检测乳腺肿瘤的血清学生物标记物及其应用的制作方法

专利名称：检测乳腺肿瘤的血清学生物标记物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种乳腺癌肿瘤的生物标记物-血清miRNA(microRNA，微RNA，小RNA)及其在辅助乳腺肿瘤筛查与临床诊断中的应用。

背景技术：
乳腺癌(mammary carcinoma)是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其组织学形态多种多样，是一类高度异质性的肿瘤，具有发病率高、颇具侵袭性、但病程进展缓慢、自然生存期长等特点。虽然早期诊断及辅助化疗和激素治疗使得乳腺癌的死亡率有所降低，但在导致女性死亡的恶性肿瘤中仍居世界首位。
miRNA是一类生物体内自然形成的小分子非编码RNA，参与调节其特异靶基因的表达，从而控制蛋白的产生，具有调节发育时序，细胞增殖，分化，代谢，凋亡与应激以及参与脊椎动物心脏、肌肉以及神经系统的形成，同时调控肿瘤发生的功能。约50％的已知人类miRNA基因定位于和肿瘤相关的染色体区域，而不断累积的研究成果也已充分证实miRNA的异常表达与肿瘤的发生，发展密切相关。
生物标记物是指能将机体的生理和病理状态区分开来的生物分子。筛选到可用于肿瘤早期发现、早期诊断的生物标志物可大大提高肿瘤患者的临床治疗效果。最新数据显示肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达谱，即指肿瘤细胞某几种miRNA的表达水平常与同一组织中的正常细胞存在显著差异，而特征性的miRNA异常表达可望成为用于肿瘤的诊断、病理分级、临床分期、疗效与预后的生物标记物，显示了良好的临床应用前景。
近年来研究人员发现在血浆和血清中也存在独立于细胞之外并且即使在严酷环境下也能明显保持稳定的miRNA分子，而作为生物检测样本，血清具有取材方便、无创伤性、并可连续的体外检测的优点，使得基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的血清miRNA作为分子标记的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，进而可以克服分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此，开发一种可辅助乳腺癌筛查和诊断的血清miRNA作为生物标记物，具有广泛的科研价值和临床应用前景。


发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有较高靶向性、稳定性及高效率检测乳腺肿瘤的血清学生物标记物及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测乳腺肿瘤的血清学生物标记物，其特征在于包含以下所列miRNA中的至少一种 miR-21uagcuuaucagacugauguuga； miR-106aaaaagugcuuacagugcagguag； miR-126ucguaccgugaguaauaaugcg； miR-155uuaaugcuaaucgugauaggggu； miR-335ucaagagcaauaacgaaaaaugu； miR-199acccaguguucagacuaccuguuc。
本发明还同时提供了上述血清学生物标记物的用途制备用于筛查乳腺肿瘤或辅助乳腺肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。
作为本发明的血清学生物标记物的用途的改进试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统； 反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂； 引物系统由miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a中的至少一种的茎环结构反转录引物、扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成； 引物探针系统由miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a中的至少一种的茎环结构反转录引物、扩增引物及探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物及探针组成。
作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进试剂盒还包括扩增系统；扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。
检测该标志物的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。
茎环是指反转录过程中使用的茎环结构反转录引物，其由以下核苷酸序列组成 miR-21CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC； miR-106aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGC； miR-126CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCATTAT； miR-155CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAT； miR-335CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATTTTT； miR-199aGTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACAG。
