用于乳腺癌诊断的多生物标记物组和其检测方法,以及利用其抗体的乳腺癌诊断试剂盒的制作方法

用于乳腺癌诊断的多生物标记物组和其检测方法,以及利用其抗体的乳腺癌诊断试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于诊断乳腺癌的生物标记物组，该生物标记物组包含载脂蛋白C1、载脂蛋白（a）、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中的两个或两个蛋白标记物；通过多反应监测在血液样本中检测所述生物标记物组的方法；用于诊断乳腺癌的试剂盒，该试剂盒包含所述生物标记物组中的各蛋白的特异性抗体；以及通过抗原抗体结合反应在血液样品中检测所述标记物组的蛋白的方法。通过MRM方法或抗原抗体结合反应在血液样品中检测蛋白标记物的方法及诊断试剂盒，与使用单一标记物的诊断方法相比，可提供高准确性和敏感性，而且利用从患者获得的血液可简单地诊断乳腺癌，从而有效地用于乳腺癌的早期诊断。
【专利说明】用于乳腺癌诊断的多生物标记物组和其检测方法，以及利 用其抗体的乳腺癌诊断试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及乳腺癌的诊断。更为特别地，本发明涉及能够在血液中有选择地诊断 乳腺癌的发病的多生物标记物组和其检测方法，以及包含特异性识别其抗体的乳腺癌诊断 试剂盒。

【背景技术】
[0002] 乳腺癌的起因尚未明确，但有考虑到各种因素，如雌性激素、家族病史、既往病史、 生育史和饮食习惯。根据2005年国家统计局的一份调查，近年来乳腺癌的发病率迅速增 力口，在1998年超过了宫颈癌。因此，在2001年韩国女性癌症病人中乳腺癌占16. 1%，超越 胃癌，居于首位。尤其在2002年，与2001年相比，乳腺癌（11. 1%)被排名为增长最快的癌 症。对经历着低出生率、短期母乳喂养、月经初潮早及闭经晚等在生理上精力旺盛的变化的 女性而言，受雌性激素刺激的发生会迅速增加，从而乳腺组织的敏感度会上升，而且饮食习 惯变得西化且生存环境受到污染，由于这些理由，近年来乳腺癌的发病率有大幅度增加。
[0003] 鉴于如今西化的实际情况，预计乳腺癌发病率和由乳腺癌导致的死亡率在未来较 长一段时间内还会持续增长。通常，乳腺癌引起淋巴结转移或由癌细胞的生长导致的对周 围组织的侵犯等症状。然而，大多数的乳腺癌在没有任何症状下可通过自我诊断来进行检 查。因此，为了降低由乳腺癌导致的死亡，有效地对乳腺癌进行早期诊断尤为重要（rwi d al_，Breast J.，12: 343-348，2006)。
[0004] 为了诊断乳腺癌，已复合使用过一些方法。至今，70%乳腺癌患者是通过自我诊断 住院的。然而，这种自我身段具有很难区分恶性肿瘤和良性肿瘤块的缺点，用于诊断乳腺癌 的方法包括乳腺X线摄影、超声检查、细针穿刺细胞检查、磁力共振成像等，然而重要的是 最终通过活检检查癌症。所述乳腺X线摄影是指用X射线拍摄乳房并鉴定乳腺癌的方法， 其能良好地区分肿瘤块是否为良性或恶性。此外，所述乳腺X线摄影为一种用于发现潜伏 的肿瘤块的方法，通过自我诊断摸到肿块之前诊断首发癌最有效。然而，所述乳腺X线摄影 具有如下缺点，即对如年轻女性一样乳腺良好发达的或乳房小且纤维较多的韩国女性的诊 断率有所降低。进一步，存在一种经常用X射线摄影乳房可能会导致乳腺癌的争议。作为 这种乳腺X线摄影的替代方法，可使用超声检查。所述超声检查能够有效地区分囊肿和硬 质肿块，然而区分恶性肿瘤和良性肿瘤块的能力会有所降低。
[0005] 为了弥补这种常用诊断方法所带来的缺点，曾试图通过测量患者血液中肿瘤标记 _術:獻惶徽癌〔Clinton et al.，Biomed Sci. Instr腦.39: 408-414，2003; Rui et aL，Proteomics. 3: 433-439, 2003; Soletormos et ah, 48: 229-255, %似）。有研究过这些肿瘤标记物的诊断或预后因素的重要性，然而对其的使用仍受限制， 本领域中还没有官方推荐的乳腺癌标记物。
[0006] 鉴于上述情况，为了研发在诊断乳腺癌中使用乳腺癌患者血液中蛋白量会特异性 变化的蛋白标记的方法，本发明人进行了一些广泛的研究。结果发现，比较根据由多数生物 标记物组成的标记物组的乳腺癌的变化模式时与通过单个生物标记物的变化的方法相比 能够更有效地诊断乳腺癌。为了有效地跟踪多个蛋白标记物，本发明人又发现，可通过多反 应监测来监测能够代表各生物标记蛋白的肽的表达水平来简单地诊断乳腺癌。本发明是基 于上述发现完成的。


