若干次。
[0024] 7、加 2yL20mg/mLRNAse，65°C水浴 30 分钟。
[0025] 8、用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中。
[0026] 9、在通风橱中加入250yL苯酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)，充分混匀，12000rpm， 4°C离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次。
[0027] 10、在通风橱中加入250yL氯仿：异戊醇（24 :1)，充分混匀，12000rpm，4°C离心 10分钟，上清液转移到新的离心管。
[0028] 11、加入2. 5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于-80°C沉淀DNA。12000rpm ，4°C离心 15min〇
[0029]12、用1mL70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65°C，10min烘干。
[0030] 13、用30yLTE溶解，并于-20。C冰箱备用。
[0031]实施例4、样本PCR扩增
以回收的上清液作为PCR反应的模板，PCR反应体系及反应条件： PCR反应体系：
反应结束后以2%的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况 实施例5、检测 1、 悬摇、超声处理微球（已交联探针）20秒以重悬之； 2、 配制混合微球工作液：用1. 5xTMAC杂交液将各组微球稀释至150个/ul;(注：每 个反应需要33ul混合微球工作液） 3、 悬摇、超声处理微球20秒以混勾工作液； 4、 向每个反应孔及空白对照孔中加入33ul工作液； 5、 向每个空白孔中加入17ulTE(pH8. 0);而向每个样品孔中分别加入已生物素化的 扩增产物17ul; 6、 用枪上下吹吸数次以混匀各反应孔； 7、 盖好反应板以防止挥发，将其置于95-100°C5分钟以使PCR产物双链变性； 8、 之后再将反应板置于57°C15分钟； 9、 配制新鲜的显色液：用1xTMAC杂交液将streptavidin-R-phycoerythrin(链霉亲 和素-藻红蛋白）配成2-4ug/ml;(注：每孔需75ul显色液） 10、 用1xTMAC杂交液将1. 2um的Milliporefilterplate预湿一下，之后再负压抽 空；之后将杂交好的反应液移入已预湿的孔中，用负压抽空以去除上清；之后再每孔加入 75ul显色液，并用排枪上下吹吸数次以重悬反应液；迅速将反应液移回PCR板中； 11、 将反应板再置于杂交温度120r/min孵育15分钟； 12、 反应完成后，在57°C上，用Luminex100机器检测； 13、BlO-Plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而 对微球编号进行识别，绿色激光对微球表面结合的荧光染料进行识别，实现捕获探针捕获 的PCR产物的定量分析。
[0032] 在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测作为检测本底。对于每个检测体系和 检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值(Median FluorescenceIntensity，MFI),也就是读取的这种编号的微球群（>100个）的每个微球 信号强度的统计平均值。结果判读：当待检测样本的MFI值为其对应的检测背景信号强度 的5倍以上时即判为阳性。
[0033] 实施例6、荚膜血清型灵敏度检测 为了探究该发明的检测灵敏度，我们对6种荚膜血清型中的3种（Hib，Hid，Hie)进行 灵敏度检测实验，具体方法如下： ①用NanoDrop0D仪对提取的基因组浓度进行测定，并分别稀释为lOOng/yLUOng/yL、lng/yL、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、 1fg/ul〇
[0034] ②对基因组进行PCR扩增，芯片杂交，上机检测。
[0035] ③检测结果见图2A，2B，2C。
[0036] 实施例7、任意2种荚膜血清型的检测 为了探究该发明可以用于流感嗜血杆菌至少一种荚膜血清型的检测，我们首先选取任 意2种荚膜血清型进行检测。具体方法如下： ①首先把选定的2种血清型的流感嗜血杆菌的基因组分别都稀释为100ng/yL。
[0037] ②PCR扩增体系如下：
③芯片杂交，上机检测。
[0038] ④检测结果见图3。
[0039] 结果表明： (1) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌a和e两种荚膜血清型的同时检测； (2) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌b和e两种荚膜血清型的同时检测； (3) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌c和e两种荚膜血清型的同时检测； (4) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌至少两种荚膜血清型同时检测。
[0040] 实施例8、任意3种荚膜血清型的检测 为了探究该发明可以用于流感嗜血杆菌至少一种荚膜血清型的检测，我们接着选取任 意3种荚膜血清型进行检测。具体方法如下。
[0041] ①首先把选定的3种血清型的流感嗜血杆菌的基因组分别都稀释为100ng/yL。
[0042] ②PCR扩增体系如下：
③芯片杂交，上机检测。
[0043] ④检测结果见图4 结果表明： (1) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌c、d和e三种荚膜血清型的同时检测； (2) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌b、c和e三种荚膜血清型的同时检测； (3) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌至少三种荚膜血清型同时检测。