荧光定量PCR技术为DNA染料法或TaqMan探针法。
基于DNA染料法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的特异性PCR引物由以下核苷酸序列组成 PCR正向引物 miR-21ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA； miR-106aACACTCCAGCTGGGAAAAGTGCTTACAGTG； miR-126ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT； miR-155ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT； miR-335ACACTCCAGCTGGGTCAAGAGCAATAACGAA； miR-199aCGAGGGTCCGAGGTATTCCG； miR-21、miR-106a、miR-126、miR-155、miR-335的PCR反向引物均为 TGGTGTCGTGGAGTCG； miR-199a的PCR反向引物为CGCCGCCCAGTGTTCAGA。
基于TaqMan探针法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的引物为上述PCR引物，其中所使用的探针由以下核苷酸序列组成 miR-21(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAACATC(MGB)； miR-106a(6-FAM)TTCAGTTGAGTACCTGCA(MGB)； miR-126(6-FAM)TTCAGTTGAGGCATTATT(MGB)； miR-155(6-FAM)TTCAGTTGAGCCCCTATC(MGB)； miR-335(6-FAM)TTCAGTTGAGACATTTTT(MGB)； miR-199a(6-FAM)TTCAGTTGAGGAACAGGT(MGB)。
以上括号内的内容代表探针合成方式。
在荧光定量PCR检测方法中，使用保守性miRNA(miR-16)作为内参照基因，其序列、引物及探针由以下核苷酸序列组成 序列uauugcacuugucccggccugu； 茎环引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA； PCR正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA； PCR反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG； 探针(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA(MGB)。
本发明的标志物均可单独用于乳腺肿瘤的筛查，其组合可辅助乳腺肿瘤病理鉴定和临床诊断。
本发明所述的miRNA能在血清中稳定存在，该miRNA在乳腺正常血清，乳腺良性病变血清和乳腺癌病理分期II级及III级血清中表达具有差异性，且与雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达量具有密切的关联性。因此，能用于乳腺肿瘤筛查及辅助乳腺肿瘤病理鉴定及临床诊断。本发明主要是以miRNA为中心，基于实时荧光定量PCR技术检测和分析血清miRNA的差异性表达，主要通过以下步骤实现 (a)制备乳腺肿瘤血清样本； (b)酸性酚/氯仿法抽提血清总RNA； (c)反转录反应合成cDNA； (d)实时荧光定量PCR检测miRNA在不同样本中的表达变化量。
本发明是针对现有乳腺肿瘤标志物敏感性和特异性不能满足临床诊断的需要，在研究miRNA在乳腺肿瘤血清中的差异性表达及与临床病理指数的相关性的基础上所获得的。
本发明所述的肿瘤血清标志物，由miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a组成；其应用主要表现在这6个目标miRNA均在乳腺癌患者与正常人群血清中显示出差异性表达，可单独用来对乳腺癌患者进行无创性筛查。此外，不同的miRNA在血清学水平上与乳腺肿瘤病理分级，ER和PR表达量的具有显著的相关性，可用来辅助乳腺肿瘤病理鉴定及临床诊断。
本发明的技术方案是提供一种用于筛查乳腺肿瘤患者和鉴定乳腺肿瘤病理特征的试剂盒，其由反转录系统，扩增系统和引物探针系统组成，其中，反转录系统由反转录酶，反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成；引物探针系统由miR-16，miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a的茎环结构反转录引物和PCR扩增引物及探针组成。
本发明通过实验得出以下结论，确定了miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a这6个目标miRNA均可单独作为乳腺肿瘤筛查的血清学生物标记物，其组合可辅助乳腺肿瘤临床病理鉴定及诊断。
1.miRNA在血清中的特异性表达 乳腺组织和血清中的总RNA经特异性的茎环引物分别反转录合成各自的cDNA(miR-16，21，106a，126，155，199a，335)后经PCR扩增，PCR产物再经8％DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果如图1所示在健康对照血清(图1-D)，良性病变血清(图1-E)和癌变血清(图1-F)中均检测到目标miRNA的特异性表达，并与其在对应的乳腺正常组织(图1-A)，良性病变组织(图1-B)和癌变组织(图1-C)中的表达情况一致，充分说明了目标miRNA在乳腺组织和血清中均有特异性表达。
