早期癌症肿瘤标记的制作方法

专利名称：早期癌症肿瘤标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测早期癌症的肿瘤标记。
背景技术：
癌症的发展或扩大的程度可被描述为早期癌症、中期癌症和晚期癌症。其中，早期癌症一般被认为是“癌症进展的程度是肿瘤小、转移少并且能够永久性治愈或通过治疗能够长期抑制的癌症”。
早期癌症基本上是没有症状的。所以，当试图近乎完全地检测早期癌症时，要检测的目标是没有症状的对象。人们将目的是从宽范围的无症状对象中寻找受特殊疾病影响的患者或者将该宽范围缩小到需要进一步辅助试验的患者的试验一般称之为筛选。通常在筛选中，试验对象的数量非常大。为了测试许多对象，这种筛选首先并且最重要的是应该方便并且经济。尽管肿瘤标记试验是很少伤害患者的适当的测试方法，但目前人们认为通过测定肿瘤标记来检测早期癌症是不可能的。
Midkine(本文以后称之为”MK”)是发现可作为对视黄酸应答的基因产物的增生和分化因子，并且是富集碱性氨基酸和半胱氨酸的13-kDa多肽(Kadomatsu，K.等Biochem.Biophys.Res.Commun.，1511312-1318；Tomomura，M.等J.Biol.Chem.，26510765-10770，1990)。在各种恶性肿瘤中MK的水平相比于周围的正常组织升高，这一事实显示了MK在癌发生中起着重要作用。所以，有人已经建议用MK基因作探针的Northern印迹法(未审公开的日本专利申请号(JP-A)Hei6-113898)和含抗-MK蛋白抗体的癌症诊断剂(JP-A Hei6-172218)来诊断癌症。但是，这些公开的专利申请既没有描述也没有暗示MK基因或MK蛋白可用于早期癌症的检测中。所以，Ye等已经报导了在人体结肠直肠癌的腺瘤阶段，癌变前组织的MK表达升高(Ye C.等Br.J Cancer.，79，179-183，1999)。但是，在这篇报导中没有描述或暗示有关的早期癌症检测的任何内容。
所以，期望发现可由早期癌症状况进行检测的肿瘤标记和开发用于检测这种标记的试验。

发明内容
本发明的目的是提供一种用作早期癌症标记的新的多肽。另外，本发明的另一个目的是提供使用这种多肽作为指标检测早期癌症的方法。而且，本发明的又一目的是提供可检出这种多肽的用于早期癌症的外部诊断剂。
本发明的发明人员发现在肝细胞癌的早期用抗-MK抗体所检出的肝细胞癌患者的MK水平与健康对象或肝炎患者的相比，不仅在肝细胞癌组织中，而且在血液和尿液中都有显著提高。即使在胃癌中，也发现血液和尿液中MK水平在早期也类似于肝癌显著升高。而且，在许多类型的癌症如食管癌、十二指肠癌、结肠癌、胆管癌和胆囊癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌和乳腺癌中，都可以在它们的早期观察到血清(serum)MK水平的显著升高。这表明MK具有对于检测未特别指明癌症的公知肿瘤标记中所看不到的非常广谱的特异性。
按照这些发现，本发明人说明了MK作为早期癌症标记的实用性。而且，使用本发明人所开发的使用酶免疫测定(EIA)的简单而高度敏感的一步三明治(sandwich)方法通过对各种癌症早期患者体液中出现的MK水平的高敏感度的检测而使得早期癌症的筛选诊断成为可能。EIA能够完全自动地并且是非常适合用作目的为检出早期癌症的MK测定法。
也就是说，本发明涉及早期癌症的检测方法，或者早期癌症的诊断方法和用于这些方法的诊断剂和试剂盒，具体如下(1)一种检测早期癌症的方法，包括(a)在生物样本中测定midkine和/或其片段，以及(b)将步骤a)中所得到的测定水平与健康对象的测定水平相比较。
(2)按照(1)的方法，其中早期癌症是胃癌。
(3)按照(2)的方法，其中胃癌在第I阶段(stage I)。
(4)按照(1)的方法，其中早期癌症是肝细胞癌。
(5)按照(4)的方法，其中肝细胞癌是在第I阶段。
(6)按照(1)的方法，其中早期癌症是肺癌。
(7)按照(6)的方法，其中肺癌是在第I阶段。
