胸腺素alpha原在制备乳腺癌诊断标记物中的应用的制作方法
【专利摘要】胸腺素alpha原在制备乳腺癌诊断标记物中的应用，涉及肿瘤标记物。采用斑点杂交法和ELISA方法检测乳腺癌患者尿液中胸腺素alpha原蛋白的水平，探讨胸腺素alpha原与乳腺癌生物学行为的关系。采用免疫检测方法，只需要检测尿液中的胸腺素alpha原水平，并能快速地证明乳腺癌病人尿液中的胸腺素alpha原水平明显高于正常人，对乳腺癌进行初步判断，为进一步诊断提供依据。所需尿液样品容易获取，不需要有任何创伤，不需要昂贵的仪器设备，方便操作，容易推广应用。
【专利说明】胸腺素 alpha原在制备乳腺癌诊断标记物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤标记物，尤其是涉及胸腺素 alpha原在制备乳腺癌诊断标记物中 的应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性恶性肿瘤中常见的一种，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开 始一直呈上升趋势[Yang L, Parkin DM, Ferlay J, et al. Estimates of cancer incidence in China for 2000 and projections for 2005 [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005, 14(1) :243-250]。8名妇女中就会有一人患乳腺癌，中国不是乳腺癌的高发国 家，但不宜乐观，今年我国乳腺癌发病率的增长速度高出发达国家1?2个百分点。据国家 癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的的乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记 地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位[全国肿瘤防治研究办公室，全国肿瘤登记 中心，卫生部疾病防御控制局.全国第三次死因回顾抽样调查[M].北京：人名卫生出版 社，2012:120-131]。
[0003] 目前，乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题，究其原因，1 :早期乳腺 癌往往不具备典型的症状和体征，不易引起重视；2 :在乳腺门诊，医生了解病史后首 先会进行体检，检查双侧乳腺，结合影像学检查，包括乳腺学检查，包括乳腺X线摄 影（乳腺钥祀照相）[Armstrong K，Handorf EA，Chen J，et al.Breast cancer risk prediction and mammography biopsy decisions: a model-based study[J]. Am J Prev Med，2013, 44:15-22]、彩超，必要时还要进行乳腺磁共振检查[王鹏.保乳手术治疗早期乳 腺癌86例疗效观察[J] ·当代军医，2012, 18 (9) : 107-108]，以上检测手段费用高，时间长， 更加频繁的辐射使乳腺癌的风险显著增加。
[0004] 为了补充乳腺癌筛选方法，我们尝试使用肿瘤标记物水平来诊断乳腺癌。
[0005] 肿瘤标志物是由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织，或分泌至血液，或其他体液，或 因肿瘤组织刺激，由宿主细胞产生而含量明显高于正常参考值的一类物质。随着医学的发 展，近年来，许多学者致力于发现肿瘤特征性的标记物，为恶性肿瘤的早期诊断提供新的方 向。
[0006] 胸腺素 alpha原是一种在体内广泛表达的强酸性蛋白质，其功能与细胞免疫调节、 细胞增殖和细胞凋亡有关[Wu C L，Shiau A L, Lin C C. Prothymosin alpha promotes cell proliferation in NIH3T3 cells [J]· Life Sci, 1997, 61:2091-2099]，作为一种典型的肿 瘤相关蛋白，在细胞增殖和凋亡调控方面的深入研究有助于发现细胞癌变的发生机理，曾 在多种癌症中检测到了 PTMA水平的升高[郑金来，刘個辛，高兰兴.胸腺素 α原研究进展 [J].国外医学免疫学分册，1998, 21 (4) :210-214]，这种在癌细胞中高水平的ΡΤΜΑ蛋白产 物不仅维持细胞处于高度增殖状态，还保护细胞避免进入凋亡途径[Evatafieva a G，Belov C A, Rubtsov Y P, et al.Apoptosis-related fragmentation, translocation and properties of human prothymosinalpha[J].Exp Cell Res，2003,284(2):211_223]，有报 导指出，乳腺癌患者体内β族胸腺素含量增高[兰海燕等.胸腺素 β 4和β 10及β 15在 乳腺癌中的表达及意义[J].中国肿瘤临床与康复，2009, 16 (1) : 22-24]，可作为术后复发 标记物，但乳腺癌体内胸腺素 alpha原表达情况却鲜见报道[徐雅莉等.中国女性乳腺癌 发病相关危险因素病例对照研究[J].协和医学杂志，2011，2:7-14]。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供胸腺素 alpha原在制备乳腺癌诊断标记物中的应用。
