一种骨植入材料表面体外细胞形态与成骨功能的检测与评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物材料检测技术领域，具体涉及一种骨植入材料表面体外细胞形态 与成骨功能的检测与评价方法。
【背景技术】
[0002] 大量研究表明表面骨植入材料形貌和表面化学性质对于植入材料骨结合能力具 有决定性影响，其表面理化特征对骨整合的影响至关重要。因此，越来越多表面处理技术集 中于改变骨植入材料的表面特征，力求提高植入材料与骨结合的效率。目前骨植入材料表 面活性化处理方法包括化学方法、物理方法、物理化学方法和生物化学方法等，具体方法主 要有：酸蚀法、碱化处理、电化学氧化法（阳极氧化）、大气加热法、磷酸钙晶体涂层（HA涂 层）、钛浆涂层、等离子喷涂法、激光处理、喷砂或喷砂酸蚀、生物活性分子修饰、离子注入表 面修饰法、微量元素的修饰等方法。
[0003] 为了使人工骨植入材料与天然骨进行良好骨结合，就必须使人工骨植入材料的各 项性能与天然骨尽量接近，但是对于如何全面系统地判断骨植入材料体外细胞形态与成骨 功能，成为关注热点。现有骨植入材料体外细胞形态与成骨功能检测方法单一、准确性较 差、评价浅层、不够全面，局限性较大。
【发明内容】
[0004] 为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种骨植入材料表面 体外细胞形态与成骨功能的检测与评价方法，该方法从多角度检测及评价骨植入材料对细 胞形态与成骨功能的影响，保证了较高的检测水平，结果更加准确。
[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0006] -种骨植入材料表面体外细胞形态与成骨功能的检测与评价方法，包括以下步 骤：
[0007] 1)取待检测与评价的骨植入材料，观察细胞形态、细胞骨架形态及骨架蛋白分布 情况；
[0008] 2)检测细胞活力、材料表面细胞粘附力和细胞中碱性磷酸酶活性；
[0009] 3)检测胶原分泌及细胞外基质矿化程度；
[0010] 4)测定细胞形态与骨架相关基因、成骨相关基因的表达情况；
[0011] 5)根据以上检测结果对待检测与评价的骨植入材料的性能进行评价：
[0012] 首先判断骨植入材料表面细胞形态是否伸长，细胞末端伸展出的丝状伪足是否增 多，细胞骨架纤维是否增多，判断细胞骨架蛋白表达是否增强；
[0013] 其次，判断在骨植入材料表面的细胞粘附力和碱性磷酸酶活性是否增强；
[0014] 再次，判断胶原分泌及细胞外基质矿化程度是否增强；
[0015] 最后，判断骨架相关基因及成骨相关基因表达是否增强；
[0016] 满足以上结论则证明该骨植入材料符合生物医学安全性要求，反之，则不符合生 物医学安全性要求。
[0017] 步骤1)中观察细胞形态、细胞骨架形态及骨架蛋白分布情况，具体操作如下：
[0018] 检测细胞形态：将待检测的骨植入材料试样消毒后，取细胞接种至24孔培养板 内，培养72h后，用2. 5%戊二醛固定，然后采用梯度浓度的乙醇脱水，再经干燥喷金后用场 发射扫描电子显微镜对细胞形态进行观察；
[0019] 检测骨架形态：用4%多聚甲醛固定，用50yg/mL罗丹明标记的鬼笔环肽室温孵 育后，经DAPI染色，再用荧光防淬剂封片，采用激光共聚焦显微镜对细胞骨架的分布及形 态进行观察；
[0020] 检测骨架蛋白分布：使用质量分数为4%多聚甲醛固定，用0. 1%triton-X100室 温放置15分钟，后加入山羊血清，室温封闭1小时，去掉血清，加一抗，于4°C孵育过夜，室温 复温1小时，避光加入FITC标记的二抗，室温避光孵育1小时，避光加入罗丹明标记的鬼笔 环肽孵育40分钟，避光加入DAPI溶液染色20分钟，再用荧光防淬剂封片，采用倒置荧光显 微镜观察Cdc42、RhoA及Racl细胞骨架蛋白在细胞内分布情况。
[0021] 步骤2)中检测细胞活力、材料表面细胞粘附力和细胞中碱性磷酸酶活性，具体操 作如下：
[0022] 检测细胞活力：待检测细胞接种至骨植入材料后，将细胞培养3天或7天后，将试 样转移至新的24孔培养板后，加入CCK-8及培养液，孵育3小时后，将溶液转移至96孔板， 空白孔调零，在450nm处使用酶标仪测定吸光度值；