(8)按照(1)的方法，其中生物样本是血清或尿。
(9)可识别midkine和/或其片段的抗体在早期癌症检测中的应用。
(10)早期癌症的诊断剂，包括可识别midkine和/或其片段的抗体。
(11)用于检测生物样本中早期癌症的试剂盒，其中该试剂盒(a)包括容器，该容器中装有可与至少一种midkine和/或其片段的表位(epitope)特异性结合的抗体，和(b)测定生物样本中midkine和/或其片段的存在。
(12)按照(11)的试剂盒，其中抗体被吸收在固体上。
(13)一种评价癌症预后的方法，包括a)测定生物样本中的midkine和/或其片段，以及b)将步骤a)中得到的测定水平与癌症预后相关联(correlating)。
(14)按照(13)的方法，其中癌症是胃癌、肝细胞癌或肺癌。定义除非另有说明，说明书中所用下列术语有下列含义。
“早期癌症(early cancer)”指的是没有侵袭到周围组织的、限制在发生部位(粘膜内)的肿瘤，或者是已经侵袭但侵袭范围限制在局部区域的肿瘤。尤其是，没有表现出侵袭的肿瘤是本发明的重要检测目标，因为它们很难被公知的肿瘤标记检测出。这种定义适用于几乎所有癌症如皮肤癌、口腔癌、呼吸道癌、胃肠道癌、子宫颈癌、卵巢癌、胆囊癌、膀胱癌等癌症。早期癌症包括按照TNM分类的0阶段(原位癌)和第I阶段。在这些癌症阶段，没有血管内的侵袭或远距离的转移，并且仅切除局部肿瘤就会完全康复。
在本发明中，“肿瘤标记(tumor marker)”被定义为由肿瘤细胞或与肿瘤细胞反应的细胞所产生的物质，它可以在组织、体液、分泌物等中发现，该物质能显示肿瘤的某些特征，如存在、特点或扩展。
术语“MK”包括全长MK蛋白和含有具有MK生物活性的任意长度的氨基酸序列的片段。也包括突变MK如可表达癌症特异性的缺少N-区的突变MK(Kaname T.等Biochem.Biophys.Res.Commun.，219256-260，1996)。在这篇描述内容中，由遗传工程技术所生产的MK和化学合成的MK可以互换使用。可编码人全长MK的DNA序列是公知的(US 5,461,029)。MK的生物活性不仅包括MK对细胞的生理作用，而且也包括与抗-MK抗体的免疫反应性。
“敏感性(sensitivity)”是指肿瘤存在组中阳性测定结果所占的比例，也称之为阳性比例(positivity ratio)。
“特异性(specificity)”是指没有肿瘤存在的组中阴性测定结果所占的比例，也称之为阴性比例。
“生物样本(biological sample)”是指能够从有机体获得的样本。更具体地说，例如是血液、血清、尿液、其他分泌物等。在这些生物样本中，尿液可用作具有低侵袭性的样本。因为尿液体积变化相当大，所以为了更精确地比较尿液成分的浓度，希望对尿液体积进行校正。肌酸酐校正等都是校正尿液体积的公知方法。
“阶段分类(stage classification)”一般是指通过用肉眼可观察到的进展而对癌症进行的分类，国际上普遍使用TNM分类(tumor-node-metastasisstaging)。本发明所用的“阶段分类”对应于TNM分类(“Rinsho，Byori，Genpatsusei Kangan Toriatsukaikiyaku (Clinical and Pathological Codes forHandling Primary liver Cancer)”第22页Nihon Kangangaku Kenkyukai(Liver Cancer Study Group of Japan)版本(第3次修订本)，Kanehara Shuppan，1992)。
而且，在本发明中，“癌症的检测(detection of cancer)”是指高可能性地判断受试验者体内癌症的存在。与检测成对比的是，筛选是表示测试的术语，特别地其是以任意组为目标，目的是缩小很可能患癌症的对象的范围。以特殊对象为目标的癌症检测称之为诊断，而筛选是以任意组为目标。在本发明中，筛选和诊断只是目标不同，本发明的检测方法包含了这二者。
