专利名称：利用非结构蛋白3abc鉴别口蹄疫病毒感染的与免疫接种口蹄疫疫苗的牲畜的间接elisa方法
技术领域：
本发明涉及一种畜牧兽医领域中利用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC鉴别口蹄疫病毒感染的牲畜与经免疫接种口蹄疫病毒灭活疫苗的牲畜之间接ELISA方法。
背景技术：
口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，以下简称为FMDV)是引起偶蹄动物口蹄疫的病原，该病是一种高度接触性传染病，可引起世界性大流行。对动物生产及其产品国际贸易带来严重影响，因而世界各国都很重视对该病的预防和控制。
口蹄疫病毒血清型众多，抗原结构复杂，存在广泛的抗原变异。免疫动物在接触新病毒后，也可形成隐性感染而持续带毒。在免疫和非免疫条件下，病毒均可适应机体而长期存在。发达国家往往通过捕杀感染及同居动物，可疑畜群来控制和消灭本病，而发展中国家主要通过注射疫苗来控制该病流行。在采取捕杀政策的国家，如何检测隐性感染动物，在注苗国家如何区分自然感染动物和注苗动物，一直是控制和消灭口蹄疫的重要论题。因而建立一种鉴别注苗动物和感染动物，检测隐性感染动物的方法就成为口蹄疫防制技术的关键。
目前已经认识到口蹄疫病毒感染动物血清中3ABC抗体为阳性而免疫动物血清3ABC抗体为阴性[1]，并且在感染动物体内3ABC抗体在所有非结构蛋白抗体中持续时间最长[2]，因而将3ABC抗体作为鉴别口蹄疫病毒感染与免疫的指标可信度最高。国外已有许多关于应用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC鉴别感染动物与免疫动物的报道，他们所用的抗原大多是在大肠杆菌和杆状病毒中表达的，也有的是人工合成的，所用检测方法主要为电转移免疫印迹(EITB)[3]，简化间接ELISA[2，4，5]，单抗捕获ELISA[6]，阻断ELISA[7]。
本发明所述3ABC间接ELISA鉴别诊断方法建立的基本原理是由于成熟的病毒粒子中除含有少量的3D蛋白酶外，不含有其他的非结构蛋白成份。目前口蹄疫灭活疫苗的生产工艺可以将绝大部分的非结构蛋白除去，因而灭活疫苗免疫动物只能产生结构蛋白抗体和少量的3D抗体，而感染动物非结构蛋白抗体为阳性，尤其是3ABC抗体存在时间最长。因而检测非结构蛋白3ABC抗体从理论上能区分疫苗免疫动物和感染动物。
多年来，口蹄疫病毒感染相关抗原(virus-infection associatedantigen，VIAA，系统命名为3D)的免疫扩散试验一直是活畜检疫的基本方法。但在该方法应用中，常有口蹄疫灭活疫苗免疫两次以上的动物也呈阳性。因此，该法已不适宜活畜检疫，需要新的手段来准确区分免疫动物和感染动物。本发明成功地提供一种能鉴别口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的方法，为我国控制和消灭口蹄疫提供一种有应用价值的诊断工具。
本发明选取中国流行口蹄疫病毒毒株(O型)的非结构蛋白3ABC基因，通过克隆表达，以纯化的3ABC融合蛋白作为鉴别诊断抗原，采用间接ELISA模式，研制出口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒。该法操作简单，耗时短，成本低，高通量。
本发明人针对我国畜牧业领域实际使用的疫苗生产工艺及动物免疫情况，确定了判定标准，从而能够有效区分口蹄疫病毒感染的动物与接种口蹄疫病毒疫苗的动物。此外，采用本发明所述方法还成功实现了与口蹄疫病毒结构蛋白抗体检测配合，确定经口蹄疫灭活疫苗免疫的动物。
发明内容
本发明通过提取口蹄疫病毒基因组RNA，通过反转录和PCR扩增反应，得到3ABC基因cDNA，应用分子生物学技术将其克隆到克隆载体，再将其亚克隆到表达载体中，得到重组表达质粒，转化宿主菌并用IPTG诱导蛋白表达，表达产物通过包涵体的提取、变性、纯化、复性，得到可以作为鉴别诊断抗原的纯3ABC融合蛋白。
将抗原以适当的浓度包被96孔酶标板，用间接ELISA法检测已知口蹄疫病毒感染动物血清及免疫动物和健康动物血清，来确定大肠杆菌表达的3ABC作为检测抗原的敏感性和特异性。
建立鉴别口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的3ABC间接ELISA方法需要解决以下技术问题(1)表达带有6组氨酸标记的融合3ABC蛋白，便于3ABC蛋白的大量生产和纯化；(2)融合蛋白的纯化工艺；(3)纯化3ABC蛋白的复性方法；(4)适合我国国情的3ABC间接ELISA方法检测结果判定标准。