2.miRNA在血清和组织中表达的相关性分析 本发明运用SPSS 16.0软件中的Pearson相关系数分析了目标miRNA在收集到的48例乳腺肿瘤患者的组织和其对应的血清样本中表达的相关性。以血清样本为横坐标，组织样本为纵坐标绘制相关系数散点图(图2)，可见目标miRNA在乳腺肿瘤血清和组织中的表达水平具有显著的相关性，相关系数为R＝0.853(P＝0.01)。结果表明miRNA在血清中的表达水平可反映乳腺组织样本的病理特点，进而确定了miRNA在血清学水平上可作为乳腺肿瘤的生物标记物来指示肿瘤的临床病理情况。
3.临床病理指数水平上，在乳腺血清和组织中miRNA表达的相似性分析 如图3～6所示，在不同患病年龄组、不同肿瘤病理分级和不同的雌、孕激素受体表达量中，目标miRNA在血清和组织中具有相同的差异性表达趋势，均显示了较高的相似性。
4.miRNA在乳腺癌血清与正常血清中表达的差异性分析 如图7所示，目标miRNA在48例乳腺癌患者的血清及其48例健康对照血清样本中表达的差异性分析，表明miR-21(RQ＝2.527，P＝0.001)，miR-106a(RQ＝1.902，P＝0.020)和miR-155(RQ＝3.427，P＜0.001)在乳腺癌血清中显著高表达，而miR-126(RQ＝0.437，P＜0.001)，miR-199a(RQ＝0.267，P＝0.001)和miR-335(RQ＝0.272，P＝0.001)则呈现显著低表达。除了miR-106a外，相对表达变化倍数均大于2，且已达到了极显著水平。因此根据这5种miRNA在乳腺血清中的表达情况可明显区分癌血清和正常血清，miR-106a也具有较好的参考价值。
5.miRNA在乳腺肿瘤血清中的差异性表达与患病年龄的相关性分析 如图8所示，本实验对取自同一乳腺癌病人的血清样本中miRNA在两年龄组上的表达水平进行分析，发现miR-21(P＝0.248)，miR-106a(P＝0.461)，miR-126(P＝0.979)，miR-199a(P＝0.250)和miR-335(P＝0.164)在乳腺癌血清相对于其健康对照血清中的差异性表达在两患病年龄(＜48和≥48)组上无显著性差异，呈现出相似的相对表达水平。
结果说明这5种miRNA在乳腺血清中的表达变化与年龄没有相关性，即随着患病年龄的增大，miRNA的表达量并无显著变化，仅有miR-155(P＝0.005)在高年龄组血清中比低年龄组中显著高表达。
6.miRNA在乳腺肿瘤血清中的差异性表达与病理分级的相关性分析 如图9所示，miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a在健康对照血清(38例)，乳腺良性病变血清(10例)和乳腺癌病理分期II级(22例)及III级(16例)血清中表达具有差异性，其中在肿瘤血清中表达上调的miR-21，miR-106a和miR-155从健康血清到高增殖指数的癌肿渐近地升高，而在肿瘤血清中表达下调的miR-126，miR-335和miR-199a从健康血清到高增殖指数的癌肿渐近地下降。值得注意的是，在正常乳腺样本和良性病变样本之间，miR-199a(P＝0.005)，miR-335(P＝0.001)和miR-155(P＝0.021)的表达水平具有显著性差异，且前二者均已达至极显著水平；在良性病变肿瘤与乳腺癌病理分级II之间，miR-21(P＝0.001)，miR-155(P＝0.001)和miR-335(P＝0.001)有显著性的差异表达，且均达到极显著水平；在乳腺癌病理分级II和III之间，miR-155(P＝0.001)和miR-199a(P＝0.005)均表现出明显的差异性，且均已达至极显著水平。
结果表明，miR-199a和miR-335在血清水平上来区分乳腺良性病变肿瘤，进而无创伤性地筛查良性肿瘤患者以得到积极的早期诊断；miR-21，miR-155和miR-335可在血清水平上区分良、恶性肿瘤，进而积极采取适合的诊疗措施；miR-21，miR-155和miR-199a可在血清水平上区分高增值指数的癌肿，进而考虑更为激进的治疗方案，以降低死亡风险。因此在血清中检测这些miRNA的表达变化量对乳腺肿瘤快速筛查，临床诊断和治疗具有重要作用，有望作为乳腺诊断和治疗的生物标记物。
7.miRNA在乳腺肿瘤血清中的差异性表达与雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达量的相关性分析 本实验分析了在取自同一乳腺肿瘤病人的血清样本中的目标miRNA的表达水平与雌、孕激素受体表达量上的关系。如图10～11所示，miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a在乳腺癌组织中的差异性表达与ER，PR的表达量有密切的关联性。其中，miR-106a(P＝0.001)，miR-155(P＜0.000)，miR-126(P＝0.002)，miR-199a(P＝0.009)，miR-21(P＝0.020)和miR-335(P＝0.014)的表达差异水平可区分ER阴性或阳性，且前四者的表达变化量已达至极显著水平；miR-21(P＝0.009)，miR-106a(P＝0.007)，miR-155(P＜0.001)，miR-199a(P＝0.001)，miR-126(P＝0.012)和miR-335(P＝0.026)表达差异水平可区分PR阴性或阳性，且前四者的表达变化量已达至极显著水平。
结果表明在乳腺癌病理状态鉴定过程中可利用miRNA在血清中的差异性表达水平，尤其是miR-155，miR-106a和miR-199a能从血清学水平上反映ER，PR在乳腺肿瘤中的表达情况，而避免了组织切片鉴定ER/PR的滞后性和创伤性，从而能更快捷对病人进行筛查和诊断并采取有效的治疗方案，具有广泛的临床应用前景。
