴定结直肠癌中涉及的特定表达特征和核酸， 以及该表达特征和核酸在结直肠癌诊断和预后中的用途。通过蛋白质 组技术，如质谱测试，2D凝胶电泳测试等来实现鉴定。该参考文献进 一步公开了鉴定和使用调节CRC的候选试剂和/或目标的方法。W002078636公开了用于检测和/或治疗CRC的方法和组合物.更 具体地，该参考文献公开了结直肠癌相关的蛋白质和编码该蛋白质的 核酸，这表示用于结直肠癌检测的细胞标记和用于结直肠癌治疗的分 子目标。W004021010公开了诊断结肠和胃癌的方法，通过测量患有这些疾 病患者组织中的各种表达水平。通过以下方法来测定表达水平，如 (a)检测结肠癌相关基因的mRNA， ( b )检测由结肠癌相关基因编码的蛋白质，和(C)检测由结肠癌相关基因编码的蛋白质的生物活性，W004071267公开了烟酏胺N-曱基转移酶(N醒T )在结直肠癌诊断 中的用途。此外，公开了从得自个体的粪便样品诊断结直肠癌的方法， 通过测量该样品中的N醒T。 NNMT的测量，例如，可以用于结直肠癌的 早期检测或诊断中。WO05015234公开了蛋白质SAHH ( S-腺苷同型半胱氨酸水解酶)在 结直肠癌诊断中的用途。此外，特别涉及从得自个体的液体样品诊断 结直肠癌的方法，通过测量该样品中的SAHH, SAHH的测量，例如，可 以用于结直肠癌的早期检测或诊断中。之前，已经证明了蛋白质组研究在鉴定这样的标记中的成功是有 限的。W09842736和WO9843091公开了通过临床样品的蛋白质组分析 鉴定的特定差异表达的蛋白质标记，按照通过除去基质细胞和结締组 织污染物来富集肺瘤上皮细胞的费力方法。然而，最近，鉴定的鼠正 常和肺瘤结肠组织的蛋白质组比较在蛋白质表达模式中没有统计学显 著差异(Core等，Electrophoresis 21: 1772—81， 2000 )。还公开了以下的研究，关于各种癌组织中的一些标记KuniyasuH. ChiharaY. Kondo H. 0hmori H. Ukai R ( 2003 ) Amphoterin induction in prostatic stromal cells by androgen deprivation is associated with metastatic prostate cancer (前歹'J腺基质细胞中 通过雄激素耗尽的amphoterin诱导与转移性前列腺癌相关)，Oncol Rep. 10 ( 6 ) : 1863-8; CappelloF. BellafioreM， Palma A， David S. MarcianoV， Bartolotta T. Sciume C， Modica G. Farina F. Zummo G. Bucchieri F. ( 2003 )60KDa chaperonin( HSP60 )is over—expressed during colorectal carcinogenesis (60KDa伴侣素(HSP60)在结直 肠癌形成过程中是超表达的,European Journal of Histochemistry 47 ( 2 ) : 105-10; Yamamoto S. Tomita Y. Hoshida Y. Sakon M， Kameyama M, Imaoka S. Sekimoto M, Nakamori S. Monden M， Aozasa K. ( 2004 )Expression of valosin-containing protein in colorectal carcinomas as a predictor for disease recurrence and prognosis(结直肠癌中含缬酪肽蛋白的表达作为疾病复发和预后的预测剂)，Clinical Cancer Research 10: 651—7。如从以上现有技术的讨论可以看出，存在发现诊断肿瘤标记的各 种可能性。最简单直接方法之一是使用患病的组织本身，但是如本发 明所证明的，现有技术不能鉴定重要的CRC标记蛋白质，如下所讨论 的。因此，本发明的主要目的是鉴定现有技术中没有公开过的CRC相 关的标记蛋白。因此，本发明描述了表1中所列目标蛋白作为CRC标记的用途， 并提供了用于该应用以及用于CRC治疗中的方法。发明概述本发明人已经证明了来自正常和肿瘤组织的结肠活检组织检查的 代谢标记结合之后的2维凝胶电泳和质谦是鉴定CRC发展中涉及的蛋 白质的有力工具。本发明人已经通过检测生物样品中表1的蛋白质的存在鉴定了与 CRC相关的蛋白质。通常，生物样品选自尿液，粪便，血液，CSF，唾 液，淋巴液和組织。合适地，组织是结肠和/或直肠的上皮组织。从诊 断的观点可以明显看出，尿液，粪便，唾液或血液是优选的。应用于这样的生物材料的蛋白质组分析表明了对蛋白质水平引起 CRC发展的机理以及鉴定CRC诊断或治疗中相关蛋白质的了解。与以上引用的现有技术相反，本发明人使用了新鲜的组织样品， 即，没有冷冻或另外储存的样品，储存将导致一些独特的蛋白质标记 的降解。尽快切除組织样品，将它们立即转移至细胞培养基中，并用 放射性同位素(例如，16["C]-氨基酸或["S]-甲硫氨酸的混合物)代 谢标记，这确保可以通过现有技术的蛋白质组分析的陈述来检测标记 间隔过程中表达的任何蛋白质，即使间隔是几分钟。如以下详细讨论的，本发明的目标蛋白是有特定用途的，特别是 作为癌症(特别是CRC)的诊断和预后标记。，它们可以用于辅助诊断疾病进展中 早期癌症的存在和预测临床上成功结果的可能性，特别是关于特定的 患者肺瘤对化疗剂或化疗剂组合物的敏感性或抗性。此外，这些目标 可以用于结直肠癌或其他癌的治疗干预，例如，特异性地靶向肺瘤细 胞并降低健康组织中的毒性，和提供了评价候选治疗化合物调节来自 结肠，直肠和其他组织的癌细胞的生物活性的能力的方法。因此，本发明涉及癌症的诊断和治疗，特别涉及基于特定肿瘤抗 原的超表达来区分胂瘤细胞和正常细胞，和通过利用肺瘤细胞内这些 抗原的不同表达来瞄准治疗。本发明特别涉及与正常细胞内的表达相比较肿瘤细胞内超表达的 一个或多个蛋白质("标记蛋白"或"目标蛋白")的检测(参见表 1)。本发明进一步提供了瞄准癌症治疗性治疗的方法，通过指引治疗对抗这些超表达的蛋白质。实现这种瞄准的方法可以包括，但不限于 (i )治疗药物与特异性识别目标蛋白分子结构的目标蛋白或适配子部 分的结合，(ii)使用蛋白质，多肽，表达栽体或DNA疫苗构建体， 通过免疫将宿主免疫系统暴露于目标蛋白或其片段，以便指引宿主免 疫系统对抗其中目标蛋白超表达的肿瘤细胞，(iii)通过小分子配体 调节目标蛋白的生物活性，(iv)利用目标蛋白的生物活性来激活药 物前体，(v)通过如反义基因剪接，使用小干扰RNA分子，或瞄准编 码目标蛋白基因中的调控序列或结合这些序列的调节蛋白这样的方法 来调节细胞中目标蛋白的表达，(vi)目标蛋白与细胞的其他成分， 例如，与小分子配体或免疫球蛋白的物理相互作用的特定调节，以便 发挥治疗益处。因此，本发明基于目标蛋白的不同表达提供了各种新 的方法，用于癌症，包括CRC的诊断，预后和治疗。考虑以下的发明 详述时，本发明的这些和其他多个方面和优势是本领域技术人员显而 易见的。白选自下组 表l中限定的蛋白质；和 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%序列同源性。所述修饰可包括，但不限于N，或C， 截断，剪接变体，酰化，乙酰化，腺苷酰化，ADP-核糖基化碘化，生 物素化，氨基甲酰化，羧甲基化，脱酰胺化，酯化，法呢基化，甲酰 化，谷胱甘肽化，糖基化，幾基化，脂化，甲基化，肉豆蔻酰化，氣 化，棕榈酰化，磷酰化，异戊二烯化，唾液酸化(sialation)，硬脂 酰化，磺化，硫化，维生素C-和K-独立修饰，和硒蛋白。然而，由于现有技术公开了 HSP90和60S酸性核糖体蛋白用于检 测CRC的用途，本发明的主题是基于选自该组的至少再一种标记蛋白 的存在的测定，当所述至少一种标记蛋白是HSP90和/或60S酸性核糖 体蛋白时，该再一种标记蛋白不是HSP90或60S酸性核糖体蛋白。这 还适用于来自表1组A的蛋白质，已知其在CRC组织中得到上/下调。发明详述第一个方面中，本发明涉及通过2D-凝胶电泳和质谱鉴定的蛋白质。再一方面涉及表l的蛋白质作为CRC标记或指示剂的用途，以及 涉及蛋白质的用途，该蛋白质的存在，不存在或流行程度(preva 1 ence ) 之前与CRC不相关。认为蛋白质表达和蛋白质表达模式的改变对于诊 断，预后和治疗应用和目标是重要的标记。本发明的蛋白质可以a)涉及能量转导和氧化还原电位和糖酵解 酶；b)涉及噤呤/噢咬合成，DNA/RNA合成，RNA加工，氨基酸代谢和 蛋白质合成；c)作为伴侣蛋白；d)涉及分化，凋亡，调控和信号转 导；e)涉及细胞防御；f)涉及细胞结构；g)涉及激素/神经递质代 谢；h)或具有其他功能。本发明的第一个方面涉及标记蛋白。标记蛋白选自下组a)表l 的蛋白质；和b)具有与a)中蛋白质至少80%序列同源性的蛋白质。此外，标记蛋白可以选自a)相对于对照在来自所述生物样品的 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶上以显著较低或显著较高含量存在的 一种或多 种蛋白质；b)来自所述生物样品的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶上存在而 对照的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶上不存在的一种或多种蛋白质；和c) 来自所述生物样品的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶上不存在而对照的蛋白 质的聚丙烯酰胺凝胶上存在的一种或多种蛋白质。术语"对照"的意思对于蛋白质组学领域中的技术人员是显而易 见的。优选，对照是来于蛋白质凝胶的斑点(具有相同的位置)的I0D% 值，蛋白质来自源自没有倾向于或患有CRC的人的样品或来自患有CRC 患者的结肠的健康片段。术语"标记蛋白"意思是包括上述蛋白质， 以及来自用于CRC实验的其他哺乳动物物种的相似蛋白质。蛋白质的 人形式是特别令人感兴趣的。例如，提出人蛋白的大鼠形式可以用作 大鼠实验模型中CRC的标记。因此，术语"标记蛋白"包括表l中鉴 定的人蛋白的哺乳动物形式。本发明的另一个方面涉及诊断或测定哺乳动物例如人CRC倾向性 的方法，该方法包括测定所述哺乳动物的生物样品中至少一种标记蛋 白的存在，不存在或表达水平。生物样品选自尿液，粪便，血液，唾 液，淋巴液和组织，新鲜的血液，粪便，尿液，唾液或结肠上皮组织 是优选的。目前优选的方法包括建立至少一种标记蛋白的提高表达(上调的 标记蛋白)，标记蛋白选自下组:a)表l中限定的，并标记为上调的 蛋白质；和b)是a)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得具有 a)中蛋白质的至少80%序列同源性，当然本发明还涉及建立至少一种 下调标记蛋白的降低表达的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及测定人CRC倾向性的方法，该 方法包括a)测定源自人的生物样品中的至少一种标记蛋白的提高表 达，所迷标记蛋白选自下组i)表1中限定的上调蛋白质，或ii) 是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得具有i)中蛋白质的 至少80%序列同源性，b)测定人的生物样品中至少一种标记蛋白的降低表达，所述标记蛋白选自下组i)表1中限定的下调蛋白质，或 ii)是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得具有i)中蛋白 质的至少80%序列同源性，或c) a)和b)中确定的组合。因此，蛋白质是上调或下调的确定可用作CRC易感性的有用指示 剂。上调和下调的模式也可以用作指示剂。也就是说建立了多于一种 蛋白质的表达水平，并且将一组蛋白质的表达模式用作指示剂。在合适的实施方案中，至少一种标记蛋白选自相对于对照在来自 所述生物样品的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶上以显著較 腺或显著较高含量 存在的一种或多种蛋白质，来自所述生物样品的蛋白质的聚丙烯酰胺 凝胶上存在而对照的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶上不存在的一种或多种 蛋白质，来自所述生物样品的蛋白质的聚丙烯酰胺上不存在而对照的 蛋白质的聚丙烯酰胺上存在的一种或多种蛋白质。在另一个实施方案中，本发明涉及治疗哺乳动物例如人CRC的方 法，或预防或延迟CRC发作的方法，包括改变至少一个标记蛋白的表 达。该方法优选包括将可以改变表达朝一个或多个蛋白质的控制 (control)退回的化合物给药于人，蛋白质选自a)表l中限定的 蛋白质；和b)是表1蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得具有 表l蛋白质的至少80%序列同源性；c)具有a)和/或b)中蛋白质相 同功能的蛋白质；d)编码a) , b)或c)中蛋白质的核苷酸序列；e) a) ， b)或c)蛋白质的抗体；f)能够结合a) , b)或c)蛋白质的 核酸片段；和g)能够结合a)， b)或c)蛋白质的化合物。此外，本发明涉及该化合物用于制造治疗或预防CRC药物的用途。 术语"结直肠癌"或其缩写"CRC"包括与结直肠癌相关的疾病。关于治疗CRC的方法，可以耙向单个蛋白，或可以牝向一组蛋白 用于治疗。可以改变这些被靶向蛋白的表达水平，或可以干扰蛋白质 自身，以便改变它们的活性。因此，治疗人CRC方法的一个令人感兴 趣的实施方案包括改变标记蛋白的表达。在另 一个实施方案中，本发明涉及测定试剂在CRC治疗中具有治疗效果的可能性的方法，包括测定测试模型暴露于所述试剂之前和之 后的 一种或多种标记蛋白的相对表达水平。此外，本发明涉及测定化合物在CRC治疗中的效果的方法，包括 测定一种或多种标记蛋白的蛋白表达水平。再一实施方案中，本发明涉及测定CRC治疗中所用化合物的效果 水平的方法，包括测定测试模型暴露于所述试剂之前或之后的一种或 多种标记蛋白的表达水平。此外，本发明涉及测定患病或易患病哺乳动物例如人CRC的性质 或诱因的方法，包括建立至少一种涉及模型的标记蛋白的表达水平。本发明的另 一个实施方案涉及包括编码标记蛋白的核苷酸序列的 核酸片段，或涉及与该核酸片段或其一部分或与其互补链杂交的核酸 片段，本发明还涉及上述核酸片段用于检测标记蛋白存在的用途。再一实施方案中，本发明涉及能够结合标记蛋白的抗体。这样的 抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还涉及该抗体用于检测 标记蛋白存在的用途。再一实施方案中，本发明涉及用于诊断哺乳动物例如人的CRC或 CRC遗传倾向性的测试盒，包括a)特异性结合至少一种标记蛋白的 结合工具；或者该结合工具是至少一种所述标记蛋白的抗体，能够结 合至少一种所述标记蛋白的核酸片段，或能够结合至少一种所述标记 蛋白的化合物；b)检测结合工具与至少一种标记蛋白或与至少一种核 酸片段结合的工具，如果存在结合，或者为检测结合水平的工具，和 c)用于关联的工具，关联与所述结合工具的结合，如果存在结合，或 者关联结合水平，是否表示个体哺乳动物具有显著较高的患CRC的可 能性或患CRC的遗传倾向性。在另一个实施方案中，本发明涉及测定物质效果的方法，该方法 包括使用哺乳动物，例如人，其已经使用本发明的方法建立为具有患 CRC的可能性或患CRC的遗传倾向性高的个体，该方法包括将物质给 药于个体并测定该物质的效果。本发明人预期测定患病或易于患病的人的CRC的性质或诱因的方法包括建立表l蛋白质关于模型的表达水平，该模型用来了解疾病和 潜在的治疗。在化合物的测试中，关于试剂的活性或目标的知识对于理解所述 试剂的治疗活性是有用的并有助于改进所述的治疗。