因为直到癌症生长到一定大小时，血液中癌细胞所产生的标记含量才不同于健康对象的标准值，所以通过血清标记的量的增长来检测早期癌症一般被认为是不可能的，这就象上文所提到的那样。
由于在结肠直肠癌的癌变前期的MK在mRNA和蛋白质水平都有高水平的表达(Ye C.等Br.J Cancer.，79179-183，1999)，所以发明人对各种类型的癌症患者的血液MK的水平进行了调查研究，发现大多数患者(87％)相比于健康对象，血液MK水平显著升高。87％相对于当前的肿瘤标记是相当高的数值。在癌症组织中所表达的MK可能被分泌到血流中，所以认为这导致了血液MK水平的增加。在肝细胞癌、胃癌、肺癌等中，血液MK水平在癌症早期都升高。
在第I阶段，肝细胞癌或肺癌患者的血液MK水平与健康对象血液中的标准值相比已经显著升高，并且在第II到IV阶段还会持续升高。相比之下，在第I阶段的胃癌患者中，该水平比健康对象的标准值明显升高，但从第II阶段和之后，无论什么阶段，MK水平几乎都保持相同。所以，这表明通过测定多种癌症包括肝细胞癌、肺癌或胃癌的MK而归类为第I阶段的早期癌症的检测是可能的。而且，MK的测定不仅可以检测早期癌症，而且也可以检测不同阶段的癌症，与癌症的扩展和MK的积累无关。这一特点对肿瘤标记是非常重要的，因为只在癌症早期发现的肿瘤标记会带来忽略进展癌症(progressed cancer)的危险。
肿瘤标记的实用性一般可以通过可确定癌症患者是否为阳性的“敏感度”和可确定非癌症患者是否为阴性的“特异性”来评价。但是，各种公知的肿瘤标记在敏感度和选择性上都是有局限性的。
就MK而言，它在血液和尿液中的水平在如实施例中所述的各种未特别指出类型的癌症早期都比健康对象的标准水平高。这可以说明MK在非特别指出类型的癌症中有广谱特异性并且有高敏感性。对广泛筛选不论何种类型的器官的早期癌症来说，对指定类型的癌症进行检测的高敏感性和特异性以及在检测未特别指出类型癌症中的广谱特异性都是所希望具有的。MK被认为具有这种筛选所需的敏感性和特异性。
而且，基于本发明的早期癌症检测方法增加了(augment)已知肿瘤标记的敏感性和特异性的局限。已知组合多种肿瘤标记能够提高敏感性同时保持特异性不变。一般将多种肿瘤标记组合以改进敏感性和特异性的筛选方法称之为组合测定法。
在本发明中，对各种类型的恶性肿瘤的早期检测能够通过在无症状的对象所进行的筛选中使用EIA等而测量测试对象的血液和尿液中的MK水平来检测。而且，通过结合其它肿瘤标记的测定，可以提高敏感性和特异性。
当进行组合测定时应当考虑两点。第一点是肿瘤标记组合的选择。一旦决定肿瘤标记组合，接下来考虑的就是怎样设置截止数值(cut-off value)。
肿瘤标记选择的要点是选择相互之间发生关联的可能性最小的组合。例如，AFP和PIVKA-II，其是肝脏肿瘤标记，具有低关联性，并且通过设置PIVKA-II截止数值为0.1Au/ml，它们具有接近100％的特异性。同时，CA19-9和CA-50的组合(它们是胰腺癌标记)得到正确的阳性状况一致而错误的阳性状况不重叠的组合，这些使其成为无效组合。
一旦选择好肿瘤标记的组合，下一步就是设置截止数值。截止数值是一个影响敏感度和特异性的重要因素。一般，肿瘤标记的敏感度和特异性是一种协调(trade-off)关系，但本领域普通技术人员能够按照下述参考文献(例如，Kawamura，T.Tumer Marker，Nippon Rinsho 541649-1653，1996)设置适当的截止数值。
在理想的肿瘤标记中，对肿瘤组和对非肿瘤组的测定值是不重叠的，并且这些测定值能够确定是否存在肿瘤。但是，至今为止这种理想的肿瘤标记并没有被开发出来。所以，必需设定最适合于鉴别和分辨肿瘤组和非肿瘤组的截止数值。
在优选的实施例中，截止数值是当用固相抗体温育来自没有癌症的患者样本时所得到的信号的平均值。正常情况下，产生相对于预定截止数值的标准偏差为三倍的信号的样本被认为是癌症阳性。经常用对健康对象测定水平的分布中的95％置信区间的上下限(标准范围)作截止数值。但是，设置标准范围没有考虑疾病状态的分布。所以，优选通过清楚定义要用试验分辨的疾病状态而确定截止数值，然后收集疾病组和非疾病组的恒定数目(constant number)，测定它们，并考虑两组测定值的普遍率(进行测定时的状况)和分离程度(试验的可分辨性)。用这种方法所确定的得到具有高于截止数值的信号的样本被认为是癌症阳性。