本发明所建立的鉴别口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的3ABC间接ELISA方法，是将口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC先克隆至pGEM-T Easy载体，再亚克隆至表达载体pTriEx-4Neo中，在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达，表达蛋白经包涵体的提取、变性、纯化、复性后用作抗原，用间接ELISA检测动物血清。
建立鉴别口蹄疫病毒感染动物与注苗动物的3ABC间接ELISA方法的具体流程如下(1)3ABC基因的克隆(2)重组表达载体的构建(3)重组表达质粒的诱导表达(4)包涵体的制备(5)包涵体的溶解变性(6)3ABC融合蛋白的纯化
(7)纯化后3ABC融合蛋白的复性(8)3ABC间接ELISA建立样品的效价则为(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)，若效价小于0.20，为阴性；效价在0.20～0.30之间为可疑；效价大于0.30为阳性。如果可疑样品第二次检测仍为可疑，需对同一动物另采样品检测。
我们用本发明所述方法实际检测了3000多份血清，其中包括人工感染动物血清、健康动物血清和经接种口蹄疫病毒疫苗的动物血清。结果100％感染动物血清为阳性，而99％以上经接种口蹄疫病毒疫苗的动物和健康动物血清为阴性，这说明本发明所述3ABC间接ELISA方法具有很高的敏感性和特异性，该能够区分口蹄疫病毒感染动物与接种口蹄疫病毒疫苗的动物。
参考文献[1]Diego M D，Brocchi8 E，Mackay D，et al.The non-structural polyprotein3ABC of foot-and-mouth disease virus as a diagnostic antigen inELISA to differentiate infected from vaccinated cattle.ArchVirol，1997，1422021～2033. Mezencio J M，Babcock G D，Meyer R F，et al.Differentiatingfoot-and-mouth disease virus-infected from vaccinated animals withbaculovirus-expressed specific proteins.Vet Q，1998，20Suppl2S11～13. Bergmann I E，Astudillo V，Malirat CV，et al.Serodiagnostic strategy forestimation of foot-and-mouth disease viral activity through highlysensitive immunoassays using bioengineered nonstructural proteins.VetQ，1998，20Suppl 2s6～9. Lubroth J，Lopez A，Ramalho A K，et al.Cattle response tofoot-and-mouth disease virus nonstructure proteins as antigens withinvaccines produced using different concentrations.Vet Q，1998，20Suppl2S13～17. Mackay D K J，Forsyth M A，Davies P R，et al.Antibody to thenonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus in vaccinatedanimals exposed to infectoin.Vet Q，1998，20Suppl 2S9～11. Brocchi E，De Diego M I，Berlinzani A，et al.Diagnostic potential ofMab-based ELISA’s for antibodies to nonstructural proteins offoot-and-mouth disease virus to differentiate infection fromvaccination.Vet Q，1998，20Suppl 2S20～24. Sorensen K J，Hansen C M，Madsen E S，et al.Blocking ELISA usingthe FMDV non-structural proteins 3D，3AB，and 3ABC produced in thebaculovirus expression system.Vet Q，1998，20Suppl 2s17～20.
