一种基于多探针富集168基因靶区域的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体涉一种基于多探针富集168基因靶区域的方 法。
【背景技术】
[0002] 癌细胞在破裂和死亡时，会释放出循环肿瘤DNA(ctDNA)等内容物，这种ctDNA是 飘浮在血液中的基因组片段。细胞残骸一般由清道夫细胞（如巨噬细胞）清除，然而肿瘤 细胞体积大且增殖快，导致清道夫细胞应付不过来。对血液中的肿瘤DNA进行检测和测序， 可以帮助人们通过取血得到更全面的癌症信息。
[0003] 2012年，英国癌症研究所的Charles Swanton在对肾脏肿瘤进行DNA测序时发现， 单个肿瘤中存在着惊人的遗传学多样性，只有三分之一的突变是整体共有的。此外，癌转移 形成的二级肿瘤也与原发瘤大相径庭。
[0004] 这些结果说明，标准程序（tissuebiopsy)根本不足以判断癌症的预后情况。而 且活检得到的是静态信息，无法准确反映癌症的演化。在这种情况下，ctDNA就成为了科学 家们的新希望，它能为人们揭示更多的癌症信息，甚至跟踪癌症的发展。
[0005]ctDNA的最大优势在于，能对肿瘤的演化和适应性改变进行监控。可以解释科学 问题，比如，为何那么多靶向性治疗都以失败告终，癌症是怎样发展出抗性的等等。要监控 患者的癌症发展，医生们目前得进行多次活检，以决定下一步的治疗策略，然而癌症晚期患 者通常有多处需要检测的肿瘤，单个肿瘤中也可能存在不同的抵抗机制。更重要的是，活检 有一定的风险性，难以用于肺部等脆弱的器官。相比之下，血检就容易多了。2012年，Diaz 研究团队对接受EGFR抑制剂治疗的患者进行ctDNA分析。他们发现了 42种与癌症抗性有 关的KRAS突变，利用这些突变可以比传统方法早五个月发现肿瘤的变化。如果医生们能够 及时发现癌症的抗性，就可以早点停用已经不起作用的昂贵药物。研究癌症抗性背后的突 变，还有助于开发更有效的癌症疗法或者药物组合。如果能够得到充分利用，血液循环中的 肿瘤DNA将为癌症治疗带来一场变革。
[0006] 但目前ctDNA还无法成为临床上的主要诊疗手段。这是因为，最灵敏的ctDNA检 测（例如BEAMing)需要事先知道想要检测的突变，但获得这样的信息又相当麻烦。外显子 组测序不需要预先知道任何信息，但检测罕见突变的需求深度测序，这样做的成本非常高。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于多探针富集168基因靶区域的方 法，通过将选择来自TCGA数据库以及目前肺癌获批靶向药物靶点、其他肿瘤靶向药物靶 点、临床试验中的靶向药物靶点的168个基因组合在一起，并通过探针捕获技术一次性富 集168个基因多靶点序列，从而实验多基因多靶点并行深度高通量测序，且同时检查基因 的多种变异类型，如突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种基于多探针富集168基因靶区域的方法，包括如下步骤：
[0010] SlgDNA片段化和加接头（adaptor)
[0011] 1. 1)准备所需试剂如下：
[0012] SureSelectQXT终止反应液、SureSelectQXT缓冲液、SureSelectQXT转座酶溶 液、二甲基亚砜（DMS0)、AMPureXP磁珠、乙醇；
[0013] 1. 2)定量待建库样本，调整浓度至25ng/yL，体积2yL;
[0014] L3)PCR仪设置DNA加adaptor程序，设好程序后，点击开启，再立即点击暂停；
[0015] 1. 4)SureSelectQXT缓冲液和SureSelectQXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备 用；
[0016] 1. 5)将SureSelectQXT缓冲液、步骤1. 2)中定量好的50ng待建库样本和 SureSelectQXT转座酶溶液依次添加到PCR管中，于冰上操作配制片段化反应体系，每种 试剂单独添加；配制完成后，短暂离心，再高速涡旋充分混匀20s，并再次短暂离心，完成后 立即将PCR管放置于步骤1. 3)中暂停的PCR仪上，重新启动反应程序；
[0017] 1.6)?〇?完成后，立即将其转移至冰上；然后往其中加32 1^1乂311代3616(^0乂1'终 止反应液，高速涡旋5s，短暂离心，室温孵育lmin;
[0018] S2AMPureXP磁珠纯化
[0019] 2. 1)将AMPureXP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
[0020] 2. 2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1. 5mLEP 管中；
[0021] 2. 3)加入52yL充分混匀的AMPureXP磁珠，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉 底；
[0022] 2. 4)置于混匀仪上室温孵育5min;
[0023] 2. 5)孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠，时间为3-5min，弃上清；
[0024] 2. 6)加300yL现配的70%乙醇，计时lmin，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈， 令干扰的磁珠下沉，弃上清；
[0025] 2. 7)重复步骤 2. 6) -次；
[0026] 2.8)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；