本发明人的研发产生了测定化合物在CRC治疗中的效果的方法， 包括测定一种或多种标记蛋白的表达水平，并涉及测定CRC治疗中所 用化合物的表达水平或活性水平的方法，包括测定测试模型暴露于所 述试剂之前和之后的 一种或多种标记蛋白的表达水平。本发明非常重要的实施方案涉及药物组合物，其包括a)能够调 节核酸片段表达的物质，该核酸片段编码标记蛋白的至少一部分；b) 标记蛋白；c)标记蛋白的衍生物，同源物或模拟物；d)标记蛋白的 抗体；e)能够结合标记蛋白的核酸片段；和/或f)能够结合标记蛋 白的化合物。药物组合物可以用作药物，如用于治疗或预防CRC。 应当注意到预期多于一种标记的任意组合的检测将使得分析成为 CRC相关疾病的更可靠的指示。因此，包括测定两种标记组合的存在， 活性，浓度和/或表达水平的诊断或测定CRC倾向性的方法是优选的， 强烈优选三种或多种标记(例如，至少4, 5， 6或7种标记)。预期 多于一种标记蛋白的检测能提高诊断的特异性和灵敏性，因此提高诊 断测试的价值。还相似地建议了使用多于一种(例如，至少2， 3， 4， 5， 6或7 种化合物)根据本发明的化合物(例如，多于一种化合物选自根据 本发明的多肽，核酸片段或抗体)的治疗，所述组合的化合物能够影 响多于一种标记蛋白的水平，将使疾病的治疗更有效。在这点上，可 能甚至预期只使用 一种化合物的治疗将影响多于一种标记蛋白的表 达。本发明中的术语"多肽"将具有其通常的意思。即任何长度的氨 基酸链，包括全长蛋白，寡肽，短肽及其片段，其中通过共价肽鍵连 接氨基酸残基。术语"多肽"，"肽"，"氨基酸序列"和"蛋白质"可交替使用。可以通过磷酸化，曱基化，硫酸化(sulphylated)，糖基化或通 过添加任何形式的脂质或脂肪酸，泛素或任何其他侧基或通过含有其 他氨基酸或任何其他形式的修饰(其中存在200多种已知的)在化学 上或生物化学上修饰蛋白质。这些修饰发生在蛋白质的特定位点，并 且一个位点的特定修饰可以与相同蛋白质上不同位点的相同修饰具有 不同的效果。它们在细胞中是可逆的，例如它们在细胞中用于开启或 关闭酶，因此蛋白质可以以各种形式存在一每个具有用于每个蛋白质 功能的相关活性。此外，可以分裂多肽，例如，处理其N-或C-端来除 去信号肽，或者可以剪接mRNA来除去内部序列，翻译时，其将形成改 变的蛋白质。可以在蛋白质数据库如EXPASY中找到这些中许多的实 例，并且存在日益增长范围的工具来预测这些修饰及其功能(参见 http: 〃www.expasy.ch)。因为估计人类中的每个蛋白质平均被修饰 10-20次，预期在此鉴定的大部分蛋白质以这种或那种方式得到修饰。因此，每个多肽可以通过特定的氨基酸来表征并且由特定的核酸 序列来编码。将理解这样的序列包括通过重组或合成方法产生的类似 物和变体，其中这样的多肽序列已经通过置换，插入，添加或删除重组多肽中的一个或多个氨基酸残基而得到修饰，并且在此处所述的任 何生物测试中仍然是免疫原性的，置换优选为"保守的"。保守置换是本领域技术人员公知的。优 选，考虑属于相同組的氨基酸(非极性(G， A， P， I， L和V)，极性 -不带电荷的(C, S， T, M， N和Q)，极性带电荷的(D， E, K和R) 和芳香族的(H， F, W和M)。在这些组中，氨基酸可以相互置换，当 然其他置换也是可以的。每个多肽由特定的核酸序列编码。将理解这样的序列包括其类似 物和变体，其中这样的核酸序列已经通过置换，插入，添加或删除一个或多个核酸残基(包括插入一个或多个内含子(小的或大的)而得 到修饰。置换优选是密码子使用中的沉默置换，这不会导致氨基酸序 列的任何改变，但是可以引入来提高蛋白质的表达。在本文中，术语"基本上纯的多肽"意思是含有至多25%重量与 其天然相连的其他多肽物质的多肽制剂(优选更低百分比的其他多肽 物质，例如，至多20%,至多15%，至多10%,至多5%和至多1%)。 优选基本上纯的多肽是至少96%纯，即，多肽构成制剂中存在的总多 肽物质的至少96%重量，并且优选更高的百分比，如至少97%,至少 98%,至少99%,至少99. 25%,至少99. 5%和至少99. 75%。尤其优选多 肽片段是"基本上纯形式，，的，即，多肽片段基本上无任何其他与其 天然相连的蛋白质，即，无任何其他来自哺乳动物的蛋白质。这可以 通过制备本发明的多肽来实现，通过本领域技术人员已知的宿主细胞 中的重组方法，或通过固相或液相肽合成的公知方法合成多肽片段， 例如，通过Merrifield所述的方法(Merrifield， R. B. Fed. Proc. Am. Soc. Ex. Biol. 21: 412,1962和J. Am. Chem. Soc. 85:2149/1963 ) 或其改进方法，或通过从电泳凝胶中回收来制备本发明的多肽。 ——^语"蛋白质"还包括上述多肽的衍生物，类似物和模拟物。这 样的衍生物，类似物和模拟物优选与产生其的多肽具有相同的活性， 例如，相同种类的酶活性。衍生物，类似物或模拟物可以具有比亲本 多肽较低水平的活性，相同的水平，或优选，较高的活性水平。术语"至少一种"(例如，至少一种化合物或至少一种标记蛋白)包括整数1，2，3， 4，5，6，7， 8，9，10，11，12，13，14，15，16, 17， 18,19，20，21,22,23,24,25，26，27，28，29，30，31, 32， 33，34，35,36，37，38，39,40，41，42，43，44，45，46， 47， 48，49，50,51，52，53,54，55,56，57，58，59，60，61, 62， 63， 64， 65和66,应当理解可以使用单个标记蛋白，但在本 发明的方法中使用多于一种的标记蛋白可能是有利的，也就是说建立 多于一种蛋白的表达水平，并将一组蛋白的表达模式用作指示。显而 易见随着组中数目的增加，提高了鉴定的可靠性。"肽模拟物(peptidomimetic)"是模拟肽的生物活性但在化学 性质上不再是肽的分子。严格的定义是肽模拟物是不再含有任何肽 键(即，氨基酸之间的酰胺键)的分子。然而，术语肽模拟物有时候用来描述性质上不完全是肽的分子，如假肽(pseudo-peptide)，半 肽(semi-peptide)和类肽(peptoid)。不管是完全或部分非肽的， 根据本发明的肽模拟物提供了反应性化学部分的空间排列，其与肽模 拟物所基于的肽中活性基团的三维排列极其相似。作为该相似活性位 点几何排列的结果，肽模拟物对生物系统具有作用，其与肽的生物活 性相似。本发明包括肽模拟物组合物，其是模拟根据本发明的生物活 性肽的活性的类似物，即肽模拟物可用于治疗CRC相关疾病。优选本发明的肽模拟物在三维结构和生物活性上与上述所列的肽或活性位点 基本上相似。或者，模拟物可以是"反模拟物(antimimetic)"。换句话说， 适于并阻断蛋白质活性位点的分子，或结合结合位点或与其他生物分 子相互作用的位点的分子，使得干扰蛋白质的功能。目前大多数药物 是这种类型的。本发明包括能够与本发明的多肽相互作用的这种反模 拟物。使用给定肽的模拟物比肽本身具有明显的优势，因为肽通常呈现 出两个不利的特征(l)生物利用率差；和(2)作用的持续时间短。 肽模拟物给予了明显的绕过这两个主要障碍的路径，因为关注的分子 足够小，使得是口服活性的并具有长的作用持续时间。还存在与肽模 拟物相关的显著成本节约和提高的患者顺应性，因为它们与肽的非肠 道或经粘膜给药相比较，可以口服给药。此外，肽模拟物的生产比肽 便宜得多。最后，与肽相关的稳定性，储存和免疫反应性的问题在肽 模拟物中没有遇到过。因此，上述的肽可以用于研发这样的具有相似生物活性并因此具 有相似治疗功效的小化学化合物。研发肽模拟物的技术是常规的。因 此，可以通过非肽键替代肽键，使肽模拟物采用与最初的肽相似的结 构，并因此具有与最初的肽相似的生物活性。此外，也可以用其他相 似结构的化学基团替代氨基酸的化学基团来进行修饰。通过光镨学， 晶体学和/或计算机辅助分子建模测定最初肽的三级结构来辅助肽模拟物的研发。这些技术帮助研发比最初肽更高效和/或更高生物利用率和/或更稳定的新组合物(Dean(1994), BioEssays， 16: 683-687; Cohen和Shatzmiller (1993)， J.Mol. Graph. 11: 166-173; Wiley和 Rich (1993)， Med. Res. Rev. ， 13: 327-384; Moore(1994)， Trends Pharmacol. Sci. ， 15: 124-129; Hruby(1993), Biopolymers， 33: 1073-1082; Bugg等(1993)， Sci. Am. ， 269: 92-98，在此全部引入作 为参考文献)。 一旦鉴定出一种潜在的肽模拟化合物，即可将其合成(参见Finlay等(1983) ， Cell, 57: 1083-1093和Fujiwara等(1993)， Cancer Res. ， 53: 4129-4133,在此引入作为参考文献)。因此，利用上述方法，本发明提供了与上述多肽相比较，呈现出 提高的治疗活性的化合物。本发明包括通过上述方法获得的肽模拟化 合物，其具有上述肽的生物活性及相似的三维结构。本领域技术人员将清楚肽模拟物可以产自上述修饰肽的任何一种或者产自具有超过一 种上述修饰的肽。此外，将清楚除了作为治疗化合物的用途以外，本 发明的肽模拟物可以进一步用于研发更有效的非肽化合物。术语"核酸片段"和"核酸序列"等理解为任何核酸分子，包括 DNA， RNA， LNA(锁定的核酸分子)，PNA， RNA， dsRNA和RM-DNA杂 合体。还包括含有非天然产生的核苷的核酸分子。该术语包括任何长 度的核酸分子，例如，10至10000个核苷酸，这取决于用途。当核酸 分子用作如DNA治疗中的药物或用于生产根据本发明的多肽的方法中 时，优选使用编码至少部分多肽的分子，具有约IO至约IOOO个核苷 酸的长度，将该分子任选地插入栽体中。当核酸分子用作探针，引物 或用于反义治疗中时，优选使用长度为10-100个核苷酸的分子。根据 本发明，可以使用其它长度的分子，例如，具有至少12， 15， 21， 24, 27， 30, 33， 36， 39， 42， 50， 60， 70， 80， 90， 100， 200, 300， 400， 500或1000个核苷酸(或核苷酸衍生物)，或具有至多10000， 5000， 4000， 3000， 2000， 1000， 700， 500， 400， 300， 200, 100， 50， 40， 30或20个核苷酸的分子(或核苷酸衍生物)。应当理解这 些数字可以自由组合来产生各种范围。结合杂交条件使用时的术语"严谨"和本领域中的定义相同，即，在不超过核酸片段熔点(Tm)下的15-20r的温度下进行杂交，参照 Sambrook等，Molecular Cloning; A Laboratory manual (分子克隆； 实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratories, NY， 1989， pll.45 11.49。优选，条件为"高度严谨的"，即核酸片段熔点(Tm)下5-10 匸。在本发明中，优选杂交条件是严谨的。在整个说明书中，除非文 中另外要求，术语"包括"或其变形如"含有"或"包含"，将理解 为表示包括所述要素或整体或者是一组要素或整体，但不排除任何其 它要素或整体或者一组要素或整体。术语"序列同一性"(或"序列同源性")指的是两个相等长度 的氨基酸序列之间或两个相等长度的核酸序列之间同源程度的定量测 量。如果待比较的两个序列不是等长的，必须将它们以带有缺口的插 入或者在蛋白质序列末端切断的方式排列成最可能的匹配。可以按照 (Nref-Ndif)*100/Nref计算序列同一性，其中Ndif为比对时两个序 列中不同残基的总数，其中Nref为序列之一的残基数。因此，DNA 序列AGTCAGTC与序列MTCAATC之间具有75%的序列同一性(Ndif -2 和Nref-8)。将缺口计为不同的特定残基，即DNA序列AGTG C与DNA 序列AGTCAGTC之间具有75%的序列同一性(Nd f=2和Nref=8 )。或者，序列同一性可以通过BLAST程序来计算，如BLAST程序(Person W.R和D.J. Lipman ( 1988 ) PNAS USA 85: 2444-2448 ) (www, ncbi. nlm. nih, gov/BLAST/ ),或在ExPasy站点(op. sit.)获得BLAST 程序。在本发明的一方面中，可以用带有缺省参数的序列比对方法 ClustalW进行比对，如Thompson J.等，Necleic Acids Res 1994 22: 4673—4680中所述的，http: 〃www2. ebi.ac.uk/Clustalw,或者， 使用来自GCG包的版本8的GAP测定两个核酸序列之间的同源性程度， 使用用于DM的标准惩罚GAP权重5. 00，长度权重0. 300， Gribskov 和Burgess中所述的基质，Nucl. Acids Res. 14(16); 6745-6763(1986 )，使用来自GCG包(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison， Wis. 53711， USA)的版本8的GAP测定两个氨基酸序列之间的同源性程度，使用用于蛋白质的标准惩罚GAP权重 3.00，长度权重0.100， Gribskov和Burgess中所述的基质，Nucl. Acids Res. 14 (16) ; 6745-6763 ( 1986 )。序列同源性的优选最小百分比为至少70%,如至少80%，至少85%, 至少90%,至少91%,至少92%,至少93°yi，至少94%，至少95%，至少 96%，至少97%,至少98%，至少99%和至少99. 5°y4。本发明还涉及本发明的多肽或核酸用作治疗疫苗的用途，如 Lowry, D.B.等，1999， Nature 400: 269-71举例说明的文献中所述 的。在免疫测试中与本发明的多肽特异性反应的单克隆或多克隆抗 体，或所述抗体的特异性结合片段，也是本发明的一部分。可以通过本领域技术人员已知的方法生产抗体。可以在哺乳动物 中产生多克隆抗体，例如，通过一次或多次注射根据本发明的多肽， 并且如果需要，可以一次或多次注射佐剂。可以通过Kohler和 Milstein在Nature, 256: 495 ( 1975 )中首次描述的杂交瘤方法或如 美国专利No. 4， 816， 567中所述的重组DNA方法生产根据本发明的单克 隆抗体。例如，也可以使用McCafferty等在Nature, 348: 552-554 (1990)中描述的技术从噬菌体文库中分离出单克隆抗体。文献中描 述了生产抗体的方法，例如美国6, 136, 958。在诊断，治疗或测试中，可以单独使用本发明的抗体、核酸片段 和/或多肽，也可以作为组合物中的成分。这样的组合物是本领域的技 术人员已知的，并且包括其中本发明的抗体、核酸片段或多肽结合， 优选共价结合至少一种其它分子如标记(例如，放射性或荧光素)或 栽体分子的组合物。本发明进一步涉及使用上述化合物治疗性和/或预防性处理CRC 相关疾病患者的方法。本发明的方法包括步驟a)将本发明的一种或多种化合物摻入合 适的药物栽体中；和b)将掺入栽体中的治疗有效量或预防有效量的 化合物给药于患者。术语"合适的药物栽体"指的是药物领域中已知的任何栽体，用 于将化合物给药于患者，根据本发明可以使用任何合适的药物栽体， 只要没有引起相容性问题。可以通过非肠道注射，如静脉内，肌内或动脉内，来实现给患者 给药有效剂量。这些化合物也可以口服或经皮给药，或者通过本领域 技术人员已知的任何其它方法，如通过吸入器或真喷雾器。口服是目 前优选的。如在此所用的，术语"治疗有效量"指的是治疗性处理患者需要 的本发明的一种或多种化合物的含量。这样的处理适于诊断为患有CRC相关疾病的患者。相似地，术语"预防有效量"指的是预防性处 理患者需要的本发明的一种或多种化合物的含量。这样的处理适于如 下患者，例如，还没有建立CRC相关疾病的任何临床症状.