而且，在手术除去肿瘤后，肝细胞癌患者中血液MK显著降低。这表明MK不仅可以用于癌症的诊断，而且也可以作为监控病程的指示剂，作为预后因素或用于监控复发。预后(prognosis)是指患者对治疗的反应。所以，如果在肿瘤治疗前和治疗后测定到MK数值的降低，并且该数值的下降得到确认后，人们能够推测所进行的治疗是有效的。而且，如果所测定的MK数值下降到健康对象的水平，人们能够推测肿瘤治疗已经成功。肿瘤治疗除了手术切除外还包括放射疗法、免疫疗法、化学疗法等。
在其他实施方案中，MK能够用作某些类型的癌症如肝细胞癌的标记。血液MK水平会随着肝细胞癌阶段的进展而升高。对癌症诊断而言，顺序(随着时间)多次进行上述测定，评价MK水平的变化。例如，在6个月到1年内每24小时到72小时进行这种测定，之后如果需要的话再进行测定。一般来说，患者体内的癌症不断发展，并且其中的可由抗体检测的MK值也随时间不断增长。
在本发明中，生物样本中的MK水平能够通过使用特异性的多克隆或单克隆抗MK的抗体的乳胶凝集、EIA或RIA方法、FIA、化学发光免疫测定法或ECLIA方法等来测定。在这些方法中，EIA是优选作为本发明中测定MK的测定法。因为EIA使用酶作标记，所以EIA比伴有半衰期和放射活性废物问题的RIA更容易操作。而且，理论上，EIA的敏感度比RIA更能提高。
此外，关于EIA，各种测定系统对本领域普通技术人员都是已知的(例如，参见Harlow和Lane，抗体实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。尤其是，为MK的测定已经开发出一种优异的EIA方法(JP-A Hei10-160735)，本领域普通技术人员能够根据需要按照测定目的而改进这种公知方法。
在相关的实施方案中，使用将抗体固定在固体膜如硝化纤维上的流通式(flow through)或带状(strip)试验类型测定法进行测定。在流通式试验类型中，当样本通过该膜时，样本中的MK与定相在固体上的抗体(solid phasedantibody)结合。接着，当含有第二种抗体的溶液通过该膜时，所标记的第二种抗体结合抗体-多肽络合物。然后，如上所述测定所结合的第二种抗体。在带状试验类型中，将含结合抗体的膜的一端浸入含样本的溶液中。样本通过膜移动从而通过含第二种抗体的区域，然后移向定相在固体上的抗体区。在定相在固体上的抗体区中第二种抗体的浓度表示癌症的存在。一般在这个区域中第二种抗体的浓度会产生图案如可见的线。没有这种图案的表示阴性结果。通常，选择固定在固体膜上的抗体量是为了产生视觉上可分辨的图案。在这些情况中，生物样本中的MK水平在两种抗体的三明治测定法中是足以引起阳性信号的。固定在固体膜上的抗体量优选为约25ng到1μg，更优选在大约50ng到500ng。这类试验一般用非常小量的生物样本进行操作。
在流通式类型或带状试验类型测定形式(format)中，通过信号强度的自动读数进行定量测定是可能的。或者，能够调节敏感度以使阳性结果只在MK以特定浓度或更高时出现。通过敏感度的调整，能够不用特殊装置通过视觉确定阳性结果。在这类型测定形式中调整敏感度的方法是本领域技术人员熟知的技术。例如，通过调整所用抗体量来改变敏感度。
当然，许多其他测定方案也适合于使用本发明的抗原或抗体，所以上述方法仅仅是用来举例的。
在上述每种类型的测定方案所需的MK抗体和用作标准样本的MK可用作早期癌症检测试剂盒。本发明的早期癌症检测试剂盒包括至少一种抗-MK抗体和用作标准样本的MK。另外，本发明的检测试剂盒可以结合有检测标准组份所需的酶底物、阴性对照和说明书等。当在如EIA方法中使用检测试剂盒时，前面所提到的抗MK抗体能够预先与固体支持物结合。一般将反应容器、珠或磁性颗粒等作为固体相。通过事先将抗MK抗体与固体相结合，EIA不仅能够容易操作，而且还可以自动进行。