实施例实施例1 3ABC基因的克隆1.口蹄疫病毒RNA的提取使用博大科技总RNA提取试剂盒，直接从感染FMDV的BHK21细胞中提取RNA。操作按试剂盒说明书进行。具体步骤如下①取细胞毒250μL加到1.5mL Eppendorf管中，再加入750μLTrizol，振荡混匀，冰浴10min。
②加入200μL氯仿，并剧烈振荡5s，室温放置10min；4℃12000r/min离心15min。
③将水相移入加有50μL异丙醇的新Eppendorf管中，反转混合，室温置10min；4℃12000r/min离心15min。
④移去上清，管底可见白色沉淀，用100μL 75％乙醇洗涤，10000r/min离心10min，弃掉乙醇，37℃干燥。
⑤沉淀溶于10μLRNA级水中(或ddH2O 20～5μL)，55～68℃加热助溶，-20℃保存或立即进行反转录。
2.反转录以下游引物(5’-TTCCACATCTCTTTggTCC-3’)(SEQ ID NO2)为反转录引物，对所提取的RNA进行反转录合成cDNA。
反转录体系为20μL，即病毒RNA 10μL，5×AMV缓冲液4μL，dNTP(2.5mmol/μL)4μL，下游引物1μL，RNasin(20U/μL)0.5μL，AMV酶(10U/μL)1.0μL。离心混匀后，置42℃水浴1h，用于PCR扩增。
3.PCR扩增以步骤2中所得的cDNA为模板，用上游引物(5’-ACgAgAAAgTgTCgAgTCACC-3’)(SEQ ID NO3)和下游引物(5’-TTCCACATCTCTTTggTCC-3’)(SEQ ID NO4)进行PCR扩增。
反应体系为100μL，即10×缓冲液10μL，dNTP(2.5mmol/L)8μL，MgCl2(25mmol/L)6μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板(cDNA)2μL，灭菌水71.5μL，Taq酶(10U/μL)0.5μL。
离心混匀后置PCR自动扩增仪中，94℃预变性4min，进行如下循环94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环后，72℃延伸7min.PCR产物上样5～8μL，在琼脂糖凝胶中进行电泳(80～100V)，扩增产物片段大小若与预期的目的片段大小一致，即可用于后续试验。
4.目的DNA片段的纯化回收先将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳(80V)40min左右。在长波紫外光下观察电泳情况，当目的DNA片段与杂带完全分开后，用清洁手术刀(经火焰消毒)切下含有目的片段的凝胶块(小于300μL)置于1.5mL离心管中。
后续步骤按Roche公司Agarose Gel DNA Extraction Kit说明书进行。具体步骤为①一个吸头将凝胶块轻轻捣碎，每100mg琼脂糖凝胶中加入300μL溶胶液。
②加入10μL玻璃奶，颠倒混匀，于56～60℃水浴10min，并间隔2～3min混匀一次。
③12000r/min离心30s，吸弃上清，用500μL核酸结合液，在混匀器上重悬DNA。
④12000r/min离心30s，吸弃上清；用500μL洗涤液洗涤沉淀丸，涡旋混匀，12000r/min离心30s，吸弃上清；重复一次。
⑤尽量吸尽液体，37℃干燥40min或自然干燥1～2h。
⑥加20～50μL TE缓冲液，混匀，56～60℃水浴10min，每2～3min涡旋一次，12000r/min离心1min，回收上清备用。
5.目的DNA片段与pGEM-T Easy载体的连接由于所使用的Taq酶在聚合过程的最后给产物末端加上一个腺嘌呤(A)，而pGEM-T Easy载体的两个末端各有一个突出的胸腺嘧啶(T)，因此既可防止质粒的自身环化，又可形成粘端连接，使得连接效率大为提高。连接体系为10μL，即2×Buffer 5μL，T4 DNALigase 1μL，pGEM-T Easy载体(10U/μL)1μL，目的DNA 3μL，4℃连接过夜或16℃温育4h以上。
6.感受态细胞的制备(在严格无菌条件下进行)①吸取大肠杆菌DH5α菌液(保存于-70℃冰箱)5μL至3mL的LB培养基中，37℃ 220r/min摇振培养16h左右。
②吸取500μL上述菌液至盛有50mL LB(预热)的三角瓶中，37℃培养至对数生长期(大约2.5～3h)。
③培养物转入50mL离心管中，冰浴10～15min。
④4℃ 4000r/min离心8min。
⑤弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，尽量使培养基控干。
⑥先加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(过滤除菌)重悬沉淀，再加入15mL预冷的CaCl2溶液，冰浴45min。
⑦4℃ 4000r/min离心8min；弃上清，倒置离心管控干残液(2min)，用2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬沉淀，以每管200μL分装于1.5mL Eppendorf管中，4℃过夜。