在确定患 者处于产生CRC相关疾病的风险后尽快开始预防性处理将是有利的， 例如，通过具有改变水平的标记来测定CRC的倾向性。本领域的技术人员将会了解，给定化合物的剂量，给药路径和治 疗持续时间不仅依赖于化合物的类型及其在治疗该疾病中的效果，而 且还依赖于被治疗的个体，要考虑这样的因素，如患者体重，用于治 疗患者的其它治疗方法和患者的情况、临床反应和耐受力。本领域技 术人员通过评定这些和其它相关因素可以确定剂量、给药和持续时间。本发明提供了人CRC-介导蛋白，即，鉴定为CRC产生过程中涉及 或受影响的蛋白质。将CRC-介导蛋白表征为这样的蛋白，它的表达在 CRC产生过程中相对于不存在CRC产生下的表达得到了改变。本发明 从人结肠/直肠活检组织切片检查和上皮细胞蛋白的2-维凝胶数据库 鉴定了 CRC-介导蛋白，CRC-介导蛋白包括保护性CRC-介导蛋白和有害 的CRC-介导蛋白。本发明提供了通过使用2-维凝胶鉴定的人CRC-介导蛋白，2-维凝 胶能比较对照和癌上皮细胞来鉴定哪个蛋白质应答，鉴定在细胞应答 中起作用的蛋白质。连接分析可以用来限定蛋白质的功能基团及其调 节作用(例如，通过激酶磷酸化或其他翻译后修饰)。本发明提供了基本上纯化的保护性CRC-介导蛋白("保护性蛋 白")，其特征为能够保护处于产生疾病风险中的患者对抗CRC的产 生，或緩解或减轻患有CRC的患者的CRC症状。本发明的保护性蛋白 可以直接作用来保护对抗CRC，或可以通过诱导或提高第二种保护性 蛋白的合成或通过降低或抑制有害蛋白的合成来间接作用。本发明进 一步包括与人CRC-介导蛋白的全长氨基酸序列具有至少80%,优选至 少90%,更优选至少95%和最优选至少98%同一性的氨基酸序列，例如， 通过比较序列信息来测定百分比同源性或同一性，使用GAP计算机程 序，版本6. 0,从University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)可获得.GAP程序使用Needleman和Wunsch ( 1970 )的比 对方法，J. Mol. Biol. 48: 443，按照S迈ith和Waterman (1981) 修订的，Adv. Appl. Math. 2: 482。简而言之，GAP程序将相似性限 定为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列较 短的符号总数。用于GAP程序的优选缺省参数包括(l)一元比较基 质(含有对于相同的为1和对于不同的为0的值)以及Gribskov和 Burgess ( 1986 ) Nucl. Acids Res. 14: 6745的权重比较基质，如 Schwartz和Dayhoff (编辑)所述的，(1979 ) Atlas Of Protein Sequence And Structure (蛋白质序歹'和结构图集)，National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358; (2)每个缺口3. 0 的惩罚，和每个缺口中每个符号另外的0.10惩罚；和(3)对于末端 缺口没有惩罚。本发明进一步包括编码本发明CRC-介导蛋白的多核苷酸序列，包 括DNA， cDNA， PNA和RNA序列。还可以理解在此还包括编码全部或部 分CRC-介导蛋白的所有多核苷酸，只要它们编码具有CRC-介导活性的 多肽。这样的多核苷酸包括天然产生的，合成的和有意操纵的多核苷 酸。例如，这样的多核苷酸可以接受定向突变。本发明的多核苷酸序 列还包括反义序列。反义序列包括用修饰的寡核苷酸合成的序列。本 发明的多核苷酸包括作为遗传密码的结果而简并的序列。存在20个天然氨基酸，其中大部分是由多于一个的密码子指定的。因此，本发明包括所有简并核苷酸序列，只要CRC-介导多肽的氨基酸序列是由功能 上未改变的核苷酸序列编码的。有害CRC-介导蛋白("有害蛋白")的特征在于提高患者产生CRC 或提高患者产生CRC的风险。二维凝胶电泳(2-DGE )是特别有效的分离蛋白质混合物的工具(例 如，Andersen等，(1995 )Diabetes 44: 400-407; John NE等，Diabetes (2000 ); 49: 1819-29。 Christensen等，Autoimmunity. ( 2000); 32: l-15和Mose Larsen等，Diabetes. ( 2001 ) ; 50: 1056-63 )。 将细胞蛋白提取物置于凝胶上，首先通过电荷，然后通过大小分离出 单个蛋白质。结果是多如1， 000至5， 000个点的特征图，每个通常构 成单个蛋白质。通过增大凝胶大小，通过使用放射性标记方法，银染 提高灵敏度，以及将凝胶厚度降低至1.5mm和更小，来提高分辨率。 可以通过在覆盖窄pH范围(例如，1.5， lpH单位或更低)的第一维 凝胶上跑胶来获得分辨率的进一步提高。如以下实施例中所述的，可 以通过质傳来鉴定从2D凝胶回收的单个蛋白质，来获得胰蛋白酶分离 模式以及每个肽精确的分子量。然后将这些观察到的值用来在DNA和 蛋白质数据库中搜索，来测定是否存在与之前鉴定的蛋白质的匹配。 可以从已知蛋白质测定同一性或从与已知蛋白质的高同源性来推断。将2D电泳用来分离和鉴定在CRC产生过程中呈现出改变合成的蛋 白质点时，从凝胶切除鉴定的蛋白质点，并用胰蛋白酶消化来产生肽。 从凝胶回收肽并接受质镨(基质辅助激光解吸/电离质镨-MALDI)，并 将所得到的MS-特征图对着公众序列数据库中找到的所有序列的计算 机化MS-特征图，以及对着适当的序列信息进行分析。如果获得与之 前克隆的序列的任何匹配，收集关于相应的基因和所编码的蛋白质的 信息。当鉴定的CRC-介导蛋白与之前克隆的蛋白质不相匹配时，可以 通过本领域已知的方法将蛋白质微测序来获得部分氨基酸序列信息。 还可以通过例如纳米电喷雾串联质镨将蛋白质(以足够量获得时)部 分测序，其中在气相中将特定的肽片段化，并将片段的分子量用来产生部分氨基酸序列。
一旦可获得部分序列信息，那么除了之前提到的那些，还可以在cDNA或EST (表达的序列标记物)数据库中搜索。基于从数据库搜索或氨基酸测序获得的结果，构建特定的和简并 的引物并用来筛选人结肠和/或直肠上皮文库或将通过PCR的第一链 cDNA用来克隆相应cDNA的部分序列。然后将获得的序列用来获得全长编码区域，通过5' -race PCR 或通过常规杂交筛选技术，接着是重组蛋白的表达(Karisen等， (1991 )Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8337-8341; Karisen等，(1994 ) 在Insulin secretion and pancreatic bata-cell research (胰 島素分泌和跌腺P-细胞研究)，Flatt， P. R.等，Smith-Gordon, USA; 笫64章，pp. 1-9; Karisen等，(1995 ) Diabetes 44: 757-758 )。可以以本领域技术人员已知的各种方式来分离CRC-介导蛋白，包 括从生物材料纯化，以及从重组DNA表达(参见上文)。常规方法步 骤包括提取，沉淀，色镨，亲和色镨和电泳。例如，可以通过离心收 集表达CRC-介导蛋白的细胞，或使用合适的緩沖剂，裂解，并通过柱 色谱，例如，在DEAE-纤维素，磷酸纤维素，多核糖胞啶酸-琼脂糖， 羟磷灰石上，或通过电泳或免疫沉淀，来分离蛋白质。或者，可以通 过使用特异性抗体的免疫沉淀来分离CRC-介导蛋白。本发明提供的测试方法可用于筛选能够影响CRC-介导蛋白表达 并因此影响人CRC产生的化合物。 一种筛选能够影响一种或多种CRC-介导蛋白表达的药物的模型是将怀疑具有有益效果的化合物(包括反 义寡核苷酸)给予培养物中的细胞。有用的细胞特别是结肠或直肠产 生的细胞。然后可以通过2D凝胶电泳测定测试化合物对蛋白质表达的 作用。另一个筛选模型是使用处于产生CRC风险的哺乳动物的体内方 法。简而言之，将具有提高的CRC风险(例如，CRC倾向性大鼠或小 鼠)的哺乳动物暴露于测试化合物，并测定暴露于测试化合物对CRC 产生的作用。可以在产生阶段的整个过程中监控CRC的产生，通过测定一种或多种CRC-介导蛋白的表达并比较疾病发作的时间和疾病不产生下的 表达和时间。测定一种或多种CRC-介导蛋白的表达包括CRC-介导蛋白 自身，翻译后的修饰产物，和/或CRC-介导蛋白降解产物。在一个实 施方案中，通过测量测试样品中CRC-介导蛋白表达的水平来测定CRC-介导蛋白的激活。合适的测试样品包括体液，如血液，尿液，粪便， 结直肠组织或脑脊液，或源自这些的流体，如血浆或血清。在特定的 实施方案中，通过蛋白质印迹分析测量测试样品中蛋白质表达的水平。 通过凝胶电泳将样品中存在的蛋白质分级，转移至膜上，并用标记的 蛋白质特异性抗体来探测。在另 一个特定的实施方案中，通过RNA印迹分析来测量CRC-介导 蛋白表达的水平。从测试样品分离多腺苷酸化[多(A)+]mRNA。通过电 泳将mRNA分级，并转移至膜上。用标记的cDNA来探测膜。在另一个 实施方案中，通过施用于表达的mRNA的定量PCR来测定蛋白表达。再一方面中，本发明提供了鉴定能够抑制或降低内源有害蛋白表 达的化合物的方法，以及通过给药治疗有效量的能够抑制或降低内源 有害蛋白表达的化合物来预防和/或治疗CRC的方法。本发明的CRC-介导蛋白还可以用于筛选调节CRC-介导蛋白活性 的试剂。因此，在一方面中，本发明的特征方法用于鉴定调节CRC-介 导蛋白活性的试剂，通过用测试试剂培养表达CRC-介导蛋白的细胞并 测量测试试剂对CRC-介导蛋白合成，磷酸化，功能或活性的作用。当 通过磷酸化激活CRC-介导蛋白时，用CRC-介导蛋白培养测试试剂，使 用Y -〖"P];或["P] -标记的ATP(或其他单-核苷酸)，或["P];或["P〗-磷酸盐(磷酸)或["S]-甲硫氨酸，并测定磷酸化率，在另一个实施方案中，用细胞培养测试试剂，该细胞已经用CRC-介导蛋白多核苷酸表达载体转染了 ，并通过RNA印迹分析测量测试试 剂对CRC-介导蛋白转录的作用。再一实施方案中，使用CRC-介导蛋白的抗体，通过蛋白质印迹分 析测量测试试剂对CRC-介导蛋白合成的作用。再一实施方案中，通过用测试试剂，["P]-ATP (或上述的其他放射性化学物质)和CRC-介导蛋白途径中的底物培养CRC-介导蛋白来测 定试剂对CRC-介导蛋白活性的作用。将所有实验对用["S]-甲硫氨酸 正常标记的细胞进行比较，来测定蛋白质表达的调节。通过本领域已 知的方法测定底物磷酸化的速率。术语CRC-介导蛋白活性的调节包括 激动和拮抗。本发明特别可用于筛选抑制有害蛋白活性的试剂。这样 的试剂可用于治疗或预防CRC。本发明提供了通过给药治疗有效量的保护性CRC-介导蛋白来预 防和/或治疗人CRC的方法。优选，哺乳动物是处于CRC风险中的人。在本发明的药物筛选测试中，将鉴定的保护性或有害CRC-介导蛋 白用于鉴定能够影响它们表达的测试化合物。因此鉴定的测试化合物 是用于预防，緩解或延迟处于风险中患者的CRC发作的候选治疗剂。影响CRC-介导蛋白表达的测试治疗化合物可以是，但不限于，选 自核酸，化合物，蛋白质，元素，脂质，抗体，糖，同位素，碳水化 合物，成像剂，脂蛋白，糖蛋白，酶，可检测探针和抗体或其片段中 的至少一种，或其任意组合物，可以和标记抗体一样将其可检测地标 记，如在此所述的。这样的标记包括，但不限于，酶标记，放射性同 位素或放射性化合物或元素，荧光化合物或金属，化学发光化合物和 生物发光化合物。在本发明的药物筛选测试中通过其诱导或提高保护性蛋白表达的 能力来鉴定治疗化合物，使得防止或延迟处于产生CRC风险中患者的 疾病发作。还可以通过其防止或降低有害蛋白表达的能力来鉴定候选 治疗化合物，使得防止或延迟处于产生CRC风险中患者的疾病发作。作为治疗化合物的治疗核酸可以对目标细胞具有但不限于至少一 种以下的治疗效果抑制有害蛋白质DNA序列的转录；抑制有害蛋白 质RNA序列的翻译;抑制对应于有害蛋白的RNA或DM序列的逆转录； 抑制蛋白质的翻译后修饰；诱导对应于保护性蛋白的DNA序列的转录； 诱导对应于保护性蛋白的RNA序列的翻译；诱导对应于保护性蛋白的 RNA或DNA序列的逆转录；核酸翻译为蛋白质或酶；以及将核酸引入 用于治疗核酸组成型或瞬时表达的目标细胞的染色体中。治疗核酸的治疗效果可以包括，但不限于关闭缺陷基因或处理其表达，如反义 RNA或DNA;抑制病毒复制或合成；基因治疗，如表达编码治疗蛋白的 异种核酸或校正缺陷蛋白；修饰RNA，如hnRNA， mRNA, tRNA或rRM 的缺陷或表达不足；编码药物或药物前体，或酶，该酶在表达CRC-介 导蛋白或肽的病理或正常细胞中产生作为药物或药物前体的化合物； 以及任何其他已知的治疗效果。本发明中还包括的是通过提供编码保 护性CRC-介导蛋白的多核普酸的基因治疗。本发明进一步包括通过给 药有效量的抑制有害CRC-介导蛋白体内表达的多核苷酸来预防CRC的 方法。在本发明的治疗方法中，将治疗化合物长期或快速给药于人患者。 任选，将保护性蛋白长期给药，结合有效量的以不同于治疗化合物的 途径作用的化合物。本发明的治疗方法可以结合其他CRC的治疗方法或结合处理这类 癌症的方法。如以下实施例中所述的，将源自CRC患者和健康对照人员的结肠 的人上皮细胞在标准培养条件下培养。在标准细胞培养条件下孵育20hr后，在["S]-甲硫氨酸存在下将 细胞标记4小时。从细胞和培养基中分离蛋白质。通过2-D凝胶电泳 和质谱来分析蛋白质样品。对于分析凝胶，用于鉴定改变表达水平的蛋白质，在每个实验中 使用结肠上皮细胞进行单个实验。这允许构建每个培养条件的合成图 像。因此，通过这种方式的对照和癌细胞之间的比较和统计分析使得 可以鉴定癌细胞中以及分泌至培养基中的一组蛋白质，这些蛋白质与 对照情况相比较得到显著上调或下调。实验提出以下的实施例，以便给本领域技术人员提供怎样制备和使用 本发明的蛋白质，基因和测试的完整公开和描迷，并且不意在限制发 明人认为的发明范围。已经进行了努力来确保所使用数字的精确性(例如，含量，温度等)，但应当说明一些实验的误差和偏差。除非另外指出，份数为重量份，分子量是重均分子量，温度是摄 氏度数，并且压力是处于或接近大气压。实施例一结直肠癌介导的蛋白质的表征 试剂用于裂解緩冲液和平衡緩冲液的化学物质是脲(ICN Biomedicals)，硫脲(Fluka) ， chaps (Sigma) ， DTT (Sigma)， SDS( Serva )。 Dulbecco， s改良Eaglr培养基(D-MEM)( 41966-029/052 ) 和Hank， s平衡盐溶液(HBSS ) ( 14175-053 )来自GIBC0TM。用于DNA 酶/RNA酶緩沖液的RM酶A (cat. no. RAF LS005650 )和DNA， s I (cat.no.DPFF LS006330 )来自Worthington。用于测定同位素引入 的闪烁液体来自Canberra Packsrd。固定的pH-梯度条带pH4-7， pharmalytes 3-10 (代码No. 17-0456-01 ) ， IPG緩冲液6-11 (代码 No. 17-6001-78 )和[35S]-甲硫氨酸来自Amersham Pharmacia Biotch。 用于二维凝胶的丙烯酰胺来自Genomic Solutions,用于蛋白质测定 的染料试剂(Bio-Rad蛋白质测试，目录No500-50006 )和N， N，-亚 甲基-双-丙烯酰胺来自BioRad。结直肠正常/癌组织从Vejle医院获 得，作为正常的治疗外科手术程序的一部分。材料收集外科手术取出后立即将标本转移至病理部门。在那里打开标本并 从肿瘤/正常粘膜取出样品并转移至含有转运介质(D-MEM,其已经渗 析了人血清，lg葡萄糖/L和抗生素青霉素/链霉素，但是其中没有甲 石克氨酸，保持在371C)的不同试管中。活检组织标记从Vejie医院在371C转运介质中转运人结肠活检组织(正常/癌 症)，并使用HBSS漂洗3次。然后以lmn^切片活检组织并将一些转移移至标记介质中(已经渗析了人血清，lg葡萄糖/L, ["S]-甲硫氨 酸的D-MEM)。