【发明内容】

[0007] 技术问题 因此，本发明的目的在于提供一种用于简易地鉴定乳腺癌的方法，该方法利用了血液 中存在的多个生物标记物组的根据乳腺癌发病的变化模式。
[0008] 技术方案 为了达成上述目的，本发明提供用于诊断乳腺癌的蛋白标记物组。
[0009] 此外，本发明提供一种通过利用三重四极杆质谱仪进行多反应监测来检测血液样 本中的生物标记物组的方法。
[0010] 进一步，本发明提供用于乳腺癌的诊断试剂盒，该试剂盒包含组成所述生物标记 物组的每种标记物的特异性抗体。
[0011] 此外，本发明提供一种通过利用组成所述生物标记物组的每种标记物的特异性抗 体进行抗原-抗体结合反应来检测血液样本中的生物标记物组的方法。
[0012] 下面，将更为详细地说明本发明。
[0013] 根据一个实施例，本发明提供用于诊断乳腺癌的生物标记物组，该生物标记物组 包含以下表1展示的五个蛋白标记物中的两个或两个以上的蛋白标记物。本发明的生物标 记物组优选地包含以下五个蛋白标记物中的三个或三个以上的蛋白标记物，更优选地包含 以下五个蛋白标记物中的四个或四个以上的蛋白标记物，最优选地包含以下五个蛋白标记 物。
[0014] 【表1】

