专利名称：Mr-1作为肿瘤标记物和靶分子在肿瘤诊断与治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤基因治疗技术，具体而言，就是根据新发现的靶点基因MR-1，通
过相应手段，抑制其对肿瘤细胞生长和运动的影响，进而阐明人类MR-1作为肿瘤诊断的新
标记物和临床治疗的新靶点的可行性。
背景技术：
肿瘤的分子诊断与治疗，是分子医学的重要组成部分，已成为近年来肿瘤研究的热点领 域。随着分子生物学的发展，特别是人类基因组计划的顺利实施、人类基因组序列的剖析和 相关基因功能的识别，现在己经发现越来越多的肿瘤分子标记物以及^疗靶点。
侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是患者死亡的主要原因。现已对于这一复杂病理 过程有了深入的认识。发现并证实与肿瘤转移高度相关的基因，成为当前肿瘤转移机制研究 的热点，因为这些基因及其蛋白，可能成为肿瘤诊断的标记物和抗转移治疗的新靶点。
在肿瘤侵袭和转移过程中，肿瘤细胞自原发瘤体脱落后，降解基质，穿越基底膜并进入 血管内，是完成转移的关键步骤之一。而肿瘤细胞的迁移运动能力，又是能否完成该过程的 重要因素，也是肿瘤侵袭周围组织，发生远处转移的基本条件。现在已知，肿瘤细胞在基质 中的迁移由4个循环往复的步骤组成，即细胞头部形成伪足，进行延伸，之后与基质之间建 立新的粘附位点，继而胞体发生收縮，细胞尾部退縮，通过这种不断重复的4个过程向前迁 移(Raftopoulou M, Dev Biol, 2004， 265: 23-32)。
首先，细胞形态发生改变，细胞膜形成膜状突起(例如板装伪足和丝状伪足)，即所谓 前缘突起。此为肿瘤细胞侵袭转移的起始步骤。接着，细胞持续的迁移，需依赖细胞伪足与 细胞夕l基质(extracdlularmatrix, ECM)之间发生粘附，形成粘着斑，以作为细胞向前迁移的 支点。最后，细胞骨架发生重组，因为肿瘤细胞发生迁移时的持续运动，需要依靠张力纤维 收缩和肌动蛋白丝的延长提供动力。张力纤维是真核细胞中一种稳定的、平行排列的微丝结 构，由肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等组成。肌动蛋白与肌球蛋白相对运动产生的收縮 力，是细胞迁移动力的主要来源。
对以上肿瘤迁移过程精确调节的分子机制十分复杂，细胞内许多信号分子均参与其中。 如Rho GTP酶通过活化肌球蛋白参与对细胞形态改变、细胞与基质粘附及细胞骨架重组的
调控(Wheeler AP, Exp Cell Res， 2004, 30:43-9), 由于其在许多恶性肿瘤中的高表达，Rho GTP酶可能成为肿瘤转移的临床诊断指标；粘着斑激酶FAK可通过自身磷酸化，在粘着斑 部位与paxillin (黏附有关)以及Src (转移/侵袭有关)形成复合物(Nimwegen MJ, Bio Pharm. 2007, 73: 597-609),作为非受体蛋白酪氨酸激酶,FAK在多种肿瘤组织中表达都有显著增加, 不失为一个有效的肿瘤治疗新靶点.；而肌球蛋白轻链2 (myosin light chain, MLC2)的磷酸化， 对于肌球蛋白的活化十分重要。MLC2磷酸化后，肌球蛋白即可与肌动蛋白结合，促进张力 纤维的聚合，进而增强细胞运动(Connell LE, J Cell Sci. 2006;119: 2269-81)。
上述这些信号分子之间存在复杂的联系，例如细胞运动需要细胞骨架蛋白的动力学聚合 以及粘着斑的形成。另一方面，粘着斑以及张力纤维形成也有赖于肌球蛋白的激活。此外， 已知FAK925位酪氨酸发生磷酸化，FAK即可通过与Grb2结合，激活MAP激酶信号转导 通路(Yamamoto D， Cell Signal, 2003; 15:575-83)，促进细胞增殖。