将剩下的活位组织放入液氮中并存储在-80X:。在37 n标记24小时后，从每个孔中收集用过的放射性培养基，并将用过的 培养基转移至标记的1.5mLEppendorf管中。然后在37^培养器中培 养培养基。将活检组织在HBSS中洗涤两次；然后收集洗涤溶液，用于 离心来收集松散的细胞和组织。此后，去除HBSS，并将活检组织转移 至盘中空而干燥的孔中，并再次转移至水冷勾浆器中。蛋白质提取将100nl DNA酶/RNA酶緩沖液(25jLig/ml RNAse A溶液，25 n g/ml DNAse I溶液，30mMNaCl， 20mMTris. HC1 ( pH7. 5 ) ， 5mMCaCh， 5mM MgCl2)加入含有活检组织的冰冷匀浆器中并匀质30秒钟。在5 至10分钟后，再次匀质。该过程重复30分钟直到所有组织匀化。取 出150 jil匀浆放入干净的管中。使用100 nl H力洗涤匀浆器，并吸 移两次，将水也取出至管中。将试管放入液氮中并充满氮气。此后将 试管放入冷冻干燥器中过夜。将300 m1裂解緩冲液(7m脲，2m疏 脲，2%CHAPS， 0. 4%DTT， 1% v/v pharmolite 3-10， IPG緩冲液6-11) 加入管中并在室温振荡过夜。蛋白质和CPM测定将适于使用裂解緩冲液的Bradford方法(Bradford MM. 1976 ) 用于测定样品中的蛋白质浓度。 一式三份，通过将10jil裂解緩冲液 加入一系列含有O, 5， 10和40jig标准蛋白(BSA)的一次性塑料比 色jiL中来制备标准曲线。将仏0加入每个比色皿中直至1600pl的总 体积，将每个样品的10 m 1 —式三份加入比色皿中的1590 hi 1 H20中， 然后将400 ji 1染料试剂加入每个比色皿中并彻底混合。在加入染料试 剂30分钟内测量每个样品在595nm处的吸收值。然后通过标准曲线测 定蛋白质浓度(Fey SJ等，1997 )。使用如下的方法测定引入蛋白质中的同位素。 一式两份取每个样品的5jLil上清液并加入45pl 0. 02WBSA中。在微试管中混合后，加 入lml 10。/。w/vTCA并在4t:放置30分钟来沉淀蛋白质。然后使用HAWP 滤器(HAWP 0200， Millipore， Bedford, MA， USA)通过吸滤收集沉 淀物，滤器用10% w/v TCA中的1% BSA预先润湿。用吹风机干燥滤器 并转移至闪烁管中。然后加入4ml闪烁液体并放置至少2h。然后使用 闪烁计数器计数样品(Canberra Packard 2000 ) (FeySJ等，1997 )。凝胶电泳在18cmlPG4-7条带上的笫一维中分离蛋白质。用于IPG4-7条带 复水緩沖液是裂解緩冲液。将所有样品加至200jnl，将这施加至IPG 条带并放置18小时以再次膨胀。此后，加入更多的lOOpl裂解液并 在其中洗涂样品，放置5. 5小时(Adelina Rogowska-Wrzesinka等， 2001 )。将5xl()6CPM装栽于每个凝胶上。在Multiphor II上进行聚焦，在201C使用总Vh50， 000 (线性递 增梯度，0V至600V,持续2:15h， 600V至3500V，持续8h，然后保持 在3500V，持续9: 25小时)。聚焦一结束就将条带在平衡緩冲液(6M 脲，30%甘油，2% SDS， 1%DTT， 50mM Tris-HCl pH8. 8 )中振荡15分 钟并存储在-80iC。在装栽于第二维之前，将条带在新鲜的平衡緩冲液 中再平衡15分钟。在第二维中，在垂直的Investigator 2-D电泳系统(Millipore) 上使用12. 5% w/v丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺双丙烯酰胺比例200: 1 ) 进行SDS PAGE凝胶电泳。将凝胶在201C在恒定电流设置下跑胶过夜。 将跑胶緩沖液再循环。蛋白质模式观察和计算机分析在两维凝胶电泳分离后，将凝胶在滤纸上直接干燥，暴露于磷成 像仪平板(AGFA)10天，并在AGFAADC70读出器(Morstel， Belgium) 中阅读。然后在边角用放射性墨水将凝胶标记并暴露于薄膜(AGFA, GurixRP2) 25天，以便制备切割掩模和蛋白质鉴定(NawrockiA等，2001 )。使用Bioimage 2-D分析仪(基于UNIX的)分析从ADC70磷成像 仪获得的2D凝胶模式。对所有凝胶使用相同的参数发现了斑点边界。 在一些情况中，人工校正边界(例如，分开对于程序太近以致于难于 区别的斑点)。作为斑点边界内所有像素值的总和(集成光密度，IOD) 来测量蛋白质表达(Nawrocki A等，2001 )。作为一个凝胶中所有斑 点的总百分比"I0D)给出(Adelina Rogowska-Wrzesinka等，2001 )。 将所有图像与参照图像(来自之前的分析)相比较。将超过5个图像 中存在的而在参照图象中不存在的斑点添加至参照图像的校正位置 上。摘录每个斑点的匹配数和9il0D并将所有数据和之前的数据放在 一起。将数据分成两组正常细胞和癌细胞。计算每个组中每个斑点 的标准偏差，并将每个斑点的正常和癌症组织之间的标准偏差平方的 比较结果用于接下来的student' s t-检验。对每个斑点计算两个组之间的student' s t检验来揭示表达显著 不同的蛋白质(显著水平99%, p=0. 01)。然后选择显著不同的蛋白 质。制备性凝胶对于随后通过质镨鉴定蛋白质，除了 3xl06 CPM/凝胶[35S]-甲硫 氨酸标记的蛋白质，装栽300 ng/凝胶冷蛋白质来跑制备性IPG4-7凝 胶，使用相同的梯度和程序。在第二维后，将制备性凝胶干燥并暴露 于X-射线薄膜10天(Adelina Rogowska-Wrzesinka等，2001 )。蛋白质鉴定将展开的X-射线薄膜置于干燥的凝胶上，使用拐角上的标记来定 位目标蛋白。放置透明膜来重新定位蛋白质并且除去X-射线膜时用作 切割掩模。然后从凝胶直接切除蛋白质。通过在H20中洗涤从凝胶的 背面除去剩余的白色滤纸并通过真空离心干燥，直至其在表面上变成白色。然后使凝胶在50mM NH4HC03， 5mM CaCl2， 12. 5ng/n L胰蛋白酶 中在41C再次膨胀45分钟。然后上清液由5-10jaL不含胰蛋白酶的相 同緩沖液替代并使其在37C消化过夜(Fey SJ等，1997 )。在凝胶消 化后，通过MALDI质镨来分析(Jensen ON等，1998 )。使用胰蛋白 酶自体消化肽来内部校准所获得的质语(Fey SJ等，1997 )。然后将 它们用于搜索NCBI数据库，通过MASCOT MS/MS离子搜索(http: //www, matrixscience. com) 将以下的参数用于数据库搜索，使用较少的改进哺乳动物，胰 蛋白酶消化，甲硫氨酸可能的氧化，允许一个错失的分裂，没有蛋白 质质量和pl限制，肽耐受性士 50-70ppm, MS/MS耐受性土O. 5Da，肽 电荷+1，单同位素，MALDI-TOF-TOF是所用的方法。"显著的"结果可以认为是结合搜索SWISS-PROT数据库的鉴定并 综述2D凝胶模式中的蛋白质位置。从NCBI数据库(http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi db=Protein ) SWISS-PROT数据库(http: 〃www， ncbi. nlm. nih. gov/entrez/query. fcgi db-Protein)和其他参考的出版物引用蛋白质功能。结果在该研究中，标记来自结肠癌患者的正常和癌结肠活检组织并在 蛋白质提取后通过2DGE分析。从33名患者获得正常/癌活检组织，并 且总共使用65个样品( 一个癌症样品受到细菌的污染)。使用IPG4-7 凝胶分析每个样品的蛋白质组。使用计算机辅助图像分析，检测并匹配2， 128个斑点。然后将 ["S]-甲硫氡酸标记的蛋白质2DGE模式分成两组正常和癌症。在"正 常"组中存在33个模式，在结直肠癌活体切片组中存在32个模式。

图1中显示了凝胶图像的实例.困1显示了来自正常人结肠组织(左边)和结直肠癌活检组织的 ["S]-甲硫氨酸标记的蛋白质的2DGE模式。正常组织来自65岁女性， 而结直肠癌活检组织来自59岁男性。此后进行这两个组之间的比较和统计学分析。298个蛋白质斑点 显示出两个组之间的显著改变。它们全部切割自IPG4-7制备性凝胶， 并接受MALDI质傳。迄今为止，已经鉴定出66个斑点，更多的正在进 行中。在这些斑点中，癌症中的25个斑点得到上调，癌症中的41个斑 点得到下调。31个斑点是低密度的(在正常和癌症组中平均 %IOD<0. 05)。这是全部鉴定的斑点的47%。表明可以鉴定许多弱的斑 点。鉴定蛋白质的位置显示于图2中的2DGE模式中，并且在表l中给 出了这些蛋白质的定量。图2显示出来自正常人结肠活检组织的[35-S]-甲硫氨酸标记的蛋 白质的2DGE模式。将IPG4-7梯度用于第一维中的蛋白质分离，并将 12. 5%聚丙烯酰胺的SDS-PAGE用于笫二维中。所有名称是Swiss-prot 数据库中鉴定的蛋白质的登录号。 一些可能是翻译后修饰蛋白， 一些 可能是较大的蛋白质及其分解片段或翻译后修饰蛋白， 一些是已经报 道在人结直肠癌中具有不同表达或已经认为是结直肠癌可能的诊断标 记的蛋白质。蛋白质登录号后的'A， ， 'B， ， 'C，…关联于表1 中的'A， ，'B， ，'C，…，用于不同的MI0D。可能的翻译后修饰在多于两个斑点中发现十种鉴定的蛋白质。其中，将角蛋白l(图 2中标记为O鉴定为相互之间非常远的六个斑点。通常认为角蛋白1 是质谦过程中的污染物。因此，这些斑点需要再次分析，它们中的六个鉴定为两个或具有两个相互非常接近的行内斑点。 认为这种斑点模式是一种翻译后修饰的类型，改变了蛋白质的pl，但 是分子量没有大的改变。图3显示了可能的PTM斑点的放大2DGE模式I-网素(9a ); intelectin ( 9b );角蛋白19 (9c) ; Ig oc链C片段(9d);肌动 蛋白，细胞质2(9e);纤维蛋白原y链前体(9f )例如，I-网素(Q14651 )鉴定为两个斑点，并且在结直肠癌活检组织中都是下调的。较中性的一个比较酸性的一个量更大。磷酸化是预测的PTM，并且我们通过2DGE模式中的斑点位置证实了该结论(图 2和3a，表1)。Intelectin-l ( Q8WWA0 )鉴定为两个斑点，并且在结直肠癌活检 组织中都是下调的。N-糖基化是鉴定的PTM (Swiss-prot)(图2和 3b)。角蛋白，I型细胞骨架19 (P08727 )鉴定为四个斑点，并且在结 直肠癌活检组织中全部是下调的。其中两个斑点非常接近(图2和3c)。 已知角蛋白待磷酸化，因此磷酸化可以是预测的PTM。Ig oc-l链C区域(P01876 )鉴定为三个斑点，在结直肠癌活检 组织中全部是下调的。其中两个斑点非常接近(图2和3d)。 Cys-352 是蛋白质修饰位点，在发色团和可接近的半胱氨酸之间反应后形成非 还原的硫醚交联。肌动蛋白，细胞质2 (P63261 )鉴定为三个斑点。其中相互之间 非常接近(图2和3e)的两个在结直肠癌活检组织中是上调的，另一 个在结直肠癌活检组织中是下调的。纤维蛋白原Y链前体(P02679 )鉴定为两个斑点，并且在结直肠 癌活检组织中都是上调的。C-端酪氨酸的硫酸化已经预测为PTM，其可以提高对凝血酶的亲和性，凝血酶是引发纤维蛋白原转化为纤维蛋 白的酶(图2和3f )。五种蛋白质鉴定为位于相对近的位置的两个或三个斑点(图2中 标记的)。它们可能是较大的蛋白质和其分解片段。由于在此使用了 快速样品制备程序，我们认为这些分解片段是在活检组织中产生的， 因此是重要的。还将其中三种(P14625, P05787, P08727, P63261 )认为是翻译 后修饰，其改变了蛋白质的pl，但是分子量没有大的改变。以上已经讨论了 P08727和P63261。内质网素前体(P14625 )鉴 定为结直肠癌活检组织中两个上调的和一个下调的斑点(图2),而 下调的一个在蛋白质混合物Spot C中得到鉴定，因此结直肠癌活检组织中蛋白质的表达可能是上调的。没有报道过该蛋白的蛋白质修饰。角蛋白，II型细胞骨架8 (P05787 )鉴定为相互接近的三个斑点， 并且全部三个斑点在结直肠癌活检组织中是下调的(图2) 。 Ser-73 的磷酸化在角蛋白丝状体重新组织中起着重要作用。蛋白质混合物三个斑点鉴定为两个或三个蛋白质的混合物。 Spot A: P35527和P04264 (序列覆盖32%和22%)。 SpotB: P13667, P02679和P08238 (序列覆盖:23%, 33%和24%); Spot C: P14625和P04217 (序列復盖17%和10%);(图2) 通常， 一种成分具有更好的覆盖和更高的匹配值。其他成分可能 是较大蛋白质的分解产物，并且肽质量覆盖蛋白质序列的片段(Spot B)，或可能它们都是较大蛋白质的分解产物(SpotC)，或可能涉及 一些污染物，如角蛋白(spot A)。在通过随机的样品制备过程中不 可能产生这些片段，因为所有选定的斑点在两组之间具有统计学显著 改变，两个组具有总共超过60个样品。换句话说，这些降解产物是在 组织或癌活检组织中特异性产生的。蛋白质功能可以通过不同的功能或途径将鉴定的蛋白质分組。如果没有特别 提及，所有的数据从Swiss-prot数据库获得。在47个蛋白质中，25 个蛋白是结构蛋白，其超过全部鉴定蛋白的一半(53%)。这非常容易 理解，因为在肿瘤产生过程中，可以破坏或改变细胞的正常结构，例 如，可以改变细胞的细胞骨架来影响离子通道。此外，23% (11个) 是细胞代谢中涉及的蛋白质，例如，半乳凝素-1，促泌素和組织蛋白 酶D在凋亡，细胞分化或细胞周期调节中起作用。 一旦胂瘤产生，它 们的表达必定受到影响。5种蛋白是转运蛋白，对此的一种解释是细 胞结构的改变，例如，膜，细胞内外一些蛋白运输的通道受到阻断， 并且这影响了转运蛋白的表达。反之亦然。4种蛋白涉及免疫/防御系统。可能是因为一旦免疫系统识别异常的细胞活性，如肺瘤产生，更 多免疫细胞渗透结肠和直肠来阻止它。将具有多功能的一些蛋白如血 清白蛋白放入可以表示其主要功能的组中。对于更多的详细内容，参见表2。蛋白质与结直肠癌的关系基于之前的科学报道，还可以将鉴定的蛋白质分成四组.已经报道与正常的结直肠组织相比较在人结直肠癌中具有不同 的表达或已经认为是结直肠癌的可能诊断标记的蛋白质。(组A) 已经报道与正常的组织相比较在其他癌症(即，乳癌)中具有 不同的表达或已经认为是可能的诊断标记的蛋白质。(组B) 已经报道具有与其它疾病相关性的蛋白质。(组C) 关于它们与任何疾病的相关性没有报道过的蛋白质。(组D) 蛋白质名称，亚细胞位置，结直肠正常和癌组织中平均9il0D列于 表1中。然后选择组A (已经报道与正常的结直肠组织相比较在人结直肠 癌中具有不同的表达或已经认为是结直肠癌的可能诊断标记的蛋白质)。将进一步讨论该組中每个蛋白质在结直肠癌产生中的功能和作 用。其中，3个是结构蛋白，3个是转运蛋白和3个蛋白涉及细胞代谢。 5个蛋白在结直肠癌活检组织中是下调的，4个蛋白是上调的。下调的蛋白 L-网素L-网素是网素的一种异构形式(isoform) ( T-网素是另 一种异构 形式)，网素是人肌动蛋白结合蛋白的家族，其在真核生物进化中是 保守的并在所有正常复制中的哺乳动物细胞中大量表达(Lin CS等， 1993 )。其在造血细胞中表达，在其中可以得到磷酸化并已经发现在 许多类型的非造血来源的恶性人细胞中合成。由于其在实体肿瘤的人 肿瘤细胞中的高表达，L-网素可能在肺瘤发生中起作用或在肿瘤产生的过程中L-网素基因已经被激活(LinCS等，1993 )。已经对人前列 腺，乳房和其他类固醇调节区域进行了一些研究(Lin CS等，1993， Zheng J等，1997 )，并且结果显示L-网素的表达在癌中是上调的。 可能是激素受体受到了诱导来调节L-网素的表达。已经对源自单个患者的结肠癌细胞系SW480和SW620进行了另一 个实验。结果表明与早期相比较，L-网素在晚期结直肠癌中是超表达 的(OtsukaM等，2001 )。