胸腺肽的制备提取方法及其用药安全的产物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于多肽/蛋白质技术领域，具体而言，本发明涉及胸腺肽的提取方法，其改进了现有的提取方法，所获得的胸腺肽产物更加安全，减少了用药的不良反应的发生。
【背景技术】
[0002]胸腺是人体的重要免疫器官，其能分泌多种重要的激素，如促胸腺生成素、胸腺肽等。其中，胸腺肽(又名胸腺素，thymosin)是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽(组合物)，可以从牛、猪的胸腺里面提取得到，例如，可通过本发明人早期发明的提取方法来提取(参见中国专利第02117757号)。然而，提取的胸腺肽成份复杂，尽管各种肽成份可以起到协同作用或补偿作用，功效更能得到保证，但是发生不良反应的潜在可能性也更大。
[0003]为此，近10年来，人们主要通过基因工程手段来获得成份单一的胸腺肽(化合物)，例如α-胸腺肽、胸腺五肽或它们的衍生物等。通过提取方法获得胸腺肽(组合物)的思路已经逐渐边缘化了，连进行相应研宄的兴趣也基本没有了。
[0004]甚至实际上本发明人也没有免俗，中国专利第02117757号后再开发的技术也基本涉及通过基因工程手段来获得成份单一的胸腺肽(化合物)。然而，本发明人并没有完全受现有技术发展趋势的左右，在长期严谨的实践所不懈积累的数据中偶然发现了一些与提取的胸腺肽的不良反应发生有关联的端倪，经过艰苦的研宄，在提取的胸腺肽的众多成份中发现了一种会增加不良反应发生率的成份，因而摸索出了新的胸腺肽的提取方法，使通过其提取的胸腺肽能大幅降低不良反应发生率，在当前公众和药监部门日益重视药品安全性的情况下，是十分有益的。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于提供新的胸腺肽的提取方法。另外，本发明还提供了通过该方法提取的胸腺肽及其应用等。
[0006]具体而言，在第一方面，本发明提供了制备胸腺肽的方法，其特征在于，其包括以下步骤:
[0007](I)对新鲜的胸腺加入ρΗ2.0-4.0的缓冲溶液，以抑制酶活性；
[0008](2)对胸腺组织缓冲溶液进行处理以破碎细胞(优选在10°C以下用超声波、匀质机或超细技术进行处理)；
[0009](3)任选在5-15分钟内将破碎细胞提取的产物用微波加热至70_85°C (优选80°C )并然后迅速冷却(优选冷却至10°C以下);
[0010](4)冷冻离心得离心液，经截留分子量为6000-10000的超滤柱进行超滤；
[0011](5)应用纳滤技术，将超滤液浓缩(优选浓缩5-15倍)，得浓缩产物；和，
[0012](6)检测并保留不含峰2所对应的成份的浓缩产物，其中，峰2是HPLC图谱上47-49min处(优选约47.8min处，如47.8min处)的峰。
[0013]在本文中，胸腺肽也称提取的胸腺肽，指的是从动物中提取的天然胸腺肽，其通常是从动物(如猪、牛、羊等哺乳动物)的胸腺提取的。优选在本发明第一方面的方法中，胸腺是牛胸腺(如，小牛胸腺、胎牛胸腺)、羊胸腺和/或猪胸腺。
[0014]通过精细的纯化过程，可以直接去除浓缩产物中的峰2所对应的成份，然而优选在本发明第一方面的方法中，检测是取样并进行HPLC检测，然后再保留不含峰2所对应的成份的浓缩产物的批次。
[0015]在本发明的【具体实施方式】中，HPLC检测的条件是以磷酸盐溶液为流动相，以每分钟0.6ml的流速，以色氨酸为内标，并且以260nm波长为检测波长。
[0016]另外，本发明第一方面的方法可以包括弃去含峰2所对应的成份的浓缩产物的步骤。
[0017]在第二方面，本发明提供了提取的胸腺肽，其不含峰2所对应的成份的浓缩产物，其中，峰2是HPLC图谱上47-49min处(优选约47.8min处)的峰。经本发明人研宄发现，峰2所对应的成份会带来潜在的注射用药安全性隐患，尽管仍旧达到目前的用药标准，但是如果去掉，将有益于公众的用药安全，减少医疗纠纷，是值得推广的。
[0018]优选本发明第二方面的胸腺肽是通过本发明第一方面的方法制备的。
[0019]在第三方面，本发明提供了一种药物制剂，其包括本发明第二方面的胸腺肽和药学上可接受的辅剂。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的各种辅料、载体，有赋形剂、稀释剂、填充剂、吸收促进剂、酶抑制剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂和/或粘合剂等，它们与活性成分相容。通过药学教科书或试验手册，运用药学上可接受的辅剂制备常规的药物制剂对本领域普通技术人员来说是熟知的。本发明的药物制剂包含本发明第二方面的胸腺肽作为活性成分，将该胸腺肽和药学上可接受的辅剂组合在一起，配制成各种制剂，优选为固体制剂和液体制剂。本发明的制剂可以为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂、粉针剂(包括冻干粉针剂)、等剂型以及各种缓释剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。本发明优选的是注射剂，包括注射液或注射用冻干粉。例如，可以选用生理盐水与第二方面的胸腺肽配制成注射液。
[0020]在第四方面，本发明提供了本发明第二方面所述的胸腺肽在制备用于慢性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、原发性或继发性T淋巴细胞缺陷病、自身免疫性疾病、细胞免疫功能低下相关的疾病或肿瘤性疾病辅助性治疗的药物中的应用。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况等)确定。如以注射剂形式给药，以药物中的胸腺肽计，给药的剂量为l-50mg胸腺肽/每名成人患者。给药形式根据各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，本发明优选注射的给药形式。
[0021]在第五方面，本发明提供了检测本发明第二方面所述的胸腺肽的方法，其包括将待测的胸腺肽进行HPLC检测并判断HPLC图谱上是否存在47-49min处(优选约47.8min处)的峰，其中HPLC检测的条件是以磷酸盐溶液为流动相，以每分钟0.6ml的流速，以色氨酸为内标，并且以260nm波长为检测波长。该方法能够在取样量很少的情况下，快速检测出待测的胸腺肽是否是本发明第二方面所述的胸腺肽，从而可以判断待测的胸腺肽所属批次的胸腺肽是否是本发明第二方面所述的胸腺肽。
[0022]本发明取得的有益效果在于:进一步提高了胸腺肽用药的安全性，在当前公众和药监部门日益重视药品安全性的情况下，是特别值得推广的；对原有的(提取)制备方法的改动小，增加的制备时间和设备少，还可以沿用原有生产设备。
[0023]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多修改对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
[0024]另外，本发明引用了现有公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文之中，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
【附图说明】
[0025]图1显示了本发明提取的合格胸腺肽的示例性的HPLC图谱，其是由多批次合格的胸腺肽的HPLC图谱重叠而成的。为了保持可见性，叠加在后的曲线做了一定的坐标偏移，但是在各自的峰2位置上没有可检测的峰。其中，从图上左侧开始由下至上依次为批次I