7.感受态细胞的转化①每管感受态细胞中加入5μL或10μL连接反应物，用枪头轻轻混匀，冰浴45min。
②将离心管小心的转移至42℃水浴中热激90s。
③迅速置于冰浴中冷却3min，然后每管加入预热至37℃的LB培养基800μL，37℃ 220r/min震荡培养1h使细胞复苏。
④4℃ 4000r/min离心2min，弃部分上清，留200μL左右重悬沉淀。
⑤在细胞悬液中加入16μL X-gal(50mg/mL)和4μL IPTG(200mg/mL)，用枪头轻轻混匀，涂布于预至37℃的LB琼脂平板(含氨苄青霉素60μg/mL)上，37℃过夜培养。
8.挑斑在超净工作台里用灭菌牙签从平板上挑取单个白色菌落，接种于含3mL LB培养基(含60μg/mL氨苄青霉素)的链瓶中，同时挑一个蓝斑作阴性对照，37℃220r/min播振培养12～16min。
9.质粒的提取与鉴定碱裂解法小量提取质粒DNA。操作步骤如下①用无菌牙签从LB平板挑取白色单菌落，接种于3mL LB培养液(氨苄青霉素100μg/mL)中，37℃振摇(230r/min)12～16h。
②无菌移取1.5mL菌液置离心管中，12000r/min离心3min，弃上清，倒置控干残留液体。
③每管加入120μL预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris·Cl(pH8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0))，用涡旋器振荡悬浮。
④加入240μL新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH稀释)；1％SDS(用10％SDS稀释))，温和倒置离心管3～4次混匀，然后冰浴放置5min。
⑤加入180μL预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60mL；冰乙酸11.5mL；无离子水28.5mL)，颠倒混和几次，冰浴放置5min。
⑥12000r/min离心8min，将上清转移至另一离心管中，加入500μL Tris饱和酚振荡抽提。
⑦12000r/min离心1min，转移上层水相至一新管中，用Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)振荡抽提。
⑧12000r/min离心1min，上层水相加入2倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀0.5h以上，12000r/min，离心10min。
⑨沉淀用冰冷的70％乙醇洗涤，离心除去残余乙醇，置室温自然干燥。
⑩用30μL含胰RNA酶(20μg/mL)的TE(pH8.0)溶解，室温放置0.5h，电泳观察。
阳性克隆的鉴定①电泳鉴定将所提取的质粒进行电泳，与阴性质粒(蓝斑)进行比较，选出可能为阳性质粒。
②酶切鉴定用EcoR I进行酶切。反应体系为20μL体系，即重组质粒15μL，10×Buffer 2μL，EcoR I 1μL，无菌水2μL，置37℃温箱中，2h后取出，将酶切产物、分子量Marker进行电泳比较。
③PCR鉴定以酶切和电泳为阳性的质粒10倍稀释后取1μL为模板，加入2μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTP(2.5mmol/L)混合物，0.5μL TaqDNA聚合酶(5U/μL)，0.2μL上游引物(201)、0.2μL下游引物(203)，1.2μL MgCl2(25mmol/L)，补水至20μL，进行PCR鉴定，用100bp DNA ladder Marker作为参照。
④重组质粒的测序确证将PCR扩增鉴定、酶切鉴定均为阳性的克隆，过夜培养扩增，送大连宝生物工程公司测序。鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-3ABC。
所得编码3ABC片段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO1)ATCTCAATTCCTTCCCAAAAGGCTGTGCTGTACTTTCTCATTGAGAAGGGTCA
GCACGAAGCAGCAATTGAATTCTTTGAGGGGATGGTGCATGACTCCATCAAGGAGGAGCTCCGGCCTCTCATCCAACAGACCTCATTTGTGAAGCGCGCTTTTAAGCGCCTGAAGGAAAACTTTGAGATAGTTGCCCTGTGTTTGACTCTTTTGGCAAACATAGTGATCATGATCCGCGAGACTCGCAAGAGACAGCAGATGGTGGATGATGCAGTGAACGAGTACATTGAGAAGGCAAACATCACCACGGATGACAAGACTCTTGACGAGGCGGAAAAGAACCCTCTGGAGACCAGCGGTGCCGCCACTGTTGGTTTCAGAGAGAAAACTCTCCCGGGACACAAGGCGAGTGATGACGTGAACTCCGAGCCCGCCAAACCCGTGGAAGAACAACCACAAGCTGAAGGACCCTACACCGGTCCACTCGAGCGTCAAAAACCTCTGAAAGTGAGAGCCAAGCTCCCACAGCAGGAGGGGCCCTACGCTGGTCCGATGGAGAGACAGAAACCGCTGAAAGTGAAAGTGAAAGCCCCGGTCGTTAAGGAAGGACCTTACGAAGGACCGGTGAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCAAAGAACTTGATTGTCACTGAGAGTGGTGCTCCCCCGACTGACTTGCAAAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAGCTCATCCTCGACGGGAAGACGGTGGCCATCTGCTGCGCCACCGGAGTGTTTGGTACTGCCTACCTTGTTCCTCGTCATCTTTTCGCAGAGAAGTATGACAAGATCATGTTGGACGGCAGAGCCATGACAGACAGTGACTACAGAGTGTTTGAGTTTGAGATTAAAGTGAAAGGACAGGACATGCTCTCAGACGCCGCGCTCATGGTGCTTCACCGTGGGAATCGCGTGCGGGACATCACGAAGCACTTCCGTGATGTGGCAAGAATGAAGAAAGGCACCCCCGTCGTCGGCGTGATCAACAACGCTGATGTTGGGAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCCCTTACCTACAAGGACATTGTAGTGTGCATGGACGGAGACACCATGCCCGGTCTCTTCGCCTACAAAGCCGCCACCAAGGCGGGTTACTGTGGAGGAGCCGTTCTTGCAAAGGACGGAGCCGAGACTTTCATCGTCGGCACTCACTCCGCAGGCGGCAACGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTTTCCAGGTCTATGCTGCTTAAAATGAAGGCACACATCGATCCCGAACCACACCACGAG实施例2重组表达载体的构建目的片段与pTriEx-4 Neo载体的酶切回收
①已测序的pGEM-3ABC质粒和pTriEx-4 Neo质粒分别用Sal I和Bgl II与Xho I和Bgl II酶切。
酶切体系(5μL)分别如下，目的基因管为10×buffer D 5μL，BSA1μL，Bgl II 2.5μL，Sal I 2.5μL，H2O 24μL，pGEM-3ABC质粒15μL。载体管为10×buffer D 5μL，BSA 1μL，Bgl II 2.5μL，Xho I 2.5μL，H2O 24μL，pTriEx-4 Neo载体15μL。
②酶切混合物离心混匀后，置37℃水浴消化3h。③取3uL酶切混合物电泳观察，酶切完全后，65℃水浴保温15min灭活内切酶，分别用0.8％琼脂糖凝胶电泳重组质粒和载体酶切产物，切下所需的目的条带，用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收纯化目的片段和载体片段(方法同前)。电泳观察回收情况。
目的片段与表达载体的连接10×ligase buffer 2μL，目的片段12μL，pTriEx-4 Neo载体4μL，T4 DNA ligase 2μL，混匀后置16℃连接5h。
转化取连接产物10μL无菌操作加入200μL Rosetta(DE3)感受态细胞(感受态细胞的制备同前)中进行转化(除涂板时不加IPTG、X-gal外，其它操作步骤均同前)。
重组表达质粒的提取与鉴定用碱裂解法小量提取质粒DNA，进行鉴定。
①重组质粒的电泳鉴定提取的质粒每个上样5uL进行电泳，同时加空白载体对照，选出泳动速度较阴性慢的质粒进行进一步鉴定。
②重组质粒酶切鉴定将电泳选出的质粒取8μL，加Buffer H2μL，BSA 0.5μL，H2O 8μL，EcoR I 1.5μL，37℃水浴消化2h，电泳观察结果。对鉴定为阳性的质粒进行扩增鉴定。
③重组质粒PCR鉴定重组质粒DNA 1∶10稀释后，用引物(上游引物5’-GATGGATCCAGGACCGGTGAAGAAAC-3’；下游引物5’-TTCCACATCTCTTTggTCC-3’)进行扩增，扩增程序为，94℃预变性3min；进行如下循环94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min 20s；30个循环后72℃延伸5min。
经上述鉴定均为阳性的重组表达质粒命名为pTriEx-3ABC。
实施例3重组表达质粒的诱导表达将经过序列分析的重组菌30μL接种至3mL含1％葡萄糖的2×YT培养液(含50μg/mL羧苄青霉素)中，37℃振摇过夜。取过夜培养物200μL接种于20mL含1％葡萄糖的2×YT培养液(含50μg/mL羧苄青霉素)中，剧烈振摇至OD600为0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导表达，在第4小时收集菌液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting分析，检测表达产物。同时用未诱导的菌液作为阴性对照。