不幸地，在该研究中没有进行正常和癌结 直肠细胞之间的比较。令人感兴趣地，在我们的研究中，与正常组织相比较，L-网素的 表达在癌组织中是下调的。因为该蛋白在总共超过60个样品的两个组 之间具有显著的改变，不可能任意产生。MOD的平均"癌"/ "正常" 比例是0.55，这同样是不可忽视的。此可能的解释是结肠组织中的L-网素表达不同于类固醇调节区域中的，如乳房，前列腺，卵巢等。一 种可能性是它从正常组织至结直肠癌活检组织是下调的，从癌症早期 至癌症晚期是上调的。一种解释可能是小肠的刷状缘是正常生长-如果 该生长快于早期肿瘤，其将发生。但是这需要通过对不同阶段的癌组 织而不是细胞系的进一 步研究来证明。TransgelinTransgelin是形变敏感性肌动蛋白凝胶化和转化蛋白，通常在成 纤维细胞和平滑肌中发现(LawsonD等，1997 )。它与肌动蛋白微丝 直接作用，并使其在聚合中快速凝胶化。肌动蛋白结合位点或功能性 凝胶化位点与一簇正电荷的氨基酸残基相关。Transgelin的活性受到 离子强度的控制。在高离子强度完全失去其能力。其凝胶化活性在低 离子强度通过二聚体或寡聚体的形成而受到控制。在肌动蛋白凝胶的 形成中，其起到了集束或交联的作用。因为transgelin在正常细胞的 细胞的细胞骨架组织化和激活中起着这样重要的作用，可以在致癌性 转化的细胞中发现其下调的表达。在这些细胞中，细胞骨架的重新组 织和异常移动是转移的重要特征(ShaplandC等，1993 )。已经通过研究许多细胞系中的成纤维细胞transgelin的表达证实了这一点 (Lawson D等，1997 )。已经进行了一些研究来调查人结肠胂瘤细胞系以及源自患者的人 结肠和乳房肿瘤组织中的transgelin表达。结果显示细胞系和组织中 的transgelin表达丢失或降低(Shields JM等，2002 )。 Transgelin 的丢失在基因表达水平得到调控。它的下调表达直接由Ras激活引起。 这是重要的，因为在全部人癌症的约30%中存在Ras基因的突变。此 外，在一些肿瘤细胞中，Ras-独立机制具有相同的功能。换句话说， 我们可以说transgelin的下调与致癌Ras的瞬时表达相关(Shields JM等，2002 )。在我们的研究数据中，与正常结直肠组织相比较，肿 瘤组织中的transgelin得到明显下调。％I0D的平均"癌"/ "正常" 比例为0.71，并且由于2DGE上显示的高含量，其应当是用于人结直 肠癌的良好早期诊断标记，可能是在癌症形成后。此外，由于抗 -transgelin的存在，其可以得到检测。肝脂肪酸-结合蛋白肝脂肪酸结合蛋白是低分子量蛋白的脂肪酸结合组的成员，其涉 及长链生物活性脂肪酸的胞内转运(Lawire LC等，2004 )。其在肝 细胞和肠细胞中得到特异性表达(Ya迈azaki T等，1999 )。由于其的 脂质结合特征，它在脂肪酸的溶解和胞内分配中起着重要作用。这使 得脂肪酸更易于细胞吸收和胞内加工(Storch J， ThumserAE. 2000 )。 它还涉及脂肪酸介导的信号转导途径和基因表达调控。因此，它在一 些重要生理功能如细胞分裂，生长，分化等的控制中起着作用(Lawrie LC等，2004 )。在肿瘤产生和进展的过程中，这些功能全部得到较少 的调控，并在其正常发展的过程中通过人胚胎显示出最快的生长。Lawrie LC对结直肠癌中的肝脂肪酸结合蛋白表达进行的研究表 明结直肠癌中一致的丢失，并且它的丟失是癌症发展中的早期亊件 (Lawrie LC等，2004 )。在另一个方面中，在患有源自结直肠癌的肝转移的患者中，肝切除后肝脂肪酸结合蛋白阳性患者的存活年数高于肝脂肪酸结合蛋白阴性的患者(YamazakiT等，1999 )。这显示出肝脂肪酸结合蛋白的下 调与肿瘤的发展相关。我们的研究数据精确地显示出正常结直肠组织至结肠癌组织的相 同下调表达趋势。并且W0D的平均"癌"/ "正常"比例为0.51。此 外，2DGE上显示出的蛋白含量相当高。这使其更易于得到检测。因此， 肝脂肪酸结合蛋白可以是结直肠癌非常好的预后标记。角蛋白，I型细胞骨架20角蛋白20是胃肠道上皮细胞中的细胞骨架蛋白(Schwerer MJ等， 1996 )，其首先在1992年得到检测(Moll R等，1992 )。它是属于 中间丝家族的称为"软角蛋白"中的一种。软角蛋白含有多于20多个 成员，并分成两个主要的组I型(K9-20，酸性)，II型(Kl-8，中 性至碱性)(Zhou Q等，2003 )。在角蛋白家族中，角蛋白20具有不常见的分布，并且迄今为止只 得到很少的研究(Zhou Q等，2003 )。例如，人角蛋白20具有一些 特定的特征.与其他I型角蛋白比较，通常它在保守的oc-螺旋"杆"结构域 中与角蛋白14(最相关的角蛋白)只具有58財目同的氨基酸；(MollR 等，1993 ) 它的分布几乎完全限于胃，肠上皮，尿路上皮，膀胱，梅克尔细胞等；(Moll R等，1993 ) 它在更分化的肠细胞的表达沿着隐窝绒毛分化轴定位 它缺乏对大部分抗角蛋白抗体的免疫交叉反应性(Zhou Q等，2003 )它的表达随着高度分化的组织中的分化而提高。已经对角蛋白20 和癌症之间的相关性进行了许多研究。已经证明了它对于原发性和转 移性人腺癌的表征是重要的(Wildi S等，1999 )。此外，认为它是 辨别癌原发性来源的辅助标记，尤其是对于分离胃肠道和非胃肠道来源的腺癌(MiettinenM， 1995 )。对结直肠癌细胞系进行的一些其他 研究显示出与正常结肠样品相比较，CK20 mRNA在结直肠癌样品中降 低了 (WildiS等，1999 )。还认为角蛋白20是结直肠癌中亚显微淋 巴结转移的标记并通过K-RAS得到证实，K-RAS是约30-40%结直肠癌 中突变的基因(Yun K等，2000)。在我们的研究中，与正常结直肠组织相比较，肿瘤组织中的角蛋 白20是下调的，具有O. 4的％100平均"癌"/ "正常"比例。然而， 检测到的蛋白质的平均含量相对低，并且难以使用消失的蛋白质用于 诊断，因此只能用于区分肿瘤类型，并可以作为人结直肠癌的辅助诊 断标记。阿朴脂蛋白A-I阿朴脂蛋白A-I是高密度脂蛋白(HDL)的主要结构蛋白，其具有 234个残基。它属于可交换阿朴脂蛋白的类别，并含有球状氨基端结 构域和脂质结合羧基端结构域(Segrest JP等，2000; Marcel YL等， 2003)。其脂质结合特征帮助在分离成组成部分的脂蛋白的能力和循环中 脂质稳定转运之间形成了微妙的平衡(Marcel YL等，2003 )。这促 进了胆固醇从细胞流出，并且该机制在支持细胞胆固醇体内平衡中起 着重要作用(Segrest JP等，2000)。此外，它结合脂质，激活卵磷 脂，形成与特定受体相互作用的成熟HDL和脂质转移蛋白的能力可以 影响逆向胆固醇转运的效率。并且和HDL—起，它们在逆向胆固醇转 运中的作用决定了 HDL血浆水平和冠心病之间的逆相关(Frank PG等， 2000)。除了冠心病以外，已经报道阿朴脂蛋白A-I在其他疾病中是重要 的，其他疾病如类风湿性关节炎，多发性硬化，全身性红斑狼疮和动 脉粥样硬化(Hyka N等，2001 )。已经表明阿朴脂蛋白A-I在人肠上皮细胞中表达。Normanno进行 的一个研究表明使用Apo A-I RT-PCR测试在健康人或没有结肠癌的患者中不能检测到阿朴脂蛋白A-1 mRNA( 4名健康供体和11名患有结肠 癌以外的肺瘤疾病的个体)，而发现少量结肠癌患者是阳性的(NormannoN等，1998 )。在我们的分析结果中，在结直肠癌活检組 织和"正常，，组中检测到的蛋白质平均含量非常低，尽管％100的平均"癌"/ "正常"比例非常良好(O. 32)。这可以解释为什么Normanno 在他的正常样本中不能检测到它。同时，Normanno N的研究的样本数 相对小，并且可以将二十个中的两个阳性结果认为是偶然的。对结直 肠癌中下调的一种假设是在癌症发展的过程中，阿朴脂蛋白A-I的丢 失可能碰巧破坏了胆固醇流出的体内平衡，打乱了细胞代谢。但是这 样的假设需要之后的研究来证实。上调的蛋白 组织蛋白酶D组织蛋白酶D是组织蛋白酶家族的成员，其在胞外基质降解中具 有作用(AdenisA等，1995 )。它是在溶酶体中遍及分布的天冬氨酸 内切蛋白酶。组织蛋白酶D最初在粗面内质网上合成为52kDa前体蛋 白，并且照这样是没有酶活性的。通过蛋白水解处理，其分裂成46kDa 活性双链形式(Talieri M等，2004 )。组织蛋白酶D的主要功能是 在酸性pH降解溶酶体中的蛋白质。此外，在一些特异性细胞中，其可 以通过清除无活性的前体来形成活性蛋白质(Liaudet-Coopman E等， 2005)。现今，最多讨论的组织蛋白酶作用是与癌症的关联。几个报道已 经表明这种酶的表达与各种器官癌症患者的预后直接相关.这是因为 其刺激癌细胞增殖的能力。组织蛋白酶D的产生提高了癌细胞的入侵潜能，导致转移可能性的提高。此外，其可以降解胞外基质并激活一 些其他的已经认为与肺瘤进展相关的蛋白酶，如组织蛋白酶B和L (0h-e H等，2001 ).然而，Liaudet-Coopman E和同亊的研究结果 显示出通过直接或间接引发未经确认的细胞表面受体，组织蛋白酶D 可以作为替代蛋白酶的胞外基质结合蛋白。它不仅可以刺激癌细胞增殖，而且刺激肿瘤血管生成。此外，认为通过与M6P/IGFII-受体(它 在通过核内体途径转运不同配体中的作用是公知的)的相互作用，组 织蛋白酶D促进了胂瘤细胞增殖(Liaudet-Coopman E等，2005 )。 一些其他研究已经表明组织蛋白酶D是诱导型凋亡的关鍵阳性介质， 因此，组织蛋白酶D在凋亡中可能具有双重作用(Liaudet-CoopmanE 等，2005 )。这与我们的研究数据一致，与正常组织相比较，组织蛋白酶D在 癌组织中是超表达的。MI0D的平均"癌"/"正常"比例非常好(l. 7)， 尽管结直肠癌活检组织和"正常"组中的蛋白质含量相对低。 一些其 他报道还指出是组织蛋白酶D活性而不是含量与结直肠癌的恶性进展 相关。与含量连续增加相比较，活性从正常粘膜至配对的肿瘤cytocol 是递增的，不过当肿瘤变得更大时，是递减的(Tumminello FM等， 1995 )。因此，结合组织蛋白酶D蛋白的含量和活性的改变可以给我 们更清楚的诊断证据。半乳凝素-1半乳凝素-1属于广泛分布于活生物体中的结构上相关的蛋白质 的半乳凝素家族。该家族通过具有至少 一个碳水化合物-识别结构域及 其对含P-半乳糖的寡糖的亲和性来限定(Danguy A等，2002; Rabinovich GA， 2005)。作为半乳糖结合蛋白，证明了半乳凝素-1是各种细胞类型的有效 促细胞分裂剂，并且已经将许多生长调控现象归于半乳凝素-1。例如， 通过与细胞P -半乳糖苷配体的相互作用，其可以促进促有丝分裂或细 胞抑制应答。其可以与未知的配体相互作用来抑制许多细胞类型的增 殖，细胞包括与P-半乳糖苷结合无关的正常和肿瘤细胞。此外，尽管 一些肿瘤细胞抵抗这种对生长和转移的作用，半乳凝素-1在它们周围 的组织中介导的生长抑制或凋亡可以影响肿瘤细胞的生长和存活 (Scott K等，2004 )。已经报道了在许多人器官中与正常细胞相比较半乳凝素-1在癌细胞中的超表达，器官如膀胱，甲状腺，结肠等。此外，报道了人结 肠癌的疾病进展过程中细胞质半乳凝素-1的显著增加。另一个重要的 观察是半乳凝素-1提高的表达与其表达的胞内位置的改变相关。在肿 瘤的发展过程中，细胞质内它的表达与正常结肠组织中看到的核定位相比较变得逐渐增加(HitteletA等，2003 )。另一个研究还指出结 直肠粘膜中半乳凝素-1超表达与肿瘤进展相关(Sanjuan X等，1997 ), 因此，半乳凝素-l对于结肠癌细胞的恶性行为是关鍵作用(Hittelet A等，2003 )。我们的数据精确地显示出相同的表达趋势，具有1.61 的WIOD的平均"癌"/ "正常"比例。因此，半乳凝素-l是相当好的结直肠癌诊断标记。报道了 galictin家族中的另一个成员-半乳凝素-3也涉及结肠癌 的恶性进展，并且可能是更好的临床诊断标记(Hittelet A等，2003 )。蛋白酶体5型oc亚基蛋白酶体是所有真核细胞的细胞质和核中存在的高度保守的，大 量的多催化(multicatalytic)酶复合物(Zevrski I等，2005; DaltonWS， 2004 )。其主要功能是消除细胞蛋白，不仅除去损坏的和错折叠 的蛋白，而且除去各种具有重要细胞作用的蛋白，重要细胞作用如细 胞周期的调节，细胞分化，凋亡，应激应答等。报道了超过80%的所 有细胞蛋白受到蛋白酶体的降解(DaltonWS， 2004 )。由于这些底物 在细胞代谢中的关鍵作用，因此蛋白酶体是细胞中的重要成分。对核因子-kb (NF-kB)进行的研究已经证明了蛋白酶体抑制的 效果，其导致其不利底物的稳定和累积。NF-kB是与I-kB(抑制伴 侣蛋白)结合时保留在细胞质中的转录因子。当I-KB经受调控的丝 氨酸磷酸化作用时，它在蛋白酶体中降解。 一旦从I-tcB释放出来， NF-KB转移至核中，然后它控制涉及细胞分化，生长和凋亡的转录基 因。此外，它促进细胞增殖和肿瘤发生。通过蛋白酶体抑制剂的I-k B降解的抑制可以将NF- k B保持在细胞质中，因此防止其与核DNA的 相互作用。因为I- k B磷酸化作用的抑制剂不能够完全防止细胞增殖，这表明蛋白酶体抑制剂的作用是多目标途径(Mitchell BS, 2003; Zavrski I等，2005 ) 。 Bortezomib， 一种可逆的硼酸二肽蛋白酶体 抑制剂，是在癌症临床测试中测试的第 一种蛋白酶体抑制剂。因此，尽管是新的，蛋白酶体是各种癌症，包括结直肠癌治疗相 当好的目标。对结肠癌细胞系(SW48， SW116)和结肠癌样本的研究都 证明了蛋白酶体抑制剂可以抑制细胞生长和诱导凋亡(Hochwald SN 等，2003 )。根据之前提及的已知细胞作用，我们研究中的蛋白酶体的上调可 以表示结直肠癌的发展。血'清白蛋白人血清白蛋白是血液中的通用转运蛋白。它的主要功能是在血流 中携带疏水性脂肪酸分子。它还结合许多其他的天然物质和各种药物 分子。蛋白质由单个多肽链构成。它是67% oc-螺旋并且不含有P-片状 结构。它由三个类似的同源结构域构成，其装配形成心形分子(HeXM 等，1992 )。由于广泛的分布及其可能反映出营养状况和蛋白质摄入的能力 (KnektP等，2000)，认为血清白蛋白与各种疾病，包括癌症相关。Knekt和同亊进行的一个研究表明较高的血清白蛋白水平与远端 结肠癌较高的危险系数相关，但与近端结肠或直肠癌不相关。在我们 的数据中，它在结直肠癌中也是上调的，具有1. 82的％100的平均"癌" / "正常"比例。 一种解释是肿瘤中和肿瘤周围的高蛋白摄入或其他膳 食因素导致高浓度的血清白蛋白(Knekt P等，2000 )。在九种蛋白中，其中七种具有与之前报道相同的表达趋势。对于 剩余的两种蛋白，L-网素和阿朴脂蛋白A-I，没有报道过结直肠正常 和癌组织之间的表达比较。换句话说，对于结直肠癌的标记，我们的 数据与之前的公开完全一致。除了这9种蛋白，我们已经鉴定了 57种从未与结直肠癌相联系过的其他蛋白质，并且提出大部分或全部与结直肠癌相关。 基于上述实验部分得出的结论在由2DGE选择的全部298种蛋白质中，这些中的125种是上调的， 并因此是潜在的诊断标记。使用2DGE和MS，鉴定出了 66种在正常结 直肠组织和结直肠癌组织之间具有显著表达差异的蛋白质。之前报道 过这些蛋白质中的九种作为标记，目标或对结直肠具有影响。这证明了 2DGE结合MS技术是发现结直肠癌标记或目标蛋白的杰 出方法。在这些研究中发现并且还发现与结直肠癌相关的9种蛋白质 中，我们的数据与所有之前的观察相一致并扩充了所有之前的观察。 不仅是之前已经报道过的九种蛋白，而且鉴定的所有蛋白也可以用于 诊断目的。因此，所获得的结果在临床环境中具有非常高的价值.参考文献Adelina Rogowska-Wrzesinka， Larsen PM Blomberg A. ， Gorg A.