[0027] 2. 9) 37°C烘干磁珠，时间为l_3min，或置于通风厨l-3min使磁珠干燥；干燥完成 后，加36yL不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；
[0028] 2. 10)室温孵育2min，放置磁力架上，取一定量上清至新的PCR管中，即得到纯化 样本并放置冰上；
[0029]S3 捕获前PCR
[0030] 3. 1)所需试剂如下：
[0031]HerculaseIIFusionDNA聚合酶、5XHerculaseII反应缓冲液、每个三磷酸脱 氧核糖核苷（dNTP)25mM的lOOmMdNTP混合液、SureSelectQXT引物混合物、DMS0、AMPure XP磁珠和乙醇；
[0032]3. 2)在冰上操作，将5XHerculaseII反应缓冲液、每个dNTP25mM的lOOmMdNTP 混合液、DMS0、SureSelectQXT引物混合物、HerculaseIIFusionDNA聚合酶配制捕获 前PCR反应混合液，一次反应中各试剂的剂量依次为10yL、0. 5yL、2. 5yL、1yL、1yL和 15yL;
[0033] 3. 3)将步骤3. 2)中制得的捕获前PCR反应混合液加入35yL步骤S2中得到的纯 化样本中，涡旋5s混匀；然后放置于PCR仪上，设置PCR反应程序并启动；反应完毕后得到 捕获前PCR样本并放置冰上；
[0034] S4AMPure XP磁珠纯化
[0035] 4. 1)将XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
[0036] 4.2)将步骤S3得到捕获前PCR样本转移至新的1. 5mLEP管中；
[0037] 4. 3)按照步骤2. 3)-2. 10)进行操作；完成后即得到预文库；
[0038]S5将步骤S4得到预文库进行质量检测和浓度检测，包括预文库DNA的片段大小是 否主要分布在245-325bp、以及DNA浓度是否满足彡500ng;
[0039] S6预文库DNA的准备
[0040] 6. 1)取一定量的通过步骤S5检测的预文库至新PCR管中；
[0041] 6. 2)将步骤6.1)中的样本PCR管放入浓缩仪中进行浓缩蒸干；
[0042] 6. 3)加入12yL不含核酸酶的水进行溶解，得到12yL预文库DNA;
[0043]S7 杂交
[0044] 7. 1)准备所需试剂如下：
[0045]SureSelectQXT快速杂交缓冲液、SureSelectQXT快速封闭液、SureSelect RNase封闭剂、捕获探针库；
[0046] 需要说明的是，所述捕获探针库中的探针主要选取自TCGA数据库以及目前肺癌 获批的靶向药物靶点、其他肿瘤靶向药物靶点和目前临床试验中的靶向药物靶点。
[0047] 7.2)分两管配制混合液，记为A管和B管，A管中，用12yL步骤S6得到的预文库 DNA和5yL的SureSelectQXT快速封闭液配制混合液，用移液器上下吹打8-10次，涡旋 5s混匀，短暂离心；B管中配制捕获库杂交混合液，涡旋5s混匀，放置室温备用；
[0048]7. 3) PCR仪上设置反应程序，体积设置为30 y L ;
[0049]7.4)将A管转移至PCR仪上，启动运行，在运行一段时间暂停运行；
[0050] 7. 5)在PCR仪上，将B管中的捕获库杂交混合液转移至A管中，用移液器上下吹打 8-10次，然后密封好，涡旋5s，快速离心后放回PCR仪上继续杂交反应程序，反应完毕后得 到杂交样本；
[0051]S8T1磁珠捕获
[0052]8. 1)准备所需试剂如下：
[0053] SureSelect结合缓冲液、SureSelect洗液2、SureSelect洗液l、Dynabeads MyOne 链霉素T1磁珠；
[0054]8. 2)将Dynabeads MyOne链霉素T1磁珠涡旋混匀后，取50 y L至新的1. 5mL EP 管中，置于磁力架上静置几分钟，待澄清后弃上清；
[0055] 8. 3)向步骤8.2)已加入T1磁珠的EP管中加入200 y L SureSelect结合缓冲液， 移液器上下吹打10次，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；
[0056] 8. 4)重复步骤8. 3)两次；
[0057] 8. 5)向完成步骤8.4)后的EP管中加入200 y L SureSelect结合缓冲液重悬磁珠 备用；
[0058] 8. 6)将步骤S7最终得到的杂交样本转移至室温，在室温下将30yL杂交样本转移 至步骤8. 5)已加入200yLSureSelect结合缓冲液的EP管中，以1800rmp的速度混匀，在 混匀仪上室温孵育30min;
[0059] 8. 7)按照600y1/样本的量预热SureSelect洗液2,保证步骤8. 10)使用时温度 达 65°C;
[0060] 8. 8)步骤8.6)孵育好的样本短暂离心后放磁力架上，待澄清，弃上清，然后加入 200 y L SureSelect洗液1，吹打8-10次，确保磁珠悬浮；
[0061] 8. 9)高速涡旋8s，短暂离心，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；
[0062] 8. 10)加200yL步骤8. 7)中预热的SureSelect洗液2,移液器上下吹打至少10 次确保磁珠重悬；然后高速涡旋5s，短暂离心；离心完成后，在65°C下孵育lOmin;孵育完 成后，放置于磁力架上静置，待澄清后弃上清；重复上述操作两次；
[0063] 8. 11)快速离心，放置于磁力架上静置，吸干残留液体；然后加入23yL不含核酸 酶的水，混匀，得到23yL带T1