[0008] 本发明检测了正常人、乳腺癌尿液中胸腺素 alpha原蛋白的水平，以证明和评价 胸腺素 alpha原作为肿瘤诊断新标记物的可行性提供依据，其结果为广大女性提供一种更 方便快捷的诊断方法，并为进一步研究胸腺素 alpha原在肿瘤发生和治疗中的生物学功能 提供依据。本发明为此提供了以下免疫学实验：
[0009] 1) D0T-BL0T法检测胸腺素 alpha原在样本中的水平；
[0010] 2) ELISA法检测胸腺素 alpha原在样本中的水平。
[0011] 本发明采用斑点杂交法和ELISA方法检测乳腺癌患者尿液中胸腺素 alpha原蛋白 的水平，探讨胸腺素 alpha原与乳腺癌生物学行为的关系。
[0012] 本发明所述胸腺素 alpha原作为乳腺癌诊断标记物，尤其是通过检测人体尿液中 的胸腺素 alpha原水平来进行乳腺癌诊断，迄今尚未见有相关报道。
[0013] 本发明通过人体尿液中的胸腺素 alpha原水平检测，对乳腺癌的诊断提供依据， 为乳腺癌的治疗和预后判断提供科学依据，同时也为乳腺癌的治疗方法的筛选及疗效判断 提供依据。此外，通过本发明的实施，还为胸腺素 alpha原在参与肿瘤细胞的迁移、生长过 程在其中发挥的重要调控功能，阐明胸腺素 alpha原与肿瘤发生发展的相关性，为今后乳 腺癌新靶点的治疗提供一种新的治疗途径。
[0014] 本发明的优点与积极效果在于，采用免疫检测方法，只需要检测尿液中的胸腺素 alpha原水平，并能快速地证明乳腺癌病人尿液中的胸腺素 alpha原水平明显高于正常人， 对乳腺癌进行初步判断，为进一步诊断提供依据。本发明所需尿液样品容易获取，不需要有 任何创伤，不需要昂贵的仪器设备，方便操作，容易推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为胸腺素 alpha原在乳腺癌病人与正常人尿液中的斑点杂交法检测结果。
[0016] 图2为乳腺癌病人与正常人尿液ELISA检测后0D45(I值统计结果。在图2中，横坐 标：正常，代表健康人；病人，代表乳腺癌病人；纵坐标：〇D值，代表吸光度；P = 0. 003代表 统计结果，**代表极显著。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例仅为帮助所属领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。
[0018] 实施例1 D0T-BL0T法定性检测胸腺素 alpha原在肿瘤人与正常人尿液中的水平。
[0019] 用制备的胸腺素 alpha原多克隆抗体，采用斑点杂交方法，以肿瘤病人尿液为检 测对象，检测其中胸腺素 alpha原水平，以正常健康人尿液为对照（尿液样品均来自厦门大 学附属中山医院，由主管技师梁贤明提供）。
[0020] 1)将尿液按表1滴（2 μ L)于NC膜上，待干燥之后用封闭液37°C封闭2h ;
[0021] 2)兔抗胸腺素 alpha原（1 : 1000)孵育，4°C过夜；
[0022] 3)用PBST洗膜3次，摇床震荡，每次5min ;
[0023] 4)HRP标记羊抗兔二抗（1 : 1000)室温孵育lh ;
[0024] 5)用PBST洗膜，3次，每次lOmin，然后用DAB显色。
[0025] 采用实施例1中所述的方法，检测胸腺素 alpha原在尿液中的表达水平（参见图 1和表2)，其结果表明正常人检出率为9 %，而乳腺癌病人的检出率为73 %，肿瘤病人中阳 性率远远高于正常人，而IL-2、IFN-γ、PBS空白对照则没有阳性反应。可以证明，本实验作 为乳腺癌诊断具有明显的特异性，可以用于乳腺癌的诊断。
[0026] 实施例2 ELISA法定量检测胸腺素 alpha原在肿瘤人与正常人尿液中的水平。
[0027] 用制备的胸腺素 alpha原单克隆抗体，采用间接ELISA方法，以实施例1中尿液为 检测对象，正常健康人尿液和PBS为对照，检测其中胸腺素 alpha原水平。
[0028] 1)包被：抗原按照表1用Coating buffer稀释成2X，200 μ L/well包板，避光，4°C 过夜。
[0029] 2) PBST 洗板 3 次。
[0030] 3)Blocking buffer(5% 脱脂奶粉）按 200μ L/Well 加入，25°C 封闭 2h。
[0031] 4) PBST洗板3次，最后1次甩干但不扣干。
[0032] 5)小鼠抗胸腺素 alpha原单克隆抗体（1 : 1000)200μ L/well，25°C避光2h。
[0033] 6) PBST洗板3次，最后1次甩干但不扣干。
[0034] 7)HRP-羊抗鼠二抗稀释（1 : 1000)200yL/well快速上样，25°C避光孵育lh。
[0035] 8) PBST洗板3次，最后1次甩干但不扣干。
[0036] 9)加入100 μ 1/孔的TMB，室温、避光显色lh。
[0037] 10)加入100 μ L/孔的2NH2S04终止显色并测0D45Q值。
[0038] 表1乳腺癌病人与正常人尿液编号
[0039]
【权利要求】
1. 胸腺素 alpha原在制备乳腺癌诊断标记物中的应用。
2. 如权利要求1所述应用，其特征在于采用检测尿液中的胸腺素 alpha原水平。
【文档编号】G01N33/574GK104142397SQ201410383719
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】周克夫, 崔若辰, 梁贤明, 王世媛, 陈越月, 段莹, 陈艳芳, 张长弓, 陈雪飞, 孙雨涵, 胡鑫炎 申请人:厦门大学