， Roepstorff P. ， Norbeck J. Fey SJ. ， Comparison of the proteomes of three yeast wild type strains: CEN. PK2， FY1679 and W303 (三 种酵母野生型菌林的蛋白质组的比较CEN.PK2， FY1679和W303 )。 Comparative and Functional Genomics 2001 ;2:207-225Adenis A， Huet G， Zerimech F, Hecquet B， Balduyck M, Peyrat JP. 组织蛋白酶B， L, and D activities in colorectal carcinomas: relationship with clinico-pathological parameters (结直肠癌 中组织蛋白酶B， L和D活性与临床病理学参数的相关性)。Cancer Lett. 1995 S印25; 96 (2): 267-75.Aebersold R, Mann M Mass spectrometry-based proteomics (基于质谦的蛋白质组学)，Nature 2003 Mar 13, 422 (6928): 198-207Arpin M， Friederich E， Algrain M， Vernel F， toward D. Functional differences between L- and T-plastin isoforms ( L-和T-网素异构体之间的功能差异)。J Cell Biol. 1994 Dec; 127(6Pt 2): 1995-2008.Boel Lamie， Oleg Panfilov Protein staining influences the quality of mass spectra obtained by peptide mass fingerprinting after separation on 2-D gels. A comparison of staining with Coomassie Brilliant Blue and Sypro Ruby.(蛋白质染色影响了通 过2-D凝胶上分离后肽质量指紋分析获得的质镨质量。库马氏亮蓝和 Sypro Ruby染色的比较)。Journal of Proteome research 2005, 4，175-179Bradford 亂 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding (使用蛋白-染料结合原理定量 蛋白质微克质量的快速且灵敏的方法)。Anal Biochem. 1976 May 7; 72: 248-54.Chabowski A， Skrzydlewska E， Sulkowska M， Famulski W， Zalewski B， Gnojnicki I， Kisielewski W. 组织蛋白酶D activity in colorectal cancer (结直肠癌中的组织蛋白酶D活性)。Rocz Akad Med Bialymst. 2001 ; 46: 38-46.Coutinho AK， Rocha Lima CM. Metastatic colorectal cancer: systemic treatment in the new millennium (转移性结直肠癌新 千年的系统治疗)。Cancer Control. 2003 May-Jun; 10(3): 224-38.Dalton WS. The proteasome (蛋白质组学)Semin Oncol. 2004 Dec; 31 (6 Suppl 16):3-9; discussion 33. Review.Danguy A, Camby I， Kiss R.半乳凝素s and cancer (半乳凝 素和癌症)Biochim Biophys Acta. 2002 Sep 19; 1572 (2-3): 285-93. Review.Etzioni R， Urban N， Ramsey S， Mcintosh M， Schwartz S, Reid B， Radich J， AndersonG， Hartwell The case for earlydetection (早期诊断的病例)Nat Rev Cancer. 2003 Apr; 3 (4): 243-52.Fey SJ， Nawrocki A， Larsen MR， Gorg A， Roepstorff P， Skews GN， Williams R, Larsen PM. Proteome analysis of Saccharomyces cerevisiae: a methodological outline. Electrophoresis (酉良酒 酵母的蛋白质组学分析方法概述)1997 Aug; 18 (8) :1361-72.Fey SJ， Mose Ursen P. 2D or not 2D ( 2D或不是2D) Curr Opin Che迈Biol. 2001 Feb; 5 (1): 26-33.Frank PG, Marcel YL. Apolipoprotein A-I: structure—function relationships.(阿4卜脂蛋白A-I:结构-功能 相关性)J Lipid Res. 2000 Jun; 41 (6): 853-72. ReviewGartner W， Lang W， Leutmetzer F, Domanovits H， Waldhausl W， Wagner L. Cerebral expression and serum detectability of secretagogin， a recently cloned EF-hand Ca (2+)-binding protein (secretagogin ( —种最近克隆的EF-hand Ca (2+)结合蛋白)的脑表 达和血清可检测性)Cereb Cortex. 2001 Dec; 11 (12): 1161-9.Haraguchi M， Komuta K， Akashi A， Furui J， Kanematsu T. Occurrence of hematogenous metastasis and serum levels of thymidine phosphorylase in colorectal cancer.(结直肠癌中造 血性转移的发生和胸苷磷酸酶的血清水平)Oncol Rep. 2003 Sep-Oct; 10(5): 1207-12.He XM， Carter DC. Atomic structure and chemistry of human serum albumin (人血清白蛋白的原子结构和化学性质)Nature. 1992 Jul 16; 358 (6383): 209-15. Erratum in: Nature 1993 Jul 22; 364 (6435): 362.Hittelet A， Legendre H， Nagy N， Bronckart Y， Pector JC， Salmon I, Yeaton P, Gabius HJ， Kiss R， Camby I. Upregulation of 半乳凝素s-l and -3 in human colon cancer and their role in regulating cell migration (人结肠癌中半乳凝素-l和-3的上调及 其调节细胞转移的作用)Int J Cancer. 2003 Jan 20; 103 (3): 370-9.Hochwald SN， Lind DS， Malaty J， Copeland EM 3rd, MoldawerIX， MacKay SL Antineoplastic therapy in colorectal cancer through proteasome inhibition.(通过蛋白酶体抑制的结直肠癌的 抗肿瘤治疗)Am Surg. 2003 Jan; 69 (1): 15-23.Hoffman E.D. Stroobant V. Mass spectrometry, Principle and Applications (质镨，原理和应用)JohnWiley & Sons, Ltd, 2001, 第二版Hyka N， Dayer JM， Modoux C， Kohno T， Edwards CK 3rd, Roux-Lombard P， Burger D. Apolipoprotein A-I inhibits the production of interleukin-l beta and tumor necrosis factor—alpha by blocking contact—mediated activation of monocytes by T lymphocytes. Blood.(阿朴脂蛋白通过阻断由T淋 巴细胞接触介导的单核细胞激活抑制了白细胞间介素-1 P和肿瘤坏死 因子ot的产生)2001 Apr 15; 97 (8) :2381-9.Jensen 0N， Shevchenko， A. ， Mann， M. Protein analysis by mass spectrometry (通过质镨的蛋白质分析)protein structure -A practical approach (蛋白质结构-实践方法)1997 ( 2nd版，T. E. Creighton，编辑)Oxford: IRL Press, Oxford University Press.Jensen 0N， Larsen MR, Roepstorff P. Mass spectrometric identification and microcharacterization of proteins from electrophoretic gels: strategies and application (来自凝胶电 泳的蛋白质的质谦鉴定和微观表征策略和应用)Proteins 1998; Suppl 2:74-89JemalA, Thomas A， Murray T， Thun M Cancer Statistics (癌 症统计学)CA Cnacer J Clin 2002. 2002 52: 23- 47Kiera N. Berggren等.An improved formulation of Sypro Ruby protein gel stain: Comparison with the orginal formulation and with a ruthenium II tris(bathophenanthroline disulfonate) formulation (Sypro Ruby蛋白质凝胶染色的改良制剂，与orginal 制剂和钉 II tris (bathophenanthroline disulfonate)的比较)Proteomics 2002, 2,486-498Klose， J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues: A novel approach to testing for induced point mutation in mammals (通过结合的小 鼠组织的聚焦和电泳的蛋白质作图测试哺乳动物中诱导的点突变的 新方法)Humangenetik 1975 26， 231—243Knekt P， Hakulinen T， Leino A， Heliovaara M, Reimanen A， Stevens R. Serum albumin and colorectal cancer risk (血清白 蛋白和结直肠癌风险)Eur J Clin Nutr. 2000 Jun; 54 (6): 460-2.IanR. White等.A statistical comparison of silver and SYPR0 Ruby staining for proteomic analysis (用于蛋白质组分析的银和 SYPR0 Ruby染色的统计学比较)Electrophoresis 2004， 25， 3048-3054Lawson D， Harrison M， Shapland C. Fibroblast transgelin and smooth muscle SM22 alpha are the same protein, the expression of which is down-regulated in many cell lines (成纤维细胞 transgelin和平滑肌SM22 ot上相同的蛋白质其在许多细胞系中的 表达是下调的)Cell Motil Cytoskeleton. 1997; 38 (3): 250-7.Lawrie LC， Dundas SR， Curran S， Murray GI. Liver fatty acid binding protein expression in colorectal neoplasia (结直肠瘤 形成中的肝脂肪酸结合蛋白表达)Br J Cancer. 2004 May 17; 90 (10): 1955-60Liaudet-Coopman E， Beaujouin M, Derocq D， Garcia M， Glondu-Lassis M， Laurent-Matha V， Prebois C， Rochefort H， Vignon F. 组织蛋白酶D: newly discovered functions of a long-standing aspartic protease in cancer and apoptosis (癌 症和凋亡中长期存在的天冬氨酸蛋白酶的新发现的功能)Cancer Lett-ZOOS Jul 18;LinCS， Chen ZP， Park T， Ghosh K， Leavitt J Characterizationof the human L-plastin gene promoter in normal and neoplastic cells (正常和瘤细胞中人L-网素基因启动子的表征)J Biol Chem. 1993 Feb 5; 268 (4): 2793-801.Lin CS， Park T, Chen ZP， Leavitt J. Human plastin genes. Comparative gene structure, chromosome location, and differential expression in normal and neoplastic cells (人网 素基因。正常和瘤细胞中比较的基因结构，染色体定位和差异表达)J Biol Chem. 1993 Feb 5; 268 (4): 2781-92.LM. Franks, 亂 Teich Introduction to the cellular and molecular biology of cancer (癌症的细胞和分子生物学介绍)第 三版1997 Oxford University PressLynth HT， de la Chapelle A Hereditary colorectal cancer (遗传的结直肠癌)N. Engl. J. Med. 2003. 348 (10): 919-32Mann M, Talbo G. Developments in matrix-assisted laser desorption/ionization peptide mass spectrometry (基质辅助激 光解吸/离子化肽质谱的发展)Curr. 0pin Biotechnol 1996， 7 11Marcel YL， Kiss RS. Structure-function relationships of apolipoprotein A-I: a flexible protein with dynamic lipid associations.