在上述方法中所用的抗MK抗体能够用各种本领域技术人员熟知的技术生产(例如，参见Harbor和Lane，抗体实验室手册，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。抗MK的抗体可以是多克隆的或单克隆的抗体。例如，特异性识别MK的单克隆抗体如本发明人的日本专利申请号2000-272199(2000年9月7日申请)可以用于本发明。含抗原结合位点的抗体片段也可以用作抗MK抗体。而且，这种抗体可以是单股的、嵌合的、CDR-接枝的或人化的抗体。这种抗体可以用本文所述的方法或本领域技术人员所熟知的其他方法生产。
MK可用作生产本发明抗MK抗体的免疫原或用作标准物。为这些目的所用的MK包括生物衍生的MK、重组MK或化学合成MK，以及具有MK生物活性的片段。得到MK作为重组体的方法是公知的(JP-A Hei9-95454)。
本说明书中所引用的所有现有技术的公开出版物在本文都被作为参考文献。
附图简述

图1显示了用实施例2的(1)所述的一步三明治方法对76名第I到IV阶段的肝细胞癌患者(第I阶段7名患者；第二阶段19名患者；第III阶段23名患者和第IV阶段27名患者)、7名病毒性肝炎患者作比较对照和135名健康对象作对照(**p＜0.01)的血清MK水平的测定结果。误差条(error bar)表示标准误差。
图2类似地显示了用实施例2的(2)所述的一步三明治方法对76名第I到IV阶段的肝细胞癌患者、7名病毒性肝炎患者作比较对照和376名健康对象作对照(**p＜0.01，Mann-Whitney U-试验)的血清MK水平的测定结果。误差条表示标准误差。
图3相似地显示了使用Eitest PIVKA-II(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)对第I到IV阶段的肝细胞癌患者血清中的PIVK-II水平的测定结果。误差条表示标准误差。
图4是相似地显示了使用α-feto RIA珠(Dainabot)对第I到IV阶段的肝细胞癌患者的血清中的AFP水平的测定结果(*p＜0.01)。误差条表示标准误差。
图5类似地显示了用实施例2的(1)所述的一步三明治方法对72名第1到7阶段的胃癌患者和135名健康对象的血清MK水平的测定结果。误差条表示标准误差。
图6类似地显示了用实施例2的(2)所述的一步三明治方法对72名第1到7阶段的胃癌患者和376名健康对象的血清MK水平的测定结果(**p＜0.01，Mann-Whitney U-试验)。误差条表示标准误差。
图7类似地显示了使用CEA RIA珠(IRMA方法)(Dainabot)对72名第1到7阶段的胃癌患者血清中的CEA水平的测定结果。误差条表示标准误差。
图8类似地显示了使用Centocor CA19-9试剂盒(IRMA方法)(Centocor)对72名第1到7阶段的胃癌患者血清中的CA19-9水平的测定结果。误差条表示标准误差。
图9显示了72名癌症患者(胃癌24名患者；肝细胞癌24名患者；结肠癌24名患者)和50名健康对象的尿液MK水平的分布，其是用肌酸酐数值校正过的(p＜0.01；统计软件StatView-J5.0；使用Mann-Whitney U-试验)。
图10显示了在第1-7阶段的3名胆管癌、3名乳腺癌、6名结肠癌、3名食管癌、1名胆囊癌、10名肝细胞癌、3名胰腺癌、7名直肠癌、28名胃癌和1名甲状腺癌患者共65名患者的尿液MK水平的结果，其是用肌酸酐数值校正过的(*p＜0.05，**p＜0.001)。误差条表示标准误差。
图11显示了肝细胞癌部分切除对血清中的MK数值的影响。含点的条表示肿瘤手术前的数值(手术前)，实体黑条表示肿瘤切除后的数值(第7天)。
图12比较了各种类型的癌症患者血清中MK的水平。粗线表示135名健康对象血清中MK水平的平均值，点线表示0.50ng/ml截止数值。各种类型的癌症名称下所显示的数字表示患者数、中间值和25％到75％的置信区间。Asterisks表示与健康对象相比的显著差异(significant difference)(Mann-Whitney U-试验)。*p＜0.05，**p＜0.01。