实施例4表述产物的检测SDS-PAGE电泳①洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0％琼脂糖封边。配制12％的分离胶20mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖1mL双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置控干液体，加入6mL 5％的积层胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。
②小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液25mmol/L Tris；250mmol/L甘氨酸(pH8.0)；0.1％SDS)，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。
③收集的菌液12000r/min离心3min，用100μL pH7.4的PBS悬浮，加入等体积的2×SDS上样buffer(100mmol/L Tris.c1(pH8.0)；200mmol/L巯基乙醇；4％SDS；0.2％溴酚蓝；20％甘油)，混匀，水浴煮沸5min，用微量进样器上样20μL，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。
④染色 取下凝胶用蒸馏水冲洗，用凝胶5倍体积的考马斯亮兰染色液(45mL暶醮肌45mL水10mL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮兰)浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上室温染色3h。
⑤脱色用30％乙醇和10％冰乙酸的混合液，在脱色播床上脱色过夜，其间更换脱色液3～4次。待兰色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。
⑥结果观察 电泳显示重组表述质粒产生了约59.1ku的蛋白带，与预期的融合蛋白分子量大小相符，其中3ABC蛋白分子量为48.5ku，经薄层扫描分析，目的蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的31.4％。
Western印迹分析①溶液的配制，洗液溶液150mmol/L NaC1，50mmol/L Tris-HCLpH7.5。转移缓冲液39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS，20％甲醇。氨基黑染色液(100mL)0.5g氨基黑10B溶于40mL水、50mL甲醇、10mL冰乙酸中。封闭液10mL PBST+0.3g BSA。底物溶液(30mL)30mL PBST中溶解15mg的DAB(二氨基联苯胺)，9mg CoCl2·6H2O加入10μl 30％H2O2混匀后立即使用。
②转印 剪8块滤纸与1块硝酸纤维素膜(NC膜)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡3min，在正极板上按四层滤纸、NC膜、凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，160mA转移2.5h。
③封闭 转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染5min，取出后漂洗脱色，直至背景兰色脱尽。其余NC膜用PBST冲洗，加入10mL封闭液，室温轻轻振摇1～2h。
④与抗体结合 封闭结束后，用PBST冲冼NC膜4～5次，加入PBST 1∶500倍稀释的牛FMDV阳性血清10mL，37℃结合1.5h，用PBST冲洗4～5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1∶2000倍稀释的兔抗牛IgG(二抗)，室温下轻摇孵育1h，取出用PBST冲洗3～4次，每次10min。
⑤底物显色 将NC膜转移到10mL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液中，室温保存。
⑥结果 表达产物经SDS-PAGE电泳的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上进行免疫学反应，结果诱导菌出现一条特异性反应带，未诱导菌未见任何反应带。证明表达产物能与FMDV阳性血清发生反应，且具有很高的特异性。