8.本发明所关注的6个miRNA在组织学和血清学水平上对乳腺肿瘤病理的指示作用 如图12所示，总体上这6种miRNA的差异性表达均能单独从组织学和血清学上区分乳腺癌患者和健康人群，从而对乳腺癌患者进行筛查。此外，不同的miRNA还能指示不同的乳腺肿瘤病理特征，从而应用于乳腺肿瘤病理鉴定和诊断，具体表现在 miR-21的高表达可从组织学和血清学上在乳腺肿瘤人群中区分良性肿瘤与病理分级II级肿瘤及雌、孕激素受体在乳腺肿瘤中的蛋白表达水平。此外，miR-21还能在组织学水平区分病理分级II级与III级的乳腺癌肿，适用于肿瘤病理组织鉴定。
miR-106a的高表达可从组织学和血清学上区分乳腺良、恶性肿瘤，且在乳腺囊肿组织及其癌旁组织中的差异性表达还能识别乳腺囊肿的病理状态。此外，在血清中检测miR-106a的表达情况就可以确定乳腺肿瘤患者的雌、孕激素受体的表达情况，从而快捷地采取有效的治疗方案，以避免延误病情。
miR-126的低表达可在组织学和血清学水平上区分乳腺肿瘤中雌激素受体的蛋白表达水平，但仅能在血清学水平上区分良性病变囊肿和低级癌肿以及孕激素阴性和阳性，并仅能在组织学水平上区分高级和低级癌肿。
miR-199a在乳腺组织和血清中的表达变化可区分雌、孕激素受体的表达情况以及高、低级癌肿。此外，miR-199a还能在血清学水平上从正常人群中区分良性肿瘤患者，具有无创伤性的乳腺囊肿快速筛查的作用。
最为重要的是，miR-155在血清中的显著高表达以及miR-335在组织中的显著低表达可明显区分本实验作为研究对象的各病理特征。此外miR-155在组织水平上不能从正常人群中区分良性病变患者可由miR-335在组织水平上的指示作用来弥补，而miR-335不能在血清水平上区分高、低级癌肿则可以由miR-155在血清中的高敏感的指示作用来补足，因此仅以这两种miRNA就能对乳腺肿瘤病理做出准确判断。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次鉴别和分离了与乳腺肿瘤相关的血清miRNA，在此基础上完成了本发明；首次通过miRNA实时定量PCR技术在乳腺癌血清中对miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a的表达水平进行检测，进一步验证这些血清miRNA与乳腺肿瘤各临床病理指标的关联性，所提供的试剂盒专门针对于血清miRNA的检测优化，结果准确可靠。
本发明的优点为(1)本发明确定的miRNA与乳腺肿瘤临床病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对乳腺肿瘤病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。(2)由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点，因此从血清中寻找生物标记物可以将乳腺肿瘤的筛查和诊断提高至一个新的水平，进而提高治愈率和降低死亡率。(3)通过实时荧光定量PCR技术对乳腺肿瘤病人的血清水平miRNA的检测，定量准确。相对于芯片技术或者分子杂交，该方法简便快速且经济实用。(4)可与其他分子指标相结合，为乳腺肿瘤筛查，诊断，治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。



下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1RT-PCR定性检测miR-16，21，155，106a，126，335，199a在乳腺肿瘤患者血清中的特异性表达(8％DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳，20bp DNA ladder)。
其中A-C目标miRNA在乳腺正常组织(图1-A)，良性病变组织(图1-B)和癌组织(图1-C)中的表达情况；D-F目标miRNA在健康对照血清(图1-D)，良性病变血清(图1-E)和癌血清(图1-F)中的表达情况。
图2miRNA在乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清样本中差异性表达的相关性。(相关性分析在P＝0.01水平上，SPSS16.0软件，Pearson相关系数分析)。
图3各年龄组上，miRNA在乳腺肿瘤患者的血清和乳腺组织中表达的相似性。
其中AmiRNA在年龄小于48的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况；BmiRNA在年龄大于或等于48的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况。
图4各肿瘤病理分级上，miRNA在血清和乳腺组织中表达的相似性。其中AmiRNA在肿瘤分级II的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况；BmiRNA在肿瘤分级III的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况。
图5雌激素受体表达量上，miRNA在血清和乳腺组织中表达的相似性。其中AmiRNA在ER+的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况；BmiRNA在ER-的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况。
图6孕激素受体表达量上miRNA在血清和乳腺组织中表达的相似性。其中AmiRNA在PR+的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况；BmiRNA在PR-的乳腺肿瘤患者的乳腺组织和血清中的表达情况。
图7miRNA在乳腺癌血清与正常血清中的差异性表达。
图8miRNA在乳腺肿瘤血清中的差异性表达与患病年龄的相关性分析。
图9miRNA在血清中的差异性表达与乳腺肿瘤病理分级的相关性分析。
图10miRNA在乳腺肿瘤血清中的差异性表达与雌激素受体(ER)表达量的相关性分析。