【权利要求】
1. 一种用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其包含选自以下各项的两个或两个以上的蛋 白标记物：如SEQ ID NO: 1所示的载脂蛋白C1、如SEQ ID NO: 2所示的载脂蛋白（a)、如 SEQ ID NO: 3所示的神经细胞粘附分子L1样蛋白、如SEQ ID NO: 4所示的碳酸酐酶1、以 及如SEQ ID NO: 5所示的纤维连接蛋白。
2. 根据权利要求1所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于，所述生物标 记物组包含上述五个蛋白标记物中的三个蛋白标记物。
3. 根据权利要求1所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于，所述生物标 记物组包含上述五个蛋白标记物中的四个蛋白标记物。
4. 根据权利要求1所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于，所述生物标 记物组包含上述的五个蛋白标记物。
5. 根据权利要求1?4中任一项所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组，其特征在于， 与非患者对照组相比，载脂蛋白C1表达水平的减少、载脂蛋白（a)表达水平的增加、神经细 胞粘附分子L1样蛋白表达水平的增加、碳酸酐酶1表达水平的增加、以及纤维连接蛋白表 达水平的增加，表明乳腺癌的发病。
6. 权利要求1?4中任一项所述的用于诊断乳腺癌的生物标记物组的检测方法，该方 法利用三重四极杆质谱仪通过多反应监测来在血液样本中检测所述生物标记物组。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： i) 将受试者血液样本的蛋白质和对照组血液样本的蛋白质制成肽片段； ii) 将上述肽片段导入三重四极杆质谱仪，并对分别代表载脂蛋白C1、载脂蛋白（a)、 神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白的靶肽中的两个或两个以上靶肽 进行多反应监测； iii) 将所述多反应监测结果表示成相对于内标物的百分比；以及 iv) 将与所述受试者和所述对照组有关的检测结果进行比较。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，代表载脂蛋白C1的靶肽具有序列SEQ ID NO: 6且该祀肽的一对母离子和子离子分别为m/z 526. 8和m/z 605. 3;代表载脂蛋白（a) 的靶肽具有序列SEQ ID NO: 7且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 521. 8和m/z 634. 3;代表神经细胞粘附分子L1样蛋白的靶肽具有序列SEQ ID NO: 8且该靶肽的一对 母离子和子离子分别为m/z 642. 8和m/z 836. 4 ;代表碳酸酐酶1的靶肽具有序列SEQ ID NO: 9且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 485. 8和m/z 758. 4;并且，代表纤维连 接蛋白的靶肽具有序列SEQ ID NO: 10且该靶肽的一对母离子和子离子分别为m/z 555.8 和 m/z 821. 4。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，大肠杆菌￠-半乳糖苷酶被用作内标 物，而且代表大肠杆菌￠-半乳糖苷酶的靶肽具有序列SEQ ID NO: 11且一对母离子和子 离子分别为m/z 542. 3和m/z 636. 3。
10. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样本为血浆或血清。
11. 一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其包括有关各蛋白的靶肽及该靶肽的一对母离子 和子离子的信息，在通过多反应监测来在血液样本中检测权利要求1?4中任一项所述的 用于诊断乳腺癌的生物标记物组时需要所述信息。
12. -种用于诊断乳腺癌的试剂盒，该试剂盒用来在血液样本中检测载脂蛋白C1、载 脂蛋白（a)、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白的靶肽中的两个或两 个以上的蛋白标记物，该试剂盒包含与上述蛋白标记物中的各个蛋白标记物特异性结合的 两个或两个以上抗体。
13. 根据权利要求12所述的用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用来 检测所述五个蛋白标记物。
14. 根据权利要求12或13所述的用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述抗体为 多克隆抗体或单克隆抗体。
15. 根据权利要求12或13所述的用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 进一步包含：二级抗体结合物，该二级抗体结合物与通过同基质反应而显色的标记物结合； 与所述标记物进行显色反应的显色基质溶液；清洗液；以及酶反应终止液。
16. 根据权利要求15所述的用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述二级抗体结 合物选自辣根过氧化物酶（HRP )、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素和燃料。
17. 根据权利要求15所述的用于诊断乳腺癌的试剂盒，其特征在于，所述显色基质选 自3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)、2, 2' -连氮基-双（3 -乙基苯并噻唑-6 -磺酸 (ABTS)和邻苯二胺（OPD)。
18. -种检测方法，该方法利用与以下各蛋白标记物特异性结合的抗体、通过抗原-抗 体结合反应来在血液样本中检测选自载脂蛋白C1、载脂蛋白（a)、神经细胞粘附分子L1样 蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白的两个或两个以上的蛋白标记物。
19. 根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： i) 在固定体上涂敷或固定从受试者的血液样本中获得的蛋白质和从对照组的血液样 本中获得的蛋白质； ii) 在上述固定体上加入载脂蛋白C1、载脂蛋白（a)、神经细胞粘附分子L1样蛋白、碳 酸酐酶1和纤维连接蛋白中各蛋白的特异性抗体中的两个或两个以上抗体以进行抗原-抗 体结合反应； iii) 通过利用二级抗体结合物和显色基质溶液来检测通过所述抗原-抗体结合反应 所生成的抗原-抗体结合反应产物；以及 iv) 将与所述受试者的血液样本和所述对照组的血液样本有关的检测结果进行比较。
20. 根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述方法包括对所述五个蛋白标 记物进行检测。
21. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤i)的样本为血浆或血清。
22. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤i)的固定体选自硝酸纤维素 膜、PVDF膜、由聚乙烯醇树脂或聚苯乙烯树脂合成的孔板和由玻璃组成的载玻片。
23. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤ii)的抗原-抗体结合反应 选自酶联免疫吸附分析法（ELISA)、放射免疫分析法（RIA)、夹心法、免疫印迹法、免疫沉淀 法、免疫组织化学染色法、荧光免疫分析法、酶基质着色法和抗原抗体聚集法。
24. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤iii)的二级抗体结合物的标 记物选自辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素和燃料。
25. 根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤iii)的显色基质选自3, 3'， 5,5' -四甲基联苯胺（TMB)、2,2' -连氮基-双（3 -乙基苯并噻唑-6 -磺酸（ABTS)和 邻苯二胺（OPD)。
26. -种用于诊断乳腺癌的生物芯片，其中与载脂蛋白Cl、载脂蛋白（a)、神经细胞粘 附分子L1样蛋白、碳酸酐酶1和纤维连接蛋白中的各蛋白特异性结合的抗体中的两个或两 个以上抗体被集成到一固体基质上。
27. 根据权利要求26所述的生物芯片，其特征在于，所述五个抗体被集成到一固体基 质上。
28. 根据权利要求26或27所述的生物芯片，其特征在于，所述固体基质选自塑料、玻 璃、金属和硅胶。
【文档编号】G01N33/53GK104395757SQ201380013325
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年3月8日 优先权日:2012年3月8日
【发明者】李宪秀, 申惠胜, 姜云范, 卢东荣, 文炯坤 申请人:佰欧米迪恩公司, 首尔大学校产学协力团