MR-1基因(肌纤基因调节因子)是本研究所发现的一种新的人类功能基因，由GenBank 收录，收录号为AF41700K MR-1 DNA位于人类染色体第二号染色体2q35位置上 (GeneBank收录号为AC021016),跨越2887 bp片段长度。MR-1基因存在三个不同剪切 方式的转录版本。本研究中的MR-1转录版本由3个外显子组成，共7乂bp，编码142个氨 基酸的蛋白。已有研究表明，MR-1在肌肉收縮单元中起着重要的调控作用。酵母双杂交实 验以及蛋白体外结合实验表明，MR-1蛋白和参与肌肉收缩的蛋白如肌球蛋白重链组成蛋白 myomesinl、轻链蛋白MLC2以及p-烯醇化酶存在相互作用。
Myomesinl是纹状肌M-band的组成部分，与p-肌球蛋白及其调节轻链均有相互作用； 轻链蛋白MLC2是肌原纤维粗纤维的组成蛋白，它的磷酸化在肌肉收縮中起着关键作用；p-烯醇化酶存在于纹状肌M-band，与醛縮酶(aldolase)相互作用影响肌原纤维细纤维，从而 调节肌肉的收縮。所有这些结构蛋白及其相互作用，对于肌肉细胞的构成以及收縮功能的调 节都会产生重要影响。
由于肿瘤细胞中肌动蛋白与肌球蛋白间的相互作用产生的收縮力量可促进肿瘤细胞的 运动，并且活化前述一系列包括FAK在内的信号转导通路。因此，MR-1有可能通过影响 MLC2的活化，在调节肿瘤迁移及增殖功能中发挥重要作用，其高表达可能与肿瘤细胞的某 些生物学行为存在密切关系。基因表达系列分析数据库(SAGE)检索结果也显示，MR-1 基因在187个GSM文库(含正常组织/细胞及癌组织/细胞)中均有表达，包括胚胎肾、脑、 卵巢、结肠、前列腺、胰腺、乳腺等多个组织及细胞系。其中MR-1在大部分卵巢癌、乳腺 癌、脑肿瘤以及前列腺癌组织/细胞中的表达明显高于正常组织/细脃，因此，MR-1有望成
为一个新的肿瘤诊断的标记物和治疗的靶分子。
本发明所述MR-1作为一个新的肿瘤诊断标记物和治疗靶分子的研究，迄今尚未见有相 关报道。
本发明目的在于，通过研究人类功能基因MR-1参与肿瘤细胞的迁移、生长过程并在其
中发挥的重要调控功能，阐明人类MR-1与肿瘤发生发展的相关性，使MR-1成为肿瘤诊断
的新标记物和治疗的一个新耙点，进而提供一种新的基因治疗药物用于临床。
发明内容
本发明首先检测了不同肿瘤细胞以及正常细胞中MR-1蛋白的表达水平，同时检测了肿 瘤细胞和正常细胞中MR-1的转录水平，以证明和评价MR-1作为肿瘤诊断新标记物和治疗 靶点的可行性提供依据。为此，选择了 MR-1表达水平较高的人肝癌HepG2细胞，根据 GenBank中提供的MR-1序列(基因序列号为AF417001),选用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术，降低HepG2细胞中MR-1的表达，检测MR-1表达与肿瘤细胞的体内外生长、 黏附作用及运动功能的关系，证明以MR-1为肿瘤治疗靶点，在基因水平或蛋白水平对其抑 制后，可有效抑制肿瘤细胞的生长、黏附以及运动，因而有效抑制肿瘤的发生及转移。
本发明为此提供了以下的生物学实验
1) 、 siRNA的转染实验；
2) 、 Western blotting方法检测细胞中MR-1的表达水平；
3) 、 RT-PCR方法检测细胞中MR-1的转录水平；
4) 、生长曲线法检测肿瘤细胞的增殖速率；
5) 、检测MR-l对细胞与细胞外基质成分纤维粘连蛋白(Fibronectin， FN)的黏附能力 的影响；
6) 、检测MR-1对细胞运动趋化能力的影响;
7) 、体内成瘤性比较实验。
本发明的优点与积极效果在于，证明了MR-l在肿瘤细胞中的表达高于正常细胞。降低 MR-1在肿瘤细胞中的表达，可以有效地抑制肿瘤细胞的生长、粘附及运动，并显著抑制动 物体内的成瘤性，显示MR-l有望成为肿瘤诊断和治疗的新耙点，用于制备肿瘤诊断和治疗 的新制剂。
图l一不同肿瘤细胞中MR-1蛋白的表达水平；
图2_ MR-1蛋白在人肝癌细胞以及不同人正常细胞中的表达水平；
图3—人肿瘤细胞以及正常细胞中MR-1的转录水平；