图11miRNA在乳腺肿瘤血清中的差异性表达与孕激素受体(PR)表达量的相关性分析。
图12-A～F目标miRNA的差异性表达指示各乳腺肿瘤病理特征。

具体实施例方式 本发明所提供的血清miRNA标记物在制备检测乳腺肿瘤的临床诊断试剂盒中应用的具体方法如下 (一)实验样本 本发明所使用的肿瘤组织和血清样本来自2007年11月～2008年12月间在浙江省肿瘤医院接受治疗的乳腺肿瘤患者的组织和全血。入组患者要求有明确的细胞学诊断，手术前未经任何放疗、化疗及内分泌治疗，手术后有完整的临床及病理资料。本发明所采用的正常组织对照样本来自乳腺肿瘤患者的癌旁正常组织，正常血清对照样本来自健康志愿者。入组志愿者均经问卷调查和严格体检无乳腺肿瘤及其相关妇科肿瘤家族病理史且无乳腺肿瘤患病风险。
根据WHO确立的乳腺癌分类标准和美国癌症联合委员会(AJCC)建立的癌症临床分期系统(TNM stage system)对乳腺癌患者的样本信息分类汇总如表1所示。患者均为女性，年龄21-72岁，中位年龄为54岁，小于48岁的患者25例，大于和等于48岁的患者23例。病理为侵润性导管癌38例，乳腺纤维瘤10例。病理分级II级者22例，III级者16例，无病理I级患者。肿瘤大小为1.0～10.0cm，未及时记录者3例。伴有淋巴结转移者22例，转移淋巴结的数目为1～24枚。伴有脉管栓塞者6例。经免疫组化鉴定，ER表达水平阳性者20例及阴性者18例，PR表达水平阳性者18例及阴性者20例。按照AJCC分期标准，I期者6例，II A期者17例，II B期0例，IIIA期者5例及未经鉴定分析者10例。
表1乳腺肿瘤病人的临床病理信息

a根据WHO确立的乳腺癌分类标准(Tavassoli和Devilee，2003) b根据美国癌症联合委员会建立的癌症临床分期系统(Singletary等，003) (二)实验试剂 RNA提取及PCR产物检测过程中所用试剂，如酸性酚(pH4.5)，氯仿，异丙醇，乙醇，DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂等常规生化试剂，均购于上海生工公司。PCR扩增试剂(含10×buffer、dNTPs mixture、Taq)及反转录反应所用试剂，如RNase抑制剂、M-MuLV反转录酶、5×M-MuLV缓冲液以及反转录用dNTP混合物(各10mM，RNase-free)，均购自TaKaRa公司。基于DNA染料法的荧光定量PCR检测试剂盒(含real-time PCR MasterMix、50×ROX reference)为TOYOBO产品。基于Taqman探针法的荧光定量PCR检测试剂盒为ABI产品。所有引物委托(miRNA茎环结构反转录引物、PCR正向引物、PCR反向引物)上海生物工程有限公司合成。TaqManprobe委托ABI公司合成。
(三)实验过程 1.制备乳腺癌血清样本 全血样本来自乳腺癌，乳腺良性病变患者和健康志愿者。
1)于清晨空腹取外周血3ml注入清洁干燥的离心管，立即置于37℃恒温培养箱斜置1-2h； 2)4℃斜置3-4h，析出的血清移到新离心管中。
3)凝血块以4℃，4000rpm，离心10min，小心吸取上清； 4)合并步骤2)和步骤3)所得的两次血清，4℃，4000rpm离心10min，小心吸取上清转至1.5ml离心管中。
每个样本如上制备后分别保存于-80℃冰箱，待用。
2.血清总RNA抽提 1)取0.25ml上述步骤1制备的血清，加入0.25ml酸性酚/氯仿(体积比1∶1)，剧烈涡旋，静置使其充分裂解； 2)4℃，12000rpm离心15min，取上清，加入1/10体积3mol/ml醋酸钠和2倍体积异丙醇，反复倒置，混匀，-20℃静置沉淀过夜； 3)4℃，12000rpm离心10min，弃上清，向沉淀中加入75％乙醇1ml，使沉淀悬浮，4℃，12000rpm洗涤沉淀5min，弃上清，将沉淀室温晾干后溶于焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H2O)中； 4)NanoDrop分光光度计(ND-1000)检测总RNA的含量及纯度。
3.检测用引物及探针序列 1)miRNA茎环结构反转录引物 miR-16(SEQ ID NO1) CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA； miR-21(SEQ IDNO2) CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC miR-106a(SEQ IDNO3) CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGC miR-126(SEQ ID NO4) CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCATTAT miR-155(SEQ ID NO5) CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAT miR-335(SEQ ID NO6) CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATTTTT miR-199a(SEQ ID NO7) GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACAG 2)miR-16、miR-21、miR-106a、miR-126、miR-155、miR-335的PCR反向引物(SEQID NO8)均为TGGTGTCGTGGAGTCG； miR-199a的PCR反向引物(SEQ ID NO9)为CGCCGCCCAGTGTTCAGA。