实施本发明的最佳方式下面参考实施例具体详细说明本发明，但不能认为是对本发明的限制。
抗-人MK多克隆抗体的生产按照JP-A Hei 9-95454的实施例1中所述的方法生产免疫接种所用的MK蛋白和用作标准物的重组MK蛋白。
将含有人MK的ORF的cDNA导入有Pichia酵母作为宿主的pHIL-D4表达载体。将这种表达载体转染到Pichia酵母G115(Pichia pastoris G115；Research Corporation Technologies)。通过组氨酸和G418选择获得表达克隆的MK。在肝素柱上用离子交换色谱层析法和亲和色谱层析法纯化MK。纯化的MK蛋白的神经营养活性相当于重组L-细胞所生产的鼠MK的活性。
每两周对兔和鸡进行免疫接种注射，给兔接种6次，给鸡接种8次。
具体来说，对兔开始皮下注射400μg混有等量弗氏完全佐剂(Freund’scomplete adjuvant)的MK，从第二次之后，每次皮下注射400μg混有弗氏不完全佐剂的MK。对鸡来说，步骤类似于兔的，除了每次注射的是100μgMK。
从兔得到的抗血清(anti-sera)通过硫酸铵沉淀，然后用蛋白A柱分离IgG，而且将其用已经将MK固定在Affigel-10TM(BioRad)的MK亲和柱亲和纯化，获得纯化的兔抗-人MK-特异性抗体。另一方面，用硫酸铵沉淀从鸡获得的抗血清，然后用MK亲和柱亲和纯化得到纯化的鸡抗-人MK-特异性抗体。这些抗体都用于蛋白质印迹分析法中测定人MK的特异性。
通过一步三明治方法测定MK(1)将兔的抗-人MK-抗体溶于(5.5μg/ml)含0.1％NaN3的50mM PBS(pH7.2)中，将该溶液的50μl等份放入微量滴定板(polysorp plates，Nunc)的每个孔中。将该板在室温下保持16小时，以吸收抗体到这些孔中。用0.1％吐温20的PBS冲洗后，通过向各孔中加入150μl的等份的0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS并在37℃温育2小时来阻断这些孔。
另一方面，将10μl各期肝癌的血清(sera)、各期胃癌的血清或健康对象(对照)血清与100μl溶于含0.5MKCl、0.5％BSA和0.01％MicrocideI(aMReSCO，Solon，Ohio)的50mM Tris-HCl(pH8.4)中的过氧化酶标记的鸡抗人-MK抗体(0.1μg/ml)反应。将50μl等份的该反应溶液加入板孔中，然后在室温温育1小时。用1％吐温20的PBS将各孔冲洗5次。将100μl等份的底物溶液(0.5mg/ml四甲基联苯胺)加入孔中并在室温温育30分钟。加入2N H2SO4终止反应，用多板读数计(型号3550，BioRad)测定在450nm/655nm的吸收值。在测定时，用类似方法测定已知浓度的MK标准物制作标准曲线。
(2)溶有兔抗-人MK抗体的缓冲液不同于上述提到的(1)的，区别在于i)用50mM Tris-HCl(pH8.1-8.3)替代50mM PBS，该缓冲液含有0.15M NaCl而抗体浓度是5μg/ml；ii)用含0.1％的酪蛋白的PBS作为阻断溶液替代0.5％的BSA；iii)溶有过氧化酶(POD)-标记的鸡抗-人MK抗体缓冲液是含0.5MKCl、0.1％酪蛋白、0.5％BSA、1mg/ml兔γ-球蛋白和0.01％MicrocideI(aMReSCO，Solon，Ohio)的50mM Tris-HCl(pH8.2-8.4)，另外，用类似于上述(1)中的一步三明治方法进行MK的测定。
肝细胞癌每一阶段和血清MK水平之间的关联(correlation)(1)血清样本的制备从135健康对象(94名男性和41名女性，年龄在21-75岁之间)、76名肝细胞癌(HCC)患者(第I阶段7名患者；第II阶段19名患者；第III阶段23名患者；第IV阶段27名患者)和肝病对照、7名病毒性肝炎患者、72名腺癌患者(第I阶段23名患者；第II阶段9名患者；第III阶段7名患者；第IV阶段9名患者；第V阶段5名患者；第VI阶段9名患者；第VII阶段10名患者)中收集血样，然后从中制备血清。马上将血清冷冻，并在-20℃存放，直到MK测定时。