(阿朴脂蛋白A-I的结构-功能关系 一种具有动态脂 质关联的灵活蛋白)Curr 0pin Lipidol. 2003 Apr; 14(2): 151 一7. Review.McKerrow JH, Bhargava V， Hansel1 E, Huling S， Kuwahara T, Matley M， Coussens L， Warren R. A functional proteomics screen of proteases in colorectal carcinoma (结直肠癌中蛋白酶的功能 性蛋白质组筛选)Mol Med. 2000 May; 6 (5): 450-60.Miettinen M. Keratin 20: i咖unohistochemical marker for gastrointestinal, urothelial, and Merkel cell carcinomas (角 蛋白20:胃肠道，尿道上皮和梅克尔细胞细胞癌的免疫组织化学标记) Mod Pathol. 1995 May; 8 (4): 384-8.Mitchell BS. The proteasome-an emerging therapeutic target in cancer.(蛋白酶体-癌症中的新兴治疗目标)N Engl J Med. 2003 Jun 26; 348 (26): 2597-8.Moll R， Lowe A， Laufer J， Franke WW. Cytokeratin 20 in human carcinomas. A new histodiagnostic marker detected by monoclonal antibodies (人癌中的细胞角蛋白20。 一种通过单克隆抗体检测的新 组织学诊断标记)Am J Pathol. 1992 Feb; 140(2): 427-47.Moll R， Zimbelmann R, Goldschmidt MD, Keith M， Laufer J， Kasper M， Koch PJ, Franke WW. The human gene encoding cytokeratin 20 and its expression during fetal development and in gastrointestinal carcinomas.(编码细胞角蛋白20的人基因及 其在胚胎发育和胃肠道癌中的表达)Differentiation. 1993 Jun; 53 (2): 75-93.Nawrocki A， Fey SJ， Goffeau A， Roepstorff P， Larsen PM. The effects of transcription regulating genes PDRl, pdrl-3 and PDR3 in pleiotropic drug resistance (转录调节基因PDR1， pdrl-3和 PDR3在多效抗药性中的作用)Proteomics. 2001 Aug; 1 (8): 1022-32. Erratum in: Proteomics 2001 Oct;1 (10): 1340-1.Normanno N， De Luca A， Castaldo A， Casamassimi A, Di Popolo A， Zarrilli R，Porcellini A， Acquaviva AM， Avvedimento VE， Pignata S. Apolipoprotein A-I reverse transcriptase—polymerase chain reaction analysis for detection of hematogenous colon cancer dissemination(阿朴脂蛋白A-I逆转录酶-聚合酶链式反应分 析，用于检测造血性结肠癌传播)Int J Oncol. 1998 Sep; 13 (3): 443-7.O'Farrell， P. H. High resolution two—dimensional electrophoresis of proteins(蛋白质的高分辨率二维电泳)J. Biol. Chem. 1975 250， 4007-4021Oh—e H， Tanaka S， Kitadai Y， Shimamoto F， Yoshihara M，Haruma K. 组织蛋白酶D expression as a possible predictor of lymph node metastasis in submucosal colorectal cancer (组织 蛋白酶D表达作为粘膜下层结直肠癌中淋巴结转移的可能预报者)Eur J Cancer. 2001 Jan; 37 (2): 180-8,0tsuka M， Kato M， Yoshikawa T， Chen H， Brown EJ， Masuho Y， Omata M， Seki N. Differential expression of the L-plastin gene in human colorectal cancer progression and metastasis (人结 直肠癌进展和转移中L-网素基因的差异表达)Biochem Biophys Res Commun. 2001 Dec 14; 289 (4):876-81Rabilloud T.等，A comparison between Sypro Ruby and ruthenium II as fluorescent stains for protein detection in gels (作为凝胶中蛋白质检测的荧光染色的Sypro Ruby和钌II tris (bathophenanthroline disulfonate)之间的比较)Proteomics 2001， 1, 699-704Rabinovich GA. 半乳凝素-l as a potential cancer target (作 为潜在癌目标的半乳凝素-l) Br J Cancer. 2005 Apr 11 ; 92 (7) :1188-92. Review.Raffel 3\ Bhattacharyya AK, Gallegos A， Cui H, Einspahr JG， Alberts DS， Powis G. Increased expression of thioredoxin-l in human colorectal cancer is associated with decreased patient survival (人结直肠癌中硫氧还蛋白-l提高的表达与降低的患者存活 相关)J Lab Clin Med. 2003 Jul; 142 (1): 46-51.Reiner Westermeier Electrophoresis in Practice (实践中的 电泳)第二版1997Robert K. Scopes Protein Purification Principle and practice (蛋白质纯化原理和实践)第三版1993Sanjuan X， Fernandez PL, Castells A， Castronovo V， van den Brule F， Liu FT, Cardesa A， Campo E. Differential expression of 半浮L凝素3 and半孝L凝素1 in colorectal cancer progression (结直肠癌进展中半乳凝素 3和半乳凝素 1的差异表达) Gastroenterology. 1997 Dec; 113 (6): 1906-15.Schwerer MJ， Baczako K. lmmunohistochemical evaluation of keratin 20 expression in intestinal metaplasia types I to III(I型至III型肠组织转化中角蛋白20表达的免疫组织化学评价)J Clin Pathol. 1996 Oct; 49 (10): 791-4.Scott K， Weinberg C. 半乳凝素-l : a bifunctional regulator of cellular proliferation.(半乳凝素-l:细胞增殖的双功能调节 剂)Giycoconj J. 2004; 19 (7-9): 467-77. Review. Segrest JP， Li L， Anantharamaiah GM， Harvey SC， Liadaki O， Zaimis V, Structure and function of apolipoprotein A-I and high—density lipoprotein.(阿朴脂蛋白A-I和高密度脂蛋白的结合和功能)Curr OpinLipidol.2000 Apr; 11 (2) :105-15. Review.Shapland C， Hsuan JJ， Totty NF， Lawson D. Purification and properties of transgelin: a transformation and shape change sensitive actin-gelling protein (transgelin的纯化和特征转 化和形状改变敏感性的激动蛋白-凝胶化蛋白)J Cell Biol， 1993 Jun; 121 (5): 1065-73.Shields JM， Rogers-Graham K， Der CJ. Loss of transgelin in breast and colon tumors and in RIE-l cells by Ras deregulation of gene expression through Raf-independent pathways.(通过Raf-独立性途径的基因表达的Ras失调的乳房和结肠癌和RIE-l细胞中的 transgelin丟失)J Biol Chem. 2002 Mar 22; 277 (12): 9790-9. Epub2001 Dec 28.Shiwa M， Nishimura Y, Wakatabe R, Fukawa A, Arikuni H， Ota H， Kato Y, Yamori T. Rapid discovery and identification of a tissue-specif ic tumor biomarker from 39 human cancer cell lines using the SEU)I ProteinChip platform (使用SEU)I ProteinChip 平台从39种人癌细胞系中快速发现并鉴定组织特异性肿瘤生物标记)Biochem Biophys Res Commun， 2003 Sep 12; 309 (1): 18-25.Storch J， Thumser AE. The fatty acid transport function of fatty acid-Mnding proteins (脂肪酸结合蛋白的脂肪酸转运动能) Biochim Biophys Acta. 2000 Jun 26; 1486(1 ):28-44. Review.Sun D， Zhao YY， Dai SP， Fang K， Dong LY, Ding Q. Cloning and analysis of human alpha—I B glycoprotein precursor gene: a novel member of human immunoglobulin superfamily (人cx-I B 糖蛋白前体基因的克隆和分析人免疫球蛋白超家族的新成员)Yi Ch磁Xue Bao. 2002 Apr; 29 (4): 299-302. Japanese.Talieri M， Papadopoulou S， Scorilas A， Xynopoulos D， Arnogianaki N， Plataniotis G，Yotis J， Agnanti N.组织蛋白酶B and组织蛋白酶D expression in the progression of colorectal adenoma to carcinoma (结直肠腺瘤至癌的进展中的组织蛋白酶B和 组织蛋白酶D表达)Cancer Lett. 2004 Mar 8; 205 (1): 97-106.Tom Berkelman， Tirra Stestedt 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients (4吏用固定pH梯度的2-D电'泳) Principles& Methods 1998Tumminello FM， Gebbia N， Pizzolanti G, Russo A， Bazan V, Leto G. 组织蛋白酶D content in colorectal cancer. Correlation with组织蛋白酶D activity and other biological parameters: a preliminary r印ort (结直肠癌中的组织蛋白酶D含量。组织蛋白酶 D和其他生物参数的相关性初步报告)Oncology. 1995 May-Jun; 52 (3): 237-42.van den Brule F， Califice S， Castronovo V. Expression of 半乳凝素s in cancer: a critical review (癌症中的半乳凝素表达 关键的综述)Giycoconj J. 2004; 19 (7-9): 537-42. Review.Wang Y， Morrow JS. Identification and characterization of human SLP-2， a novel ho迈ologue of stomatin (band 7.2b) present in erythrocytes and other tissues (人SLP-2的鉴定和表征，SLP-2是红血球和其他组织中存在的stomatin (7. 2b条带)的新同源物)J Biol Chem. 2000 Mar 17; 275 (11): 8062-71.Wildi S， Kleeff J， Maruyama H， Maurer CA， Friess H, BuchlerMW， Lander AD， Korc M. Characterization of cytokeratin 20 expression in pancreatic and colorectal cancer (胰腺和结 直肠癌中细胞角蛋白20表达的表征)Clin Cancer Res. 1999 Oct; 5 (10) :2840-7.Yamazaki T， Kanda T， Sakai Y, Hatakeyama K. Liver fatty acid—binding protein is a new prognostic factor for hepatic resection of colorectal cancer metastases (肝月旨肪酸结合蛋白 是结直肠癌转移肝切除的新预后因子)J Surg Oncol. 1999 Oct; 72 (2) :83-7.Yergey A. L， Coorssen J丄，Backlund P， S. Jr.等，De novo sequencing of peptides using MALDI/T0F-T0F (使用MALDI/T0F-T0F 的肽的从头测序)J Am Soc Mass Spectrom 2002 Jul! 13 (7): 784-91Yun K， Merrie AE， Gunn J， Phillips LV， McCaII几.Keratin 20 is a specific marker of sub迈icroscopic lymph node metastases in colorectal cancer: validation by K-RAS mutations (角蛋白 20是结直肠癌中亚微观淋巴结转移的特异性标记通过K-RAS突变证 实了 ) J Pathol. 2000 May; 191(1):21-6.Zavrski I， Jakob C， Schmid P, Krebbel H, Kaiser M， Fleissner C， Rosche M， Possinger K， Sezer 0. Proteasome: an emerging target for cancer therapy (蛋白酶体，用于癌症治疗的新兴目标) Anticancer Drugs. 2005 Jun; 16(5) 475-81. Review.Zheng J， Rudra-Ganguly N， Miller GJ, Moffatt KA， Cote RJ， Roy-Burman P. Steroid hormone induction and expression patterns of L-plastin in normal and carcinomatous prostate tissues (正 常和癌性前列腺组织中L-网素的类固醇激素诱导和表达模式).AmZhou Q， Toivola DM, Feng N， Greenberg HB， Franke WW, Oman/ MB. Keratin 20 helps maintain intermediate filament organization in intestinal epithelia (角蛋白 20帮助维持肠上 皮细胞中的中间丝状体组织化)Mol Biol Cell. 2003 Jul; 14 (7): 2959—71. Epub 2003 Apr 4.http: //www, lerner. ccf. org/services/storm/ http: //www, humpath. com/article. php3 idarticle=205 http: //www, medinnovation. de/background/hsa. htm