图4一瞬时转染siRNA 300 nM对H印G2细胞中MR-1转录水平的影响 其中Control泳道一未转染任何siRNA组； Mock泳道一转染mock-siRNA组； MR-1-siRNA (1)泳道一转染MR-1-siRNA耙点1组； MR-1-siRNA (2)泳道—转染MR-1-siRNA耙点2组。
图5—瞬时转染siRNA 300 nM对H印G2细胞中MR-1蛋白水平的影响 其中Control泳道一未转染任何siRNA组； Mock泳it一转染mock-siRNA组； MR-l-siRNA (1)泳道一转染MR-1-siRNA耙点1组； MR-1-siRNA (2)泳道一转染MR-1-siRNA耙点2组。
图6—低表达MR-1的H印G2/shMR-l稳定细胞系的构建(Western blotting结果) 其中H印G2泳道一未转染任何质粒；
H印G2/shmock泳道一阴性对照细胞系； H印G2/shMR-1泳道一服-1稳定低表达的细胞系。
图7— MR-1-siRNA和对人肝癌H印G2细胞生长的影响。 其中未转染任何siRNA组； ~H~转染mock-siRNA组；
▲ 转染MR-1-siRNA组。
图8— H印G2/shMR-1细胞体外增殖速度的变化 其中H印G2—未转染任何质粒；
H印G2/shmock—阴性对照细胞系；
▲ H印G2/shMR-1—MR-l稳定低表达的细胞系。
图9一 MR-l-siRNA对人肝癌H印G2细胞基质粘附能力的影响
其中 未转染任何siRNA组； —■I~转染mock-siRNA组；
▲ 转染MR-1-siRNA组。
图10—H印G2/shMR-1细胞的基质黏附能力的变化 其中H印G2—未转染任何质粒；
HelpG2/shmock—阴性对照细胞系；
H印G2/shMR-1—MR-l稳定低表达的细胞系。
图ll一MR-1-siRNA对人肝癌H印G2细胞体外趋化运动能力的影响
其中Control—未转染任何siRNA组； Mock-siRNA—转染mock-siRNA组； MR-l-siRNA—转染MR-1-siRNA组。
图12— H印G2/shMR-l细胞体外趋化运动能力的变化
其中H印G2—未转染任何质粒；
H印G2/shmock—阴性对照细胞系； H印G2/shMR-1—MR-1稳定低表达的细胞系。 图13—H印G2/shMR-1细胞的肿瘤生长速度的变化 其中H印G2 —未转染任何质粒；
H印G2/shmock—阴性对照细胞系； ▲ . H印G2/shMR-1—MR-1稳定低表达的细胞系。
具体实施方案
以下实施例仅为帮助所属领域技术人员更好的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1〉 MR-1在肿瘤细胞及正常细胞中的表达
1)、 Western blotting方法检测细胞中MR-1的表达水平
在不同细胞系的细胞中，加入120ul新鲜配制的细胞裂解液(50mMTris-HC1， pH7. 5; l%NP-40; 150mMNaCl; 1 mg/ml aprotinin; 1 mg/ml le叩印tin; 1 mM Na3V04; ImMNaF), 立即用细胞刮刀刮下细胞使其与裂解液充分混合，冰浴30分钟至1小时。于4度13, OOOrpra 离心15分钟，收集上清于新的EP管中，用标准Bradford法测定蛋白含量。取各样品等量 总蛋白(20-50u g)，分别加入等体积的3倍上样缓冲液，沸水煮沸变性5分钟后，于10 % 的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，然后转移印迹蛋白到PVDF膜上。之后，将PVDF膜浸于含 5X(w/v)脱脂奶粉TBS溶液中后室温振摇封闭过夜，TBS (10mMTris HC1 ， pH7. 5， 150mM NaCl)室温润洗5次，每次5分钟，装入杂交袋，用含1%BSA的TBS溶液以1:1000稀释兔 抗MR-l抗体[李天伯等，中国医学科学院学报，2005, 27(1) :42-47]室温孵育3小时，TBS 室温润洗5次，每次5分钟。