之后，从其他376名健康对象(152名男性和224名女性)中收集新鲜血样，然后制备血清。
(2)血清MK水平的测定用实施例2中的(1)的方法测定每个HCC患者、病毒性肝炎患者和135名健康对象的血清MK水平(图1)。图中的条表示标准误差。证实了HCC患者的血清MK水平相对于健康对象逐渐显著高于第II期。
用实施例2的(2)所述的一步三明治方法测定上述HCC患者、病毒性肝炎患者和376名健康对象中每个的血清MK水平，其中EIA的敏感度是提高的(图2)。图中的条表示标准误差。
在第I期HCC患者的血清MK水平是0.22ng/ml(平均值)，明显较高的值(**p＜0.01；Mann-Whitney试验)相比于由健康对象获得的数值0.02ng/ml(平均值)。所以，发现MK作为早期HCC的血清肿瘤标记是非常有用的。
在HCC中用PIVKA-II和AFP的对比试验目前PIVKA-II和AFP被广泛用作HCC肿瘤标记。PIVKA-II和AFP是互补性的，PIVKA-II和AFP的组合提高了诊断率。所以，PIVKA-II和AFP可以用作比较性对照肿瘤标记。
使用Eitest PIVKA-II(Sanko Junyaku Co.，Ltd.)测定血清PIVKA-II(图3)。测定法是EIA。暗示了HCC从第III期是阳性的可能性。
用α-feto RIA珠(Dainabot)测定血清AFP水平(图4)。该测定法是免疫放射性测定法(IRMA)。在HCC的第I阶段没有检测到AFP，暗示了从第II阶段的检测是可能的。
也就是说，用MK进行HCC的早期测定是可行的，而且证实了在HCC阶段发展和血清MK浓度的升高之间有密切联系(strong correlation)。
在胃癌各阶段和血清MK水平之间的关系(1)血清样本的制备从72名胃癌患者(第1阶段23名患者；第2阶段9名患者；第3阶段7名患者；第4阶段9名患者；第5阶段5名患者；第6阶段9名患者；第7阶段10名患者)中收集血样，然后制备血清。将血清马上冷冻，并在-20℃存放，直到进行MK测定时。分别使用试验例1中获得的135名健康对象和376名健康对象的血清MK水平的数值。
(2)血清MK水平的测定图5显示了胃癌各阶段(1-7)和135名健康对象的血清MK水平(图中的条表示标准误差)，图6分别显示了376名健康对象的血清MK水平的数值(**p＜0.01；Mann-Whitney U-试验；图中的条表示标准误差)。
图6证实了胃癌患者从第1期起的血清MK水平显著性地高于健康对象的数值。也就是说，发现MK可用作胃癌早期诊断的肿瘤标记。
在胃癌中使用CEA和CA19-9的对比试验选用CEA和CA19-9作对照比较的肿瘤标记。发现在消化器官的各种癌症以及在其他各种癌症中血清CEA水平升高，由此它被广泛用于临床。另一方面，发现CA19-9在胰腺和胆汁系统的癌症显示了较高的阳性数值。当前，CA19-9以及CEA都是常规临床使用中最为广泛使用的消化器官癌症的肿瘤标记。
使用对血清CEA所用的CEA RIA珠(Dainabot)对胃癌患者测定血清MK水平(图7；条带表示标准误差)。所用的测定法是IRMA。尽管可以测定CEA作为第7阶段的阳性值，但是由于各阶段之间较大的标准误差不能证实阶段之间的显著差异。
使用Centocor CA19-9 RIA试剂盒(Centocor；正常值37U/ml或更低)测定血清CA19-9(图8；图中条带表示标准误差)。所用测定法为IRMA。CA19-9仅在第5阶段显示出较高数值，所以由此推测它与阶段没有联系。
也就是说，发现MK可用作早期胃癌的血清肿瘤标记。
在胃癌患者和肺癌患者中的血清MK水平在胃癌患者和肺癌患者早期调查血清MK水平(表1)。胃癌患者和肺癌患者二者都显示出在第I阶段的血清MK水平的平均值低于第II到IV阶段的，但是它们之间的差异在胃癌患者和肺癌患者中都不具有统计学上的显著性。