PCR正向引物分别为 miR-16(SEQ ID NO10)ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA miR-21(SEQ ID NO11)ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA miR-106a(SEQ ID NO12)ACACTCCAGCTGGGAAAAGTGCTTACAGTG miR-126(SEQ ID NO13)ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT miR-155(SEQ ID NO14)ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT miR-335(SEQ ID NO15)ACACTCCAGCTGGGTCAAGAGCAATAACGAA miR-199a(SEQ ID NO16)CGAGGGTCCGAGGTATTCCG 3)探针 miR-16(SEQ ID NO17)(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA(MGB)； miR-21(SEQ ID NO18)(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAACATC(MGB)； miR-106a(SEQ ID NO19)(6-FAM)TTCAGTTGAGTACCTGCA(MGB)； miR-126(SEQ ID NO20)(6-FAM)TTCAGTTGAGGCATTATT(MGB)； miR-155(SEQ ID NO21)(6-FAM)TTCAGTTGAGCCCCTATC(MGB)； miR-335(SEQ ID NO22)(6-FAM)TTCAGTTGAGACATTTTT(MGB)； miR-199a(SEQ ID NO23)(6-FAM)TTCAGTTGAGGAACAGGT(MGB)。
4.cDNA合成 1)反转录合成cDNA 在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入 血清总RNA 40.00ng DEPC-H2O 5.00μl 70℃变性5min，冰上放置3min，再依次加入 RNase抑制剂(40U/μl) 0.25μl dNTP混合物(各10mM，RNase-free)0.75μl 5×M-MuLV缓冲液 3.00μl 茎环结构反转录引物(2μM) 0.50μl M-MuLV反转录酶(200U/μl) 0.25μl 补加DEPC-H2O至终体积15μl 混匀后稍离心在PCR仪中进行反应；反应参数设置为 16℃15min 42℃60min 85℃5min 4℃ 保存 本发明我们对每种miRNA设计了各自的特异性茎环结构反转录引物，单独进行如上操作，单管合成cDNA。
2)将RT产物(cDNA)进行PCR扩增反应 在0.2ml PCR管中依次加入 10×PCR反应缓冲液 1.00μl dNTP混合物(各10mM)0.80μl Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.05μl PCR正向引物(10μM)0.20μl PCR反向引物(10μM)0.20μl cDNA 0.40μl 补加ddH2O至终体积 10μl 混匀后稍离心在PCR仪中进行反应；反应参数设置为
3)反应结束后取3μl反应液，进行8％DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结果如图1所示。
5.基于DNA染料法的荧光定量PCR检测 在新的0.2μL光学PCR反应管中依次加入 real-time PCR Master Mix 5.00μl 50×ROX reference 0.20μl PCR正向引物(10μM)0.20μl PCR反向引物(10μM)0.20μl cDNA 1.00μl 补加ddH2O至终体积 10μl 混匀后稍离心，反应参数设置为
60℃ 1min 6.基于TaqMan探针法的荧光定量PCR检测 在新的0.2μL光学PCR反应管中依次加入 10×buffer 2.00μl dNTPs mixture(10mmol)0.40μl MgCl21.20μl Taq 0.30μl cDNA 1.00μl PCR正向引物(10μM) 0.20μl PCR正向引物(10μM) 0.20μl TaqMan probe(0.2μm) 0.33μl 补加ddH2O至终体积20μl 混匀后稍离心，反应参数设置为
以上两种荧光定量检测方法只需选择采用一种即可。
(四)数据处理 荧光定量PCR定量检测miRNA的相对表达变化量时，以miR-16为内参基因，来对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。表达量倍数的变化用公式RQ＝2-ΔΔCT，其中ΔΔCT＝(CTmiRNA-CTmiR-16)BC-(CTmiRNA-CTmiR-16)Mean BN。RQ代表相对表达量(relative quantation)，CTmiRNA和CTmiR-16分别代表荧光定量检测到的目标miRNA和内参基因miR-16的Ct值，BC代表乳腺肿瘤组织或血清，BN代表与肿瘤组织或血清对应的正常对照组，Mean BN代表所有正常对照组中的平均值。以上数据，即Ct值均可由荧光定量检测仪配带的检测软件阅读出。定量中设立重复实验和阴性对照实验，定量实验的每个样本重复3次，阴性对照中不加模板cDNA，而以水代替，用于检验是否存在PCR污染和较高的引物二聚体污染。
荧光定量数据的统计学分析采用SPSS 16.0统计分析软件。miRNA在两样本中的相对表达量分析采用levene’s卡方检验和independent-samples t检验，当P值≤0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，当P值＜0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异。miRNA在不同病理的乳腺肿瘤患者的血清中表达的差异性分析的直观表现通过绘制含误差线的柱状图实现，如图7-11，采用OrginPro 7.5绘图软件；不同临床病理指标水平上，miRNA在乳腺肿瘤组织和血清中表达的相似性分析直观表现通过绘制含误差线的折线图实现，如图3-6，采用OrginPro 7.5绘图软件。误差均主要来自于不同的病人样本，不同的RNA提取步骤和不同的实验操作环境中。