装入新的杂交袋内，用二抗(服P-辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔抗体)(Santa Cruz Biotechnology公司产品)温育1小时，TBS室温润洗5次，每次5 分钟。膜上滴加化学发光增强剂(Santa Cruz Biotechnqlogy公司产品)，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统Chemilmager5500 (Alpha Innotech公司.)捕获图像。同 时检测actin蛋白表达量，以保证各组样品总蛋白上样量的一致。&-&"^抗体以1:500 稀释(Santa Cruz Biotechnology公司产品)。结果显示，各个肿瘤细胞系中，MR-1均有不 同程度的表达，其中，H印G2细胞中的MR-l表达最高，HT1080细胞以及肺癌细胞系中表达 相对较低(图1)。此外，正常人胚胎血管内皮细胞(HUVEC)、正常人肝细胞(L02)、人胚 肺成纤维细胞(2BS)以及人骨髓间充质干细胞(MSC)中的MR-1表达量，远低于三株肝癌 细胞系中MR-1的表达(图2)。说明MR-1呈肿瘤相关性表达特点。 2)、 RT-PCR方法检测肿瘤细胞和正常细胞中MR-1的转录水平
各个细胞系除去培养液加入Trizol，每平方厘米加lral Trizol试剂，提取总RNA,并 用紫外分光光度计(BECKMAN DU800)测定RNA的浓度。利用RT-PCR试剂盒(Invitrogen， Cat. No. 10928-34)进行操作。每种总RNA在扩增反应时加入1 y g作为模板，GADffl或 P-actin对照引物各加0.5u 1， MR-l引物各加lul,反应体系为25ul，反应条件为 50'C X 30分钟反转录，之后94。C X 2分钟预变性，再后94'C X 30秒，55°C X 30秒，72°C X 1 分钟，反应进行30个循环，最后延伸反应72'CX5分钟。反应后将产物进行琼脂糖电泳， 凝胶成像仪照相并进行分析。结果显示，MR-l基因在肿瘤细胞中的转录水平，高于三种正 常细胞HUVEC、 L02以及2BS中的转录水平(图3)。
<实施例2〉 MR-l-siRNA的设计与合成
目前最有效的siRNA双链是由21个核苷酸的正义链和反义链组成，每条链的3'端均悬 挂突出两个核苷酸，中间19个核苷酸配对。
本发明根据GenBank中提供的MR-1基因序列(序列号为AF417001),选择设计了两对 siRNA序列。siRNA对应的靶mRNA序列及siRNA核苷酸序列分别如下 raRNA耙序列1 (19 nt) : 5' -ACC GUG UGA AGC AGA UGA A -3' 寡核苷酸序列5' -UUC AUC UGC UUC ACA CGG UdTdT-3' 3， -dTdTA AGU AGA CGA AGU GUG CCA-5, mRNA耙序列2 (19 nt) : 5' -CCU AGG CUA UUG ACU GUU A-3' 寡核苷酸序列5' -UAA CAG UCA AUA GCC UAG GdTdT-3， 3' -dTdTA UUG UCA GUU AUC GGA UCC -5' 试验中采用的mock序列为对照
mRNA革巴序列(19 nt): 5' -AAU UCU CCG UUC GUG UCA CGU-3， 寡核苷酸序列5' -ACG UGA CAC GM CGG AGA AdTdT-3'
3' -dTdTU GCA CUG UGC UUG CCU CUU-5'
本发明所使用的MR-1-siRNA由广州锐博生物技术公司合成，siRNA双链纯度>97%。用 水溶解RNA双链后，可直接用于转染。这种方式可保证双链复合体以适当形式存在并易于转 染。 .
