检测流感嗜血杆菌六种荚膜血清型的基因液相芯片及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测流感嗜血杆菌全部6中荚膜血清型的基因液相芯片及其制 备方法。本发明还设计利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
【背景技术】
[0002] 液相芯片是基于美国Luminex公司xMAP(flexibleMulti-AnalyteProfiling) 技术开发的多功能芯片平台。它是在不同编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配 体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光 来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基 因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。与传统检测方法相比，液相芯 片技术具有高通量、灵活性好、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。基于上述诸多优 点，液相芯片技术有着不可估量的应用潜力。
[0003] 液相芯片的整个体系基质由直径为5ym的聚苯乙烯微球组成，每种微球在制作 过程中按不同的比例掺入红色和橙色两种荧光染料，以此来对微球进行编号，可将微球分 为100种。每种微球由于荧光染料比例的不同，具有不同的光谱特征，检测过程中可以被激 光特异性识别。利用液相芯片检测时，微球排成单列，逐个经过检测通道，检测仪器同时发 出红色和绿色两束激光。红色激光通过激发微球基质中的颜色，识别微球的编号，从而确定 目标分子的种类，对目标分子进行定性。绿色激光可识别报告分子，经过数字信号处理器， 以数字的形式生成荧光值，由于报告分子偶连着微球，因此根据荧光值的大小就可对要检 测的目标分子进行定量。因此，通过红绿双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和 定量分析。
[0004] 流感嗜血杆菌ZZZ)是以人类为惟一寄生对象的革兰氏 阴性致病菌，广泛寄生于人类鼻咽部。在儿童中常引起呼吸道感染，也可侵入血液继发败 血症、脑膜炎等疾病。根据细胞壁外荚膜多糖抗原的不同，流感嗜血杆菌分为a、b、c、d，e、 f这六种血清型。流感嗜血杆菌荚膜基因座包括三部分，regionI和regionIII在所有有荚 膜的流感嗜血杆菌中高度保守，主要功能参与荚膜组分转运出细胞外膜；regionII编码荚 膜类型特异性蛋白。通过查阅相关文献我们用regionII的特异基因来确定荚膜多糖的类 型。
[0005]目前，检测流感嗜血杆菌荚膜血清型的方法主要是传统的玻片凝集实验即抗血清 实验，但缺点也比较明显容易出现交叉凝集和假阳性。近年来也陆续出现一些分子生物学 分型方法如PCR检测技术，且由PCR检测技术衍生出来的实时荧光定量PCR和多重PCR技 术也被应用于流感嗜血杆菌荚膜分型。虽然实时荧光定量PCR的方法特异性高，方便准确， 便于操作，但是仪器昂贵，荧光探针合成困难，极大限制了它的应用。多重PCR技术可以对 多个病原同时检测，但是容易形成非特异性扩增和交叉反应。本发明建立的检测流感嗜血 杆菌全部6种荚膜类型的液相芯片检测系统，操作简便，灵敏度高，特异性强，准确性好。填 补了以往分型检测技术的不足。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的就是提供一种检测婴幼儿呼吸道常见致病菌流感嗜血杆菌六 种荚膜血清型的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体 系、链霉亲和素-藻红蛋白，其主要特征在于所述的捕获探针包含从以下序列中选取的一 种或多种序列： (1) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型a的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQID NO:13 ； (2) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型b的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQID NO:14 ； (3) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型c的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQID NO:15 ； (4) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型d的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQID NO:16 ； (5) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型e的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQID NO:17 ； (6) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型f?的特异基因序列中所选取的核酸序列见SEQID N0:18〇
[0007] 本发明所述的从流感嗜血杆菌血清型a、b、c、d、e和f这6种菌株的荚膜特异基 因序列中所选取的核酸序列分别对应SEQIDNO: 13-SEQIDNO: 18所示的DNA序列中的一 种DNA序列； 本发明所述的引物序列分别对应SEQIDNO: 1-SEQIDNO: 12所示的一条引物顺序。
[0008] 本发明所述的基因液相芯片，其中的引物序列的DNA片段或其互补的DNA片段。