表1 血清MK水平(ng/ml)
癌症患者中尿液MK水平的测定用实施例2的(2)的方法测定在健康检查期间获得的72个癌症患者(胃癌24名患者；肝细胞癌24名患者和结肠癌24名患者)的尿液样本的MK水平和50个健康对象的早晨尿液样本。而且，在相同尿液中测定肌酸酐的数值，然后用肌酸酐的数值校正MK的数值。图9显示了结果。证实了在健康对象和癌症患者尿液MK数值之间具有显著性差异(p＜0.01；使用Mann-Whitney U-试验)。
在癌症患者和癌症各阶段中尿液MK数值之间的关联研究在癌症患者和癌症各阶段间尿液MK数值之间的关联。对包括3名胆管癌患者、3名乳腺癌患者、6名结肠癌患者、3名食管癌患者、1名胆囊癌患者、10名肝细胞癌患者、3名胰腺癌患者、7名直肠癌患者、28名胃癌患者和1名甲状腺癌患者的总共65名患者进行阶段分类(第1-7个阶段)。然后，测定尿液MK水平。图10中显示了各阶段的MK水平作为尿液MK的校正值(*p＜0.05，**p＜0.01；Mann-Whitney U-试验)。发现癌症的第I期的尿液MK水平比健康对象显著提高。至今为止，没有报导过癌症早期阶段增长的尿液标记。也就是说，尿液MK水平可用于各种癌症的早期筛选。
在HCC中肿瘤部分切除对血清MK水平的影响对5名HCC患者研究外科手术部分切除肿瘤对血清MK水平的影响(图11)。在4名患者中，肿瘤摘除后7天血清MK水平显著下降。也就是说，血清MK的水平反映了对HCC的治疗效果。
各种癌症的血清MK水平表2详细列举了包括18名食管癌患者、30名胃癌患者、2名十二指肠癌患者、25名结肠直肠癌患者、25名肝细胞癌患者、12胆管癌和胆囊癌患者、9名胰腺癌患者、5名甲状腺癌患者、19名肺癌患者和5名乳腺癌患者总共150名癌症患者的所处阶段。图12显示了用EIA测定这150名癌症患者的血清MK水平的结果。150名癌症患者的血清MK水平与健康对象的数值显示了显著性差异(p＜0.001，Mann-Whitney U-试验)。在87％患者中可见高于0.5ng/ml截止数值的血清MK水平。
表2


工业实用性本发明提供了一种用作诊断早期癌症的肿瘤标记。该肿瘤标记可用于进行早期癌症的筛选、某些类型的癌症的阶段和预后的评估以及监控治疗过程。
权利要求
1.一种检测早期癌症的方法，包括a)测定生物样本中的midkine和/或其片段，和b)将步骤a)中得到的测定水平与健康对象的测定水平进行比较。
2.按照权利要求1的方法，其中早期癌症是胃癌。
3.按照权利要求2的方法，其中胃癌在第I阶段。
4.按照权利要求1的方法，其中早期癌症是肝细胞癌。
5.按照权利要求4的方法，其中肝细胞癌是在第I阶段。
6.按照权利要求1的方法，其中早期癌症是肺癌。
7.按照权利要求6的方法，其中肺癌是在第I阶段。
8.按照权利要求1的方法，其中生物样本是血清或尿。
9.可识别midkine和/或其片段的抗体在早期癌症检测中的应用。
10.早期癌症诊断剂，含有可识别midkine和/或其片段的抗体。
11.检测生物样本早期癌症的试剂盒，其中该试剂盒(a)含有容器，该容器中装有与至少一种midkine和/或其片段的表位特异性结合的抗体，以及(b)测定生物样本中midkine和/或其片段的存在。
12.按照权利要求11的试剂盒，其中抗体被吸附到固体上。
13.评估癌症预后的方法，包括a)测定生物样本中的midkine和/或其片段，和b)将步骤a)获得的测定水平与癌症预后相关联。
14.按照权利要求13的方法，其中癌症是胃癌、肝细胞癌或肺癌。
全文摘要
现已发现MK(midkine)在早期阶段出现在各种类型癌症患者的血液或尿液中。基于这一发现,完成了一种涉及测定血或尿中MK的步骤的测定早期癌症的方法。
文档编号G01N33/574GK1390304SQ00815553
公开日2003年1月8日 申请日期2000年9月8日 优先权日1999年9月10日
发明者村松乔, 冈本好司, 池松真也, 佐久间贞俊, 小田宗宏, 熊井英志 申请人:村松乔