相关系数分析采用皮尔逊相关系数(Pearson’s correlation coefficien)来描述呈线性关系的两变量之间相关关系的密切程度和相关方向的指标。其值在-1至+1之间，用r表示，r越接近于1或-1，相关性越好，分别表示正相关和负相关；越接近于0，相关性越差。miRNA在乳腺肿瘤组织和血清中表达的相关性分析的直观表现通过绘制以血清样本为横坐标轴，以组织样本为纵坐标轴的的散点图实现，如图2；采用SPSS 16.0软件。
试剂盒检测数据经荧光定量数据分析后，RQ≥2时，则认为两样本存在显著差异，进而可区分两病理现象，6种miRNA对乳腺肿瘤与正常人群及乳腺肿瘤各临床病理的区分数据请见表2，所有数据均经荧光定量相对表达量分析和统计学分析，结论可靠，使用该试剂盒检测时可依据表中数据(当RQ≥2时，即可区分)。
表2miRNA在各病理间的相对表达变化量及实验分析所用样本的统计学P值
aRQ＝2-ΔΔCT(病理1)/2-ΔΔCT(病理2)，ΔΔCT＝(CTmiRNA-CTmiR-16)BC-(CTmiRNA-CTmiR-16)Mean BN b采用SPSS 16.0(Sep 13，2007)统计分析RT-q-PCR所得的miRNA相对表达量数据，其中通过Levene′s检验两样本标准差是否相等，通过两独立样本t检验计算P值。
cP值以一个星号(*)标记表明其小于显著性标准0.05。
dP值以两个星号(**)标记表明其小于极显著性标准0.01。/ 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，所述miRNA还可应用于乳腺肿瘤患者的组织，唾液，尿液，血浆等体液的检测。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO1
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA；
SEQ ID NO2
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC
SEQ ID NO3
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGC
SEQ ID NO4
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCATTAT
SEQ ID NO5
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAT
SEQ ID NO6
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATTTTT
SEQ ID NO7
GTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACAG
SEQ ID NO8
TGGTGTCGTGGAGTCG
SEQ ID NO9
CGCCGCCCAGTGTTCAGA
SEQ ID NO10
ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA
SEQ ID NO11
ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA
SEQ ID NO12
ACACTCCAGCTGGGAAAAGTGCTTACAGTG
SEQ ID NO13
ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT
SEQ ID NO14
ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT
SEQ ID NO15
ACACTCCAGCTGGGTCAAGAGCAATAACGAA
SEQ ID NO16
CGAGGGTCCGAGGTATTCCG
SEQ ID NO17
TTCAGTTGAGCGCCAATA
SEQ ID NO18
TTCAGTTGAGTCAACATC
SEQ ID NO19
TTCAGTTGAGTACCTGCA
SEQ ID NO20
TTCAGTTGAGGCATTATT
SEQ ID NO21
TTCAGTTGAGCCCCTATC；
SEQ ID NO22
TTCAGTTGAGACATTTTT
SEQ ID NO23
TTCAGTTGAGGAACAGGT
权利要求
1.一种检测乳腺肿瘤的血清学生物标记物，其特征在于包含以下所列miRNA中的至少一种
miR-21uagcuuaucagacugauguuga；
miR-106aaaaagugcuuacagugcagguag；
miR-126ucguaccgugaguaauaaugcg；
miR-155uuaaugcuaaucgugauaggggu；
miR-335ucaagagcaauaacgaaaaaugu；
miR-199acccaguguucagacuaccuguuc。
2.如权利要求1所述的血清学生物标记物的用途，其特征是制备用于筛查乳腺肿瘤或辅助乳腺肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的血清学生物标记物的用途，其特征是所述试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统；
所述反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；