实施例53ABC融合蛋白质的大量制备1.包涵体的制备收集的菌液按Novagen公司Protein Refolding Kit中试剂及所述方法进行包涵体的制备。即用0.1倍培养体积的1×IB洗液(20mmol/LTris-HCL pH7.5，10mmol/L EDTA，1％Triton X-100)重悬，使其冷至4℃，加入溶菌酶至终浓度100μg/mL，30℃温育15min，超声波裂解。1000g离心10min，收集包涵体，用上述洗液连洗两次。
2.包涵体溶解用Protein Refolding Kit中试剂及说明方法将所提取的包涵体溶解。即计算包涵体的湿重，加入一定量的含有0.3％N-lauroylsarcosine的1×IB裂解缓冲液(50mM CAPS，pH11)重悬包涵体，使包涵体的终浓度为10～20mg/mL，上下吹打，使包涵体裂解，室温裂解15min，1000g室温离心10min，收集上清备用。
3.3ABC融合蛋白纯化每4mL上述上清中加入1mL 50％NTA His.Bind slurry，室温摇培1h，装入空层析柱中，用4mL洗液(8mol/L尿素，0.1mol/LNaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH6.3)洗两次，洗脱非特异性结合在柱子上的蛋白质。接下来用1mL不同pH值的洗脱液(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris，pH5.9和pH4.5)各洗4次，洗脱吸附在柱子上的3ABC融合蛋白，电泳观察，收集只含有3ABC融合蛋白的洗脱液。
4.纯化后3ABC融合蛋白的复性纯化后的蛋白用复性液缓慢稀释至一定浓度，用Novagen公司Protein Refolding Kit中试剂及说明方法进行复性。即先用50倍体积的含0.1mmol/L DTT复性液(20mmol/L Tris-HCL pH8.5)在4℃透析3h以上，并换液一次，继续透析3h以上；用不含DTT的复性液再透析3h以上，并换液一次，以除去DTT。再用大约25倍体积的含有1mmol/L还原型谷胱甘肽和0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽的复性液在4℃透析过夜。
实施例63ABC间接ELISA建立用方阵试验测定纯化复性后抗原的最佳工作浓度。然后进行如下操作①包被以包被缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)将表达产物3ABC蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔50μL，4℃过夜。以洗涤缓冲液PBST洗涤2次，拍干。
②封闭每孔加入50μL封闭液(含5％蔗糖，10％马血清的PBST)，37℃封闭40min。洗涤3次，拍干。
③与一抗结合待检血清样品及阳性和阴性对照用血清稀释液(含5％脱脂奶粉，1％大肠杆菌萃取物的封闭液)1∶100稀释，每孔加入50μL，每一个样加2孔，37℃结合1h。洗涤5次，拍干。
④与二抗结合兔抗牛IgG/HRP用PBST 1∶1500稀释，每孔加入50μL，37℃结合1h。洗涤5次，拍干。
⑤显色每孔加入50μL H2O2/OPD，37℃避光15min。
⑥终止每孔加入1.25mol/L H2SO4，测定OD492。
⑦结果判定待检血清及阳性和阴性对照各有两个结果，均需要计算平均值。
样品的效价则为(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)，
若效价小于0.20，为阴性；效价在0.20～0.30之间为可疑；效价大于0.30为阳性。如果可疑样品第二次检测仍为可疑，需对同一动物另采样品检测。
实施例7 3ABC间接ELISA方法区分口蹄疫病毒感染的动物与接种口蹄疫病毒疫苗的动物用此方法检测了3000多份血清，包括实验感染动物血清，健康动物血清和注苗动物血清。结果100％感染动物血清为阳性，而96％以上注苗动物和健康动物血清为阴性，该结果优于沿用多年的VIAA免疫扩散试验和国外市售的2种同类试剂盒的检测数据，这说明本发明的检测试验具有很高的敏感性和特异性。
以上试验结果说明，该3ABC间接ELISA能够区分感染动物与注苗动物，我们已经成功的建立了鉴别口蹄疫病毒感染动物与注苗动物的3ABC间接ELISA方法。
实施例83ABC间接ELISA方法与结构蛋白抗体检测配合，确定经灭活疫苗免疫的动物。
用3ABC间接ELISA和口蹄疫病毒结构蛋白抗体检测液相阻断ELISA同时检测1000多份血清，包括感染动物血清和注苗动物血清。结果100％感染动物的血清二者均检测为阳性；96％以上的注苗动物血清的3ABC抗体为阴性，而结构蛋白抗体为阳性。