[0044] 实施例9、任意4种荚膜血清型的检测 为了探究该发明可以用于流感嗜血杆菌至少一种荚膜血清型的检测，我们接着选取任 意4种荚膜血清型进行检测。具体方法如下： ①首先把选定的4种血清型的流感嗜血杆菌的基因组分别都稀释为100ng/yL。
[0045] ②PCR扩增体系如下：
③芯片杂交，上机检测。
[0046] ④检测结果见图5。
[0047] 结果表明： (1) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌b、c、d和e四种荚膜血清型的同时检测； (2) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌a、c、d和e四种荚膜血清型的同时检测； (3) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌至少四种荚膜血清型同时检测。
[0048] 实施例10、任意5种荚膜血清型的检测 为了探究该发明可以用于流感嗜血杆菌至少一种荚膜血清型的检测，我们接着又选取 任意5种荚膜血清型进行检测。具体方法如下： ①首先把选定的5种血清型的流感嗜血杆菌的基因组分别都稀释为100ng/yL。
[0049] ②PCR扩增体系如下：
③芯片杂交，上机检测。
[0050] ④检测结果见图6。
[0051] ⑤结果表明： (1) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌a、b、c、d和e五种荚膜血清型的同时检测； (2) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌b、c、d、e和f五种荚膜血清型的同时检测； (3) 该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌至少五种荚膜血清型同时检测。
[0052] 实施例11、6种荚膜血清型同时检测 为了探究该发明可以用于流感嗜血杆菌至少一种荚膜血清型的检测，最后我们决定对 流感嗜血杆菌6种荚膜血清型进行同时检测。具体方法如下： ①首先把6种血清型的流感嗜血杆菌的基因组分别都稀释为100ng/yL。
[0053] ②PCR扩增体系如下：
③芯片杂交，上机检测。
[0054] ④检测结果见图7。
[0055] 结果表明：该液相芯片可以用于流感嗜血杆菌六种荚膜血清型同时检测。
【主权项】
1. 一种检测婴幼儿呼吸道常见致病菌流感嗜血杆菌六种荚膜血清型的基因液相芯片， 该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链霉亲和素-藻红蛋白，其主 要特征在于所述的捕获探针包含从SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 18所示选取的一种序列。2. 权利要求1所述的基因液相芯片，其特征在于所述的从流感嗜血杆菌血清型a、b、c、 d、e和f这6种菌株的荚膜特异基因序列中所选取的核酸序列分别对应SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 18所示的DNA序列中的一种DNA序列，其中： (1) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型a的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQ ID NO:13 ； (2) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型b的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQ ID NO:14 ； (3) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型c的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQ ID NO:15 ； (4) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型d的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQ ID NO:16 ； (5) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型e的特异基因序列中所选取的核酸序列；见SEQ ID NO:17 ； (6) 从流感嗜血杆菌荚膜血清型f?的特异基因序列中所选取的核酸序列见SEQ ID N0:18〇3. 权利要求1所述的基因液相芯片，其特征在于所述的引物序列分别对应SEQ ID N0:1-SEQ ID NO: 12所示的一条引物顺序。4. 权利要求1所述的基因液相芯片，其特征在于所述的基因液相芯片的制备方法，包 括核酸提取、微球偶联、PCR扩增及上机检测。5. 权利要求1所述液相芯片在用于流感嗜血杆菌六种荚膜血清型检测方面的应用。6. 权利要求5所述的液相芯片的应用，其特征在于所应用的检测探针包括SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 18所示的DNA序列中的至少一种。7. 权利要求1所述检测婴幼儿呼吸道常见致病菌流感嗜血杆菌六种荚膜血清型基因 液相芯片在制备检测儿童呼吸道感染，继发败血症、脑膜炎疾病中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种检测流感嗜血杆菌六种荚膜血清型的基因液相芯片及检测方法。本发明以流感嗜血杆菌荚膜类型特异性基因为靶基因，建立了检测其6种荚膜类型的液相芯片和检测方法，为流感嗜血杆菌荚膜分型检测提供一条新颖、可靠的途径。利用本发明的基因芯片检测流感嗜血杆菌6种荚膜血清型，具有操作简便、灵敏度高、特异性强和准确性好等诸多优点。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105112509
【申请号】CN201510464704
【发明人】王磊, 曹勃阳, 王素微, 席道义, 冯露
【申请人】南开大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月3日