[0023] 检测材料表面细胞粘附：将待检测的骨植入材料试样消毒后，取细胞接种至24孔 培养板内，培养30min、lh、2h和3h后终止细胞培养，用2. 5 %戊二醛固定后全程避光，用 DAPI进行染色，将漂洗后的试样反扣在新的24孔板，用倒置荧光显微镜观随机选择四个视 野拍照纪录，利用ImageJ分析软件进行细胞计数；
[0024] 碱性磷酸酶测定：细胞接种48小时后，将培养液更换为成骨诱导培养液，培养7 天，用4%多聚甲醛固定，使用NBT/BCIP碱性磷酸酶活性试剂盒，根据实验流程加样显色， 体式显微镜下观察拍照，进行碱性磷酸酶活性检测。
[0025] 步骤3)中检测胶原分泌及细胞外记住矿化程度，具体操作如下：
[0026] 检测胶原分泌：细胞接种至24孔培养板内，将培养液更换为成骨诱导培养液，并 培养14天，用4%多聚甲醛溶液固定，使用1 %天狼星红/苦味酸溶液染色18~24h后，室 温环境中自然干燥；使用体式显微镜观察并拍照；同时，对试样表面的胶原分泌进行半定 量分析，将试样转移至新的24孔板内，每孔加入胶原染色洗脱液，再吸出染液转移至96孔 板，在酶标仪于波长540nm处检测吸光度值；
[0027] 检测细胞外基质矿化情况：细胞接种至24孔培养板内，将培养液更换为成骨诱导 培养液，培养及诱导14天后，加茜素红染液至试样表面，室温下静置15分钟，置体式显微 镜下观察并拍照；对试样表面的细胞外基质矿化进行半定量分析：试样放置于新24培养孔 板，每孔分别加入lmL染色洗脱液，摇床上摇匀，当试样上染料充分溶解后，每孔分别吸出3 份染液，每份为150yL，然后加入96孔培养板内，使用150yL单纯洗脱液为对照调零，于波 长620nm处测量吸光度值。
[0028] 步骤4)中测定细胞形态与骨架相关基因、成骨相关基因的表达情况，具体操作如 下：
[0029] 检测细胞形态与骨架相关基因表达：细胞接种至24孔培养板内，培养48小时后更 换培养液，培养细胞3天或7天后终止细胞培养；使用PBS漂洗细胞3次，提取细胞总RNA 并进行实时定量PCR检测Cdc42、Racl及RhoA基因表达；
[0030] 检测成骨相关基因表达：细胞接种至24孔培养板内，培养48小时后更换培养液， 培养细胞3天或7天后终止细胞培养，使用PBS漂洗细胞3次，提取细胞总RNA并进行实时 定量PCR检测Ocn、Bsp、ColI、Opn、ALP、BMP及 0SX基因表达。
[0031] 所述的待检测细胞选自骨髓间充质干细胞、小鼠成骨细胞系细胞、人成骨肉瘤细 胞系细胞或原代培养成骨细胞。
[0032] 所述的待检测与评价的骨植入材料包括钛、钛合金、磷灰石类生物陶瓷及其复合 材料。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0034] 本发明公开的骨植入材料表面体外细胞形态与成骨功能的检测方法，克服了现有 技术的不足，提高骨植入材料表面体外细胞形态与成骨功能的检测标准，增加了细胞骨架 与形态观察、细胞免疫荧光观察、DAPI染色粘附及相关基因表达检测等项目，保证了检测方 法的全面性和先进性，从多角度评估骨植入材料对细胞形态与成骨功能的影响，保证了较 高的检测水平，使检测方法更加准确，检测结果也更可靠。本发明方法为了更好的为骨植入 材料的表面优化设计提供生物学依据，在现有技术的基础上，我们增加了大量检测方法，改 进了部分检测方法，使得该方法全面系统、通过细胞学和分子学交叉综合评价，这对骨植入 材料的表面优化研究具有重大的指导意义。
[0035] 进一步地，比较现有的MTT法，采用CCK8试剂盒检测细胞活性，测量方法更精准， 可操作性强，误差小。
[0036] 进一步地，在以往染色定性观察基础上，通过使用碱性磷酸酶（AKP)与BCA试剂 盒、自制胶原洗脱液与矿化洗脱液结合酶标仪对碱性磷酸酶、胶原分泌、外基质矿化进行定 量或半定量检测，检测方法简单，结果也更加准确。
【附图说明】
[0037] 图1为扫描电镜观察不同形貌（S、R、R5、R20)表面rBMMSCs培养1天时细胞形态；
[0038] 图2为不同形貌（S、R、R5、R20)表面rBMMSCs细胞骨架染色照片；
[0039] 图3为不同形貌（S、R、R5、R20)表面