所述引物系统由miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a中的至少一种的茎环结构反转录引物、扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成；
所述引物探针系统由miR-21，miR-106a，miR-126，miR-155，miR-335和miR-199a中的至少一种的茎环结构反转录引物、扩增引物及探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物及探针组成。
4.根据权利要求3所述的血清学生物标记物的用途，其特征是所述试剂盒还包括扩增系统；所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。
5.根据权利要求3或4所述的血清学生物标记物的用途，其特征在于检测该标志物的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。
6.根据权利要求5所述的血清学生物标记物的用途，其特征在于茎环结构反转录引物，分别由以下核苷酸序列组成
miR-21CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC；
miR-106aCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTGC；
miR-126CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCATTAT；
miR-155CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAT；
miR-335CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATTTTT；
miR-199aGTCGTATCCAGTCGAGGGTCCGAGGTATTCCGACTGGATACGACGAACAG。
7.根据权利要求6所述的血清学生物标记物的用途，其特征在于所述荧光定量PCR为DNA染料法或TaqMan探针法。
8.根据权利要求7所述的血清学生物标记物的用途，其特征在于特异性PCR引物由以下核苷酸序列组成
PCR正向引物
miR-21ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA；
miR-106aACACTCCAGCTGGGAAAAGTGCTTACAGTG；
miR-126ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT；
miR-155ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT；
miR-335ACACTCCAGCTGGGTCAAGAGCAATAACGAA；
miR-199aCGAGGGTCCGAGGTATTCCG；
miR-21、miR-106a、miR-126、miR-155、miR-335的PCR反向引物均为TGGTGTCGTGGAGTCG；
miR-199a的PCR反向引物为CGCCGCCCAGTGTTCAGA。
9.根据权利要求8所述的血清学生物标记物的用途，其特征在于探针由以下核苷酸序列组成
miR-21(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAACATC(MGB)；
miR-106a(6-FAM)TTCAGTTGAGTACCTGCA(MGB)；
miR-126(6-FAM)TTCAGTTGAGGCATTATT(MGB)；
miR-155(6-FAM)TTCAGTTGAGCCCCTATC(MGB)；
miR-335(6-FAM)TTCAGTTGAGACATTTTT(MGB)；
miR-199a(6-FAM)TTCAGTTGAGGAACAGGT(MGB)。
10.根据权利要求9所述的血清学生物标记物的用途，其特征在于在荧光定量PCR检测方法中，使用保守性miRNA的miR-16作为内参照基因，其序列、引物及探针由以下核苷酸序列组成
序列uauugcacuugucccggccugu；
茎环引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA；
PCR正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA；
PCR反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG；
探针(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA(MGB)。
全文摘要
本发明公开了一种检测乳腺肿瘤的血清学生物标记物，其特征在于包含以下所列miRNA 中的至少一种miR-21uagcuuaucagacugauguuga；miR-106aaaaagugcuuacagugcagguag；miR-126ucguaccgugaguaauaaugcg；miR-155uuaaugcuaaucgugauaggggu；miR-335ucaagagcaauaacgaaaaaugu；miR-199acccaguguucagacuaccuguuc。本发明还同时公开了该标记物的用途制备用于筛查乳腺肿瘤或辅助乳腺肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒；试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统。
文档编号C12Q1/68GK101709328SQ20091015527
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者丁先锋, 郭江峰, 王凤军 申请人:浙江理工大学