[0009] 本发明所述的基因液相芯片的制备方法，包括核酸提取、微球偶联、PCR扩增及上 机检测。
[0010] 本发明进一步公开了液相芯片在用于流感嗜血杆菌六种荚膜血清型检测方面的 应用。特别是在检测儿童呼吸道感染，继发败血症、脑膜炎疾病中的应用。所应用的检测 探针包括SEQIDN0:13-SEQID勵：18所示的0嫩序列中的至少一种。
[0011] 由上述的技术方案可见，本发明首次将液相芯片技术引入呼吸道常见致病菌流感 嗜血杆菌六种荚膜血清型的检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的液相 芯片及其检测方法，由于操作简便，准确性高，重复性强，该液相芯片在医学检验领域具有 重要的应用价值。
【附图说明】
[0012] 图1 6种荚膜类型特异基因探针特异性比较； 图2包括：图2A荚膜血清型b的灵敏度检测；图2B荚膜血清型d的灵敏度检测； 图2C荚膜血清型e的灵敏度检测； 图3任意2种荚膜血清型的检测； 图4任意3种荚膜血清型的检测； 图5任意4种荚膜血清型的检测； 图6任意5种荚膜血清型的检测； 图7 6种荚膜血清型同时检测； 图注：Hia、Hib、Hie、Hid、Hie、Hif分别代表a血清型的b血清型的 似a、c血清型的 似a、d血清型的 Haemophilus influenza、e MJM鉴抱Haemophilus influenza、i MJM鉴抱Haemophilus。*62等代表微球编号。
[0013] 本发明所用到的流感嗜血杆菌菌种来源如下表1所示： 表1本实验所用到的菌种
a, NationalCollectionofTypeCultures(NCTC),CentralPublicHealth Laboratory,London,UnitedKingdom. b, AmericanTypeCultureCollection(ATCC),USA. 实施例1引物、探针的设计与制备 1、探针的筛选 特异性探针是整个液相芯片技术核心部分，一般采用先设计特异性探针，然后再根据 探针位置来设计相应的引物。
[0014] 由于后期多重PCR的要求，因此在前期设计探针时，应注重保证所有探针Tm值在 一定范围内，本研究选取Tm值范围在55±3°C。设计探针时将探针的长度控制在18-25bp之 间，GC含量控制在30-60%。前期设计时针对每一个靶基因设计了多条特异探针这样不仅保 证可以筛选出即保守又特异的探针，还能更加确保检测结果的可靠性。
[0015] 要想得到既保守又特异的探针如果仅仅靠生物信息学分析是远远不够的，有时候 很符合上述条件的探针在实际杂交过程中却得不到稳定的阳性信号。因此设计好的探针必 须经过实际芯片上机检测进行反复的筛选，才能保证真正有效地探针。
[0016] 本研究经过反复多次的实验筛选，最终获得了每种血清型特异的一种探针序列， 如表2所示： 表2本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的荚膜血清型
2、引物的设计 通过阅读大量文献，本研究最终确定以流感嗜血杆菌荚膜基因座中regionII的特异 基因为革巴基因。利用PrimerPremier5.0设计引物，设定好引物的长度、引物类型、碱基数 目等参数后运行软件，从输出结果中找出Tm值=62 °C±2°C、碱基数在18-30bp之间、弓丨 物间无二聚体、引物内部无二级结构且扩增片段包含探针序列的引物。并且最终要保证所 有引物PCR扩增出来的目的片段在小于300bp。
[0017] 表3芯片所用到的引物
实施例2、基因液相芯片的制备 1、 选取编码微球（bio-rad或Luminex公司），每一条探针对应一个微球编号，6种荚膜 血清型就需要6个不同的微球编号，如061号微球偶联a血清型的流感嗜血杆菌即Hia的 探针，取约1. 25X106个置于离心管，12000rpm/min，离心3-5分钟，小心移去上清； 2、 加入10uL0. 1M的MES(2- (n-吗啉代）乙磺酸溶液)，充分震荡混匀，稍微离心； 3、 用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释至0.lmmol/L;加入4uL稀释的Hia探针于061 号微球悬浮液中，振荡混匀； 4、 加入2. 5uL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混合液中，振荡，室温避 光孵育30分钟，此步要求快速操作； 5、 重复步骤4 ; 6、 用 1mL0? 02%Tween20 洗涤一次，12000rpm/min离心 3-5 分钟； 7、 小心弃上清，微球重悬于1mL0. 1%SDS中，振荡混匀； 8、 12000rpm/min离心3-5分钟，小心弃上清，微球重悬于30uLpH8. 0TE中，振荡悬起 混匀，即得到偶联好的检测微球； 9、 用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度； 10、 把偶联好的检测微球放在4°C避光保存，每种探针偶联的微球单独保存，使用时，根 据检测项目选择要混合的微球种类。
[0018] 实施例3、样本核酸的提取 1、取1.5mL菌液离心管中，8000rpm离心5分钟，弃上清，重复洗一次。
[0019] 2、加入 250yL50mMTris-HCl缓冲液（pH8. 0)重悬，12000rpm离心 5 分钟， 弃上清。
[0020] 3、加入 250yL50mMTris-HCl缓冲液（pH8. 0)重悬，再加 10yL0? 45M EDTA(pH8. 0)，充分悬浮，37°C温浴20分钟。
[0021] 4、加入10yL20mg/mL溶菌酶，37°C温浴20分钟。
[0022] 5、加入1.5yL20mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。
[0023] 6、加入15yL10%SDS，50°C水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