人体血清凝血因子Ⅷ中的病毒过滤方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医用血制品制造方法，具体是采用纳米孔径的过滤材料过滤除去人体 血清凝血因子VDI中的病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 人体血清凝血因子VDKF VID是指从人血衆中提取获得的血液制品，临床上主要用 于凝血因子VDI缺乏所致的凝血障碍纠正，主要是甲型血友病的治疗。为确保产品的临床使 用安全，产品生产过程必须进行病毒去除/灭活步骤，主要的血源性病毒包括脂包膜病毒 例如乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒（HBV)，丙型肝炎病毒，艾滋病毒和人类T细胞白血病病 毒（HTLV-I);无包膜病毒，如肝炎病毒（HAV)以及细小病毒B19和TSE朊病毒导致变异型克 雅氏病（vCJD)。
[0003] 制造工艺必须平衡安全需求(病毒去除和/或灭活的需要）和提供高收率，合理的 成本和有效的高纯度的最终产品，现在使用的领先病毒灭活/去除技术是巴氏灭菌法，干 热处理，S/D处理和纳米过滤，在凝血因子VDI制品上，则通用S/D和干热灭活法，但S/D法和 干热灭活法会导致凝血因子VID效价衰减12 -15%，甚至更高。
[0004] 纳米过滤，也称为"病毒过滤"，是基于使用的膜具有多层微孔结构，可以通过尺寸 排阻清除病毒。该技术条件温和并有效分离蛋白和病毒，包括包膜和无包膜病毒，可用于脆 弱的凝血因子VDI并保持完好的F VDI天然结构。用10 - 35纳米的过滤器能有效去除非脂包 膜细小病毒，如：HAV/猪细小病毒（PPV，一个耐受的病毒模型VTSE (分子大小约18-35nm)。 而凝血因子VDI分子较大，被认为不能有效的穿过l〇-35nm的过滤器，而更大空隙的过滤器 (例如彡35nm)又不能有效去除HAV、B19和TSE 0
[0005] 采用10 - 50nm的过滤器将凝血因子VDI溶液进行病毒过滤时，过滤速度非常缓慢， 且容易造成过滤器堵塞，使整个过滤中断，而且过滤器的有效过滤载量非常小，达不到5L/ m 2。过滤速度小于lL/m2 *h，因此对于凝血因子VDI而言，工业上没有采用过滤方法除去病毒。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种能使人血浆来源的人体血清凝血因子VDI溶液快速流 通过纳滤材料的方法，由此实现采用纳滤方法除去病毒的工业应用。
[0007] 本发明在浓度为10 - 100IU/ml，pH为6. 0 - 8. 0的人体血清凝血因子VID水溶液中 添加浓度为50-500mmol/L的医学上可接受的水溶性二价金属盐，溶液通过10-35纳米孔 径的过滤器除去病毒。
[0008] 本发明中，水溶性二价金属盐可以是钙盐、锌盐、亚锡盐、铜盐、二价锰盐等，优选 是水溶性钙盐或锌盐。水溶性钙盐包括氯化钙、醋酸钙、柠檬酸钙、草酸钙、酒石酸钙、葡萄 糖酸钙或乳酸钙，优选是氯化钙。水溶性锌盐包括氯化锌、硫酸锌、醋酸锌、柠檬酸锌、草酸 锌、酒石酸锌、葡萄糖酸锌或乳酸锌，优选是氯化锌或硫酸锌。
[0009] 钙离子或锌离子浓度优选为200- 400mmol/L。
[0010] 溶液中还可加入氨基酸，其浓度为50-500mmol/L，优选200-500mmol/L。氨基酸 优选为L-精氨酸、L-组氨酸或L-赖氨酸的一种或以上。
[0011] 人体血清凝血因子VID水溶液中，人体血清凝血因子VID效价优选为20- 70IU/ml。
[0012] 本发明通过二价金属盐的极性吸附等作用，降低了凝血因子VDI的粒径，可使凝血 因子VDI顺利通过10 - 35nm孔径的过滤器进行病毒过滤，过滤器载量高于15L/m2,过滤速度 可超过6L/m2 · h，实现纳滤方法除去病毒的工业应用，通过透析可除去加入的金属盐，可恢 复凝血因子VDI的天然结构。过滤过程凝血因子VDI效价的衰减低于10%，优选情况下，凝血因 子VID效价的衰减低于6%，明显优于通用S/D和干热灭活法。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1 :不同钙离子浓度的过滤速度 人体血清凝血因子VDI的制备方法：血浆离心分离后获得冷沉淀，经氢氧化铝吸附或 PEG处理后，经S/D病毒灭活后，层析，洗脱获得含凝血因子VDI的蛋白质水溶液。
[0014] 人体血清凝血因子VDI溶液按下表所列浓度配制，调节pH至6. 95,先测定凝血因子 VID溶液的效价，在室温，操作压力差2. 5bar下，依次通过200nm、50nm和20nm的过滤器串联 过滤，对配制后的凝血因子VDI溶液进行病毒过滤，测出过滤速度和过滤后凝血因子VDI效价 见下表：
【主权项】
1. 人体血清凝血因子VDI中的病毒过滤方法，其特征在于，在浓度为10 - l〇〇IU/ml，pH 为6. 0 - 8. 0的人体血清凝血因子VID水溶液中添加浓度为50- 500mmol/L的医学上可接受 的水溶性二价金属盐，溶液通过10 - 35纳米孔径的过滤器除去病毒。
2. 根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性二价金属盐为水溶性 钙盐或锌盐。
3. 根据权利要求2所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性钙盐为氯化钙、醋酸 钙、柠檬酸钙、草酸钙、酒石酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙。
4. 根据权利要求2所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性锌盐为氯化锌、醋酸 锌、柠檬酸锌、草酸锌、酒石酸锌、葡萄糖酸锌或乳酸锌。
5. 根据权利要求2所述病毒过滤方法，其特征在于，所述水溶性钙盐或锌盐浓度为 200一400mmol/L〇
6. 根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述人体血清凝血因子VDI水溶液 中，人体血清凝血因子VID的效价为20- 70 IU/ml。
7. 根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述溶液中加入氨基酸，浓度为 50一500mmol/L〇
8. 根据权利要求1所述病毒过滤方法，其特征在于，所述氨基酸为L-精氨酸或其盐酸 盐、L-组氨酸或其盐酸盐、L-赖氨酸或其盐酸盐的一种或以上。
9. 根据权利要求7或8所述病毒过滤方法，其特征在于，所述氨基酸含量为200- 500mmol/L〇
【专利摘要】本发明公开一种能使人血浆来源的凝血因子Ⅷ溶液快速流通过纳滤材料的方法，在浓度为10—100IU/ml，pH为6.0—8.0的人体血清凝血因子Ⅷ水溶液中添加浓度为50—500mmol/L的医学上可接受的水溶性二价金属盐，溶液通过10—35纳米孔径的过滤器除去病毒，实现纳滤方法除去病毒的工业应用，通过透析除去加入的金属盐，可恢复凝血因子Ⅷ的天然结构。过滤过程凝血因子Ⅷ效价的衰减低于10%，优选情况下，凝血因子Ⅷ效价的衰减低于6%，明显优于通用S/D和干热灭活法。
【IPC分类】C07K1-34, C07K14-755
【公开号】CN104804078
【申请号】CN201510221518
【发明人】陈成坤, 黄锦程, 王文杰, 黄进英, 蒙勇江, 管红玲
【申请人】广东卫伦生物制药有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月5日