<实施例3>MR-1 shRNA靶序列及其DNA模板的设计与载体构建
ShRNA靶序列为MR-1-siRNA靶点2。按照现有规则合成shRNA的DNA模板，该模板包 括正义，反义两条反的互补链，其组成的基本单位为Sa^^I酶切位点、靶序列正义链、9bp 的环序列、耙序列反义链、连续5个T、 ffi/ dl1酶切位点，总长65bp。
MR-1 shRNA寡核苷酸序列如下
正义链
5' -GATCCCGCCTAGGCTATTGACTGTTATTCAAGAGATAACAGTCAATAGCCTAGG TTTTTTGGAAA-3'
反义链
3, -GGCGGATCCGATAACTGACMTAAGTTCTCTATTGTCAGTTATCGGATCCAAAAAACCTTTTCGA -5, mock shRNA寡核苷酸序列如下
5' -GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCMGAGMCGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGGAM-3 ，
3' -GGCMGAGGCTTGCACAGTGCAMGTTCTCTTGCACTGTGCMGCCTCTT磁MACCTTTTCGA -5'
以上引物中划线部分为相应靶mRNA序列的DNA序列及其互补序列，转录成RNA后，会
在此处形成发夹结构RNA的双链部分。所形成的发夹RNA则可被RNA Dicer酶所识别切割成
双链siRNA，从而发挥RNA干扰作用。
将合成引物退火后，形成的双链DNA的5'端存在Bamhl酶切位点的粘末端，3'端存在
Hindll酶切位点的粘末端，可直接连接入经万a础和双酶切的pCD-shRNA质粒载体中，经过测序验证无误，将其命名为pCD-shMR-1和
pCD-shmock。
<实施例4〉 MR-1-siRNA的转染及对MR-1表达的影响
本发明使用LipofectAMINE"2000脂质体(Life Technologies,产品货号11668-027)， 进行转染，转染后24及36小时进行沉默效应测定。所有操作均按产品说明书6孔板操作 规程进行。将合成的MR-l-siRNA或mock-siRNA粉末用无RNA酶的水溶解，配成20幽的储 备溶液。实验细胞是在转染前18-20小时，用2 ml含l(^胎牛血清的无抗生素MEM-EBSS 细胞培养液，以40万个/孔接种到六孔板中。将20PM的siKNA用无抗生素无血清的0pti-MEM
细胞培养液250ri稀释至300 nM，取8ri脂质体与250W无抗生素无血清的0pti-MEM培 养液混匀，5分钟之内，将MR-l-siRNA或mock-siRNA溶液与脂质体稀释液轻轻混匀。siRNA 与脂质体复合物于室温静置20分钟后，将500W MR-1-siRNA或mocK-siRNA脂质体复合物 加到细胞培养板(细胞生长覆盖率为80%-90%)中。细胞在转染前用无抗生素无血清的 Opti-MEM培养液洗一遍后，再加入新的500W无抗生素无血清'Opti-MEM培养液。转染5小 时后，每孔中补加1 ml含20%胎牛血清的无抗生素MEM-EBSS培养液。转染24以及36小时 后，分别采用RT-PCR以及Western blotting方法，对干扰效率进行检测或对细胞生长、黏 附及运动能力进行检测。
采用实施例1中所述RT-PCR方法，检测MR-1高表达H印G2细胞中的转录水平，结果表 明，所设计的两个MR-1-siRNA序列可不同程度的降低MR-l的mRNA水平，其中MR-l-siRNA(2) 序列抑制效率高于MR-1-siRNA(l)。而mock-siRNA则无明显抑制作用(图4)。
采用实施例l中所述Western blotting方法，对MR-1-siRNA抑制靶蛋白效果的检测发 现，MR-1-siRNA耙点2序列可明显降低MR-1的表达，而MR-1-siRNA耙点1和mock-siRNA, 则对细胞内MR-1的蛋白水平未呈明显影响(图5)。 <实施例5>: MR-1稳定低表达细胞系H印G2/shMR-i的构建与筛选
根据实施例3所得到的pCD-shMR-1构建H印G2/shMR-1细胞系，采用同样 LipofectAMINE 2000脂质体(Life Technologies,产品货号11668-027)进行转染。所 有操作均按产品说明书操作规程进行。按质粒:脂质体(1 : 2. 5的比例，将2 pCD-shMR-1质粒用无抗生素无血清的0pti-MEM培养液250 Hi进行稀释，其余转染步骤同 siRNA的转染。转染24小时后，将各组细胞分别改用含400 Pg/ml G418 (GIBCO公司产品) 选择性培养液培养，待未转染细胞全部死亡后，将转染组细胞消化、计数，用选择性培养液 极度稀释至5个细胞/ml，以每孔100W加入96孔板中，挑取只含一个细胞的培养孔，进 行单克隆培养。待细胞长满后，依次转入24孔板、6孔板以及25cni2培养瓶中进行培养。 Western blotting方法进行鉴定。相应地，建立转染pCD-shmock质粒的阴性对照细胞系 H印G2/shraock。本发明对所建立的低表达MR-1的H印G2/shMR-1稳定系进行检测结果表明， H印G2/shMR-1中MR-1的表达与正常H印G2及H印G2/shmock细胞相比明显下调(图6)。 <实施例6>生长曲线法检测MR-1-siRNA对肿瘤细胞增殖速率的影响