权利要求
1. 诊断哺乳动物如人结直肠癌的方法，该方法包括测定来自所述哺乳动物的生物样品中至少一种标记蛋白的存在，不存在或表达水平，其中标记蛋白选自下组·表1中限定的蛋白质；和·是表1蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表1的蛋白质具有至少80％的序列同源性，附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90，60S酸性核糖体蛋白和/或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不是HSP90，60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
2. 根据权利要求1的方法，其中该方法包括建立至少一种标记蛋 白提高的表达(上调的标记蛋白)，该标记蛋白选自 表l中限定的和标记"上调"的蛋白质；和 是表l中限定蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表 1中限定的蛋白质具有至少80%序列同源性。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中生物样品选自尿液，粪便， 血液，唾液，淋巴液和组织。
4. 根据权利要求3的方法，其中组织取自结肠和/或直肠。
5. 测定哺乳动物如人结直肠癌倾向性的方法，该方法包括测定来 自所述哺乳动物的生物样品中至少一种标记蛋白存在，不存在或表达 的水平，其中标记蛋白选自下组 表l中限定的蛋白质；和 是表1蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表1的蛋 白质具有至少80%的序列同源性，附带条件是当至少 一种标记蛋白是HSP90, 6 OS酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
6. 测定人结直肠癌倾向性的方法，该方法包括a) 测定来自人的生物样品中至少一种标记蛋白提高的表达，所述 标记蛋白选自下组i)表l中限定的上调蛋白，和H)是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白，使得与i)的蛋白 质具有至少80%的序列同源性；b) 测定来自人的生物样品中至少一种标记蛋白降低的表达，所述 标记蛋白选自下组i)表l中限定的下调蛋白，和H)是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白，使得与i)的蛋白 质具有至少80%的序列同源性；或c) a)和b)中测定的结合。附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90，60S酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
7. 根据权利要求l， 5或6任一项的方法，其中至少一种标记蛋 白选自下组a )相对于对照在来自所述生物样品的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶上以 显著较低或显著较高含量存在的一种或多种蛋白质；b )来自所述生物样品的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶上存在而对照的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶上不存在的一种或多种蛋白质；和c )来自所述生物样品的蛋白质的聚丙烯酰胺上不存在而对照的蛋 白质的聚丙烯酰胺上存在的一种或多种蛋白质。
8. 治疗哺乳动物如人结直肠癌的方法，包括改变至少一种标记蛋 白的表达，该标记蛋白选自下组a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性，附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90，60S酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
9. 治疗哺乳动物如人结直肠癌的方法，包括将至少一种选自以下 的化合物给药于人a) 表l中限定的蛋白质；b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性；c) 具有与a)和/或b)中蛋白质相同功能的蛋白质；d) 编码a) ， b)或c)中蛋白质的核苷酸序列；e) a) ， b)或c)中蛋白质的抗体；f) 能够结合a) , b)或c)中蛋白质的核酸片段；和g) 能够结合a) ， b)或c)中蛋白质的化合物， 附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90，60S酸性核糖体蛋白和/或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
10. 预防或延迟哺乳动物例如人结直肠癌发作的方法，包括将以 下的物质给药于人a) 表l中限定的蛋白质；b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性；c) a)和b)中限定蛋白质的模拟物；d) 编码a)和/或b)中蛋白质的核苦酸序列；e) a)和/或b)中限定蛋白质的抗体；f )能够结合a)和/或b)蛋白质的核酸片段；和/或 g)能够结合a)和/或b)中限定蛋白质的化合物， 附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
11. 测定试剂在结直肠癌治疗中具有治疗效果可能性的方法，包 括测定来自以下的一种或多种蛋白在将测试模型暴露于所述试剂之前和之后的相对表达水平a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性，附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90, 60S酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
12. 测定化合物在结直肠癌治疗中效果的方法，包括测定来自以 下的一种或多种蛋白的蛋白表达水平a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性，附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90，60S酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
13. 测定结直肠癌治疗中所用化合物效果水平的方法，包括测定 来自以下的一种或多种蛋白在将测试模型暴露于所述试剂之前和之后 的表达水平a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性，附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90，60S酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1组A的蛋白质。
14. 测定患有或易患结直肠癌的哺乳动物如人结直肠癌的性质或 诱因的方法，包括建立来自以下的蛋白质相对于模型的表达水平a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性，附带条件是当至少一种标记蛋白是HSP90，60S酸性核糖体蛋白和 /或来自表1组A的蛋白质时，从该组选择至少再一种标记蛋白，其不 是HSP90， 60S酸性核糖体蛋白或来自表1組A的蛋白质。
15. 选自以下的基本上纯的蛋白质a) 表l的蛋白质；和b) 与a)中蛋白质具有至少80%序列同源性的蛋白质， 附带条件是从保护中排除HSP90和60S酸性核糖体蛋白。
16. 包括编码表1中限定的蛋白质或与其具有至少80%序列同源性的蛋白质的核苷酸序列的核酸片段。
17. 与根据权利要求16的核酸片段或其部分或与其互补链杂交的 核酸片段。
18. 根据权利要求16-17任一项的核酸片段用于检测选自以下的 肽的存在的用途a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性。
19. 能够结合选自以下的蛋白质的抗体a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性。
20. 根据权利要求19的抗体，其是多克隆抗体。
21. 根据权利要求19的抗体，其是单克隆抗体。
22. 根据权利要求19至21任一项抗体用于检测选自以下的蛋白 质的存在的用途a) 表l中限定的蛋白质；和b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性。
23. 用于诊断哺乳动物如人结直肠癌或结直肠癌遗传倾向性的测 试盒，包括a) 结合工具，其特异性结合至少一种选自以下的标记蛋白i) 表l中限定的蛋白质；和ii) 是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与其具有 至少80%序列同源性；或该结合工具是至少一种所述标记蛋白的抗体， 能够结合至少一种所述标记蛋白的核酸片段，或能够结合至少一种所 述标记蛋白的化合物；b) 检测结合工具与至少一种标记蛋白或与至少一种核酸片段结合 的工具，如果存在结合，或者为检测结合水平的工具，和c) 用于关联的工具，关联与所述结合工具的结合，如果存在结合， 或者关联结合水平，是否表示个体哺乳动物具有显著较高的患结直肠 癌的可能性或患结直肠癌遗传倾向性。
24. 测定物质效果的方法，该方法包括使用哺乳动物，例如人， 其已经使用根据权利要求1至7任一项的方法建立为具有患结直肠癌 的高可能性或患结直肠癌遗传倾向性的个体，该方法包括将物质给药 于个体并测定该物质的效果。
25. 药物组合物，其包括a) 能够调节核酸片段表达的物质，该核酸片段编码选自以下的蛋 白质的至少一部分i) 表l中限定的蛋白质；和ii) 是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与i)的蛋 白质具有至少80%的序列同源性；b) 选自以下的标记蛋白i) 表l中限定的蛋白质；和ii) 是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与i)的蛋 白质具有至少80%的序列同源性；c) 选自以下的蛋白质的衍生物，同源物或模拟物i)表l中限 定的蛋白质，和ii)是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使 得与i)的蛋白质具有至少80%的序列同源性；d) 选自以下的蛋白质的抗体i)表l中限定的蛋白质，和ii)是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与i)的蛋白质具有 至少80%的序列同源性；e) 能够结合选自以下的标记蛋白的核酸片段i)表l中限定的 蛋白质，和ii)是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与 i)的蛋白质具有至少80。yi的序列同源性；和/或f) 能够结合选自以下的标记蛋白的化合物i)表l中限定的蛋 白质，和ii)是i)中蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与i ) 的蛋白质具有至少80%的序列同源性。
26. 根据权利要求25的药物组合物，用作药物，如用于治疗或预 防结直肠癌。
27. 选自以下的化合物的用途a) 表l中限定的蛋白质；b) 是表l蛋白质的修饰物或衍生物的蛋白质，使得与表l的蛋白 质具有至少80%的序列同源性；c) 具有与a)和/或b)中蛋白质相同功能的蛋白质；d) 编码a) , b)或c)中蛋白质的核苷酸序列；e) a) ， b)或c)中蛋白质的抗体；f) 能够结合a) ， b)或c)中蛋白质的核酸片段；和g) 能够结合a) ， b)或c)中蛋白质的化合物，用于制造治疗或 预防结直肠癌的药物。
28. 构建表达至少一种蛋白的细胞或细胞系的方法，该蛋白选自 来自表l的蛋白，表l蛋白的修饰物和衍生物，使得与表l的蛋白质 具有至少80%(例如90%或95%)同源性；例如，通过将编码所述蛋白 的至少一种DM序列引入细胞中，如自身的细胞。
29. 根据权利要求28的构建细胞或细胞系的方法，其中修饰细胞 来避免被免疫系统识别为外源物质。
30. 根据权利要求28的构建细胞或细胞系的方法，其中引入至少 一种调控元件来调节引入的DNA序列的活性。
31. 根据权利要求28的构建细胞或细胞系的方法，其中细胞是结肠上皮细胞，直肠上皮细胞，干细胞或多能性细胞。
32.可通过权利要求28的方法获得的细胞或细胞系。
全文摘要
本发明涉及诊断哺乳动物如人结直肠癌(CRC)的方法，该方法包括测定来自所述哺乳动物的生物样品中至少一种标记蛋白的存在，不存在或表达水平。证明了来自正常和肿瘤组织的结肠活检组织的代谢标记结合之后的2维凝胶电泳和质谱是鉴定CRC发展中涉及的标记蛋白质的有力工具。
文档编号G01N33/574GK101283280SQ200680037570
公开日2008年10月8日 申请日期2006年8月17日 优先权日2005年8月18日
发明者P·M·拉尔森, S·J·费伊 申请人:Zadec私人有限公司