序列表<110>中国农业科学院兰州兽医研究所<120>利用非结构蛋白3ABC鉴别口蹄疫病毒感染的与免疫接种口蹄疫疫苗的牲畜的间接ELISA方法<130>IDC030076<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1311<212>DNA<213>Foot-and-mouth disease virus<400>1atctcaattc cttcccaaaa ggctgtgctg tactttctca ttgagaaggg tcagcacgaa 60gcagcaattg aattctttga ggggatggtg catgactcca tcaaggagga gctccggcct120ctcatccaac agacctcatt tgtgaagcgc gcttttaagc gcctgaagga aaactttgag180atagttgccc tgtgtttgac tcttttggca aacatagtga tcatgatccg cgagactcgc240aagagacagc agatggtgga tgatgcagtg aacgagtaca ttgagaaggc aaacatcacc300acggatgaca agactcttga cgaggcggaa aagaaccctc tggagaccag cggtgccgcc360actgttggtt tcagagagaa aactctcccg ggacacaagg cgagtgatga cgtgaactcc420gagcccgcca aacccgtgga agaacaacca caagctgaag gaccctacac cggtccactc480gagcgtcaaa aacctctgaa agtgagagcc aagctcccac agcaggaggg gccctacgct540ggtccgatgg agagacagaa accgctgaaa gtgaaagtga aagccccggt cgttaaggaa600ggaccttacg aaggaccggt gaagaaacct gtcgctttga aagtgaaagc aaagaacttg660attgtcactg agagtggtgc tcccccgact gacttgcaaa agatggtcat gggtaacacc720aagcctgttg agctcatcct cgacgggaag acggtggcca tctgctgcgc caccggagtg780
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权利要求
1.一种利用3ABC检测口蹄疫病毒的间接ELISA方法，其包括如下步骤①包被以包被缓冲液将表达产物3ABC蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔50μL，4℃过夜；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；②封闭每孔加入5μL封闭液，37℃封闭40分钟。以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；③与一抗结合待检血清样品及任选的阳性和阴性对照用血清稀释液(含5％脱脂奶粉，1％大肠杆菌萃取物的封闭液)1∶100稀释，每孔加入50μL，37℃结合1小时。以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；④与二抗结合兔抗牛IgG/HRP用PBST 1∶1500稀释，每孔加入50μL，37℃结合1小时。以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；⑤显色每孔加入50μL H2O2/OPD，37℃避光15分钟；⑥终止每孔加入1.25mol/L H2SO4，测定OD492.⑦结果判定样品的效价表示为(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)，若效价小于0.20，为阴性；效价在0.20～0.30之间为可疑；效价大于0.30为阳性。
2.权利要求1所述的间接ELISA方法，其中3ABC蛋白如SEQID NO1所示。
3.一种制备用于权利要求1所述ELISA方法的基因工程化3ABC蛋白的方法，包括如下步骤1)将口蹄疫病毒毒株O型的非结构蛋白3ABC克隆至pGEM-TEasy载体；再亚克隆至表达载体pTriEx-4Neo中，在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达，2)将步骤1)中所表达的包涵体经提取、变性、纯化、复性，获得目标蛋白3ABC。
4.权利要求1所述的间接ELISA方法用于区分口蹄疫病毒感染的动物与接种口蹄疫病毒疫苗的动物的用途。
5.权利要求1所述的间接ELISA方法用于鉴定经灭活疫苗免疫的动物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种畜牧兽医领域中利用基因工程表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC鉴别口蹄疫病毒感染的牲畜与经免疫接种口蹄疫病毒灭活疫苗的牲畜之间接ELISA方法。
文档编号G01N33/577GK1603831SQ03160188
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者谢庆阁, 刘在新, 曹轶梅, 卢曾军 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所