H印G2细胞在转染siRNA36小时后，用1 ml含10%胎牛血清的MEM-EBSS细胞培养液， 以1000个/孔接种到24孔板中。此外，将对数生长期的H印G2、H印G2/shmock、H印G2/shMR-l 细胞同样用lml含10%胎牛血清的MEM-EBSS细胞培养液，以1000个/孔接种到24孔板中，常规培养换液，每24小时将4个孔中细胞以EDTA-胰酶消化，于显微镜下计数，共计6天。 结果表明，MR-l-siRNA可明显降低细胞的生长速度(图7)。 H印G2/shMR-1细胞的生长速度 与正常H印G2细胞相比明显减慢，而H印G2/shmock细胞的生长速度未发生明显改变。说明 MR-1的表达水平，可以影响细胞生长增殖过程(图8)。
<实施例7>检测MR-l-siRNA对肿瘤细胞与细胞外基质成分FN黏附能力的影响。
本发明进行了细胞基质粘附实验，分别检测了 MR-1-siRNA对H:pG2细胞基质黏附能力 的影响和MR-1低表达细胞系H印G2/shMR-1细胞对基质粘附能力的变化情况。细胞消化后， 以含1%胎牛血清的MEM-EBSS洗涤2次后，接种于预先以10 u g/ml人纤维粘连蛋白FN 包被的96孔板中。.MTT法检测细胞接种后不同时间点对FN的粘附率。结果显示，MR-1-siRNA 处理后，细胞对FN的粘附能力明显低于control和mock-siRNA组细胞(图9);H印G2/shMR-l 细胞对FN的粘附能力与H印G2和H印G2/shmock细胞相比亦出现下降(图10) <实施例8>检测MR-1-siRNA对肿瘤细胞运动趋化能力的影响。
采用Transwell小室培养系统，掉测MR-1-siRNA对肿瘤细胞趋化运动能力的影响以及 MR-1低表达细胞系H印G2/shMR-1细胞的运动趋化能力变化情况。本发明将不同处理的H印G2 细胞及不同稳定系细胞以含1%胎牛血清的MEM-EBSS培养液重悬，分别加入培养小室上室 腔中，下室腔加入含20%胎牛血清和10 ug/ml FN的MEM-EBSS,诱导细胞的运动。3小时 后检测穿过膜的细胞数。结果显示，MR-1-siRNA处理的细胞穿过膜的数量明显少于正常 H印G2细胞以及转染mock-siRNA的细胞，MR-1-siRNA及mock-siRNA对细胞趋化运动能力的 抑制率分别为63. 72 %和12. 73 % (图11); H印G2/shMR-l细胞穿过膜的数量明显少于正常 H印G2细胞及H印G2/shmock细胞。与正常H印G2细胞相比，H印G2/shMR-l细胞的趋化运动 能力降低率为56. 55%, H印G2/shmock细胞系的降低率为8. 96% (图12);
<实施例9>体内成瘤性比较实验
将对数生长期的H印G2、 H印G2/shmock及H印G2/shMR-1细胞消化，计数，以生理盐水 重悬，皮下注射入5周龄雌性BALB/c 6w/"W裸小鼠右侧腋窝皮下，每只注射剂量为200 ul生理盐水含5Xl(f细胞，每组6只。肿瘤接种时，开始纪录裸鼠体重，每周两次。待瘤 块形成后，通过测量可触及的肿瘤长径(a)和短径(b)，按照体积二ab2/2的公式计算肿瘤 体积。每4天一次，共测5次。结果显示，H印G2/shMR-1细胞系的肿瘤生长速度明显减慢。 在第10天才出现可触及的瘤块。而H印G2及H印G2/shmock细胞系则在第4天即出现可触及 的瘤块，且生长迅速。至接种后第20天，H印G2/shMR-1细胞组其肿瘤体积为103咖3 ，而 H印G2细胞已达1156咖3，下降率达91.01% (图13)。
权利要求
1、MR-1作为肿瘤标记物在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
2、 MR-1作为肿瘤靶分子在制备肿瘤治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及MR-1基因作为肿瘤标记物和靶分子在制备肿瘤诊断试剂和治疗药物中的应用，具体而言，是对新基因MR-1在人正常细胞和肿瘤细胞中的表达进行检测，并通过RNA干扰技术，对肿瘤细胞中高表达的MR-1进行抑制后，发现肿瘤细胞的迁移及生长受到了抑制，说明MR-1有望成为一个肿瘤诊断的新标记物和临床治疗的新靶点。
文档编号C12Q1/68GK101200768SQ20071016634
公开日2008年6月18日 申请日期2007年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者任开环, 何红伟, 王以光, 边春景, 邵荣光, 金海霞 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所