用于诊断阿扎胞苷耐药性的试验的制作方法

用于诊断阿扎胞苷耐药性的试验的制作方法
【专利摘要】本发明涉及使用包含在取自患者生物流体样品中的BCL2L10蛋白质，预测所述患者对阿扎胞治疗苷治疗的耐药性的体外分析方法以及特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子。其特征在于从患者中取出生物流体样品；计算所述生物流体样品中表达BCL2L10蛋白质的总细胞的百分比；将该计算的百分比与参比阈值进行比较，该阈值介于20％和60％之间；并所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比大于所述参比值的患者被诊断为对阿扎胞苷治疗有耐药性。
【专利说明】用于诊断阿扎胞音耐药性的试验

【技术领域】
[0001] 本发明涉及能够体外诊断患者对阿扎胞巧治疗的耐药性的分析方法。本发明还涉 及使得能够预测患者对阿扎胞巧治疗的耐药性的体外分析试剂盒W及所述试剂盒的用途。

【背景技术】
[0002] NHa 人O HO. W U OH Ih
[0003] 具有上式的阿扎胞巧是目前患有不适于造血干细胞移植的骨髓增生异常综合征 (MD巧和急性髓细胞白血病（AML)的患者的唯一被认可的治疗。阿扎胞巧还使用Vidaza⑩ 的名称销售用于治疗该些疾病。
[0004] 阿扎胞巧（AZA)是一种在该两种疾病中产生40%-60%反应的低甲基化剂 化ypomethylating agent)D
[0005] 骨髓增生异常综合征（MD巧和急性髓细胞白血病（AML)是发生于骨髓干细胞的髓 系血液病，骨髓干细胞包含相当于白细胞的粒细胞系的前体、相当于红细胞的成红细胞系 的前体、相当于血小板的巨核细胞系的前体和组织-单核细胞系的前体。MDS的特征在于粒 细胞、红细胞和巨核细胞骨髓细胞系的一种或所有H种的严重成熟障碍（其是引起血细胞 减少症的原因）。DMS可发展成为急性白血病（AL)。传统上，诊断W血液和骨髓的细胞学研 究、细胞遗传学和分子生物学为基础。DMS包括各种类型的贫血或难治性血细胞减少症W及 5q-综合征。
[0006] AML的特征在于粒细胞、红细胞和巨核细胞系H种的骨髓前体的快速增殖，导致不 成熟细胞在血液和骨髓中蓄积，破坏了正常的血细胞生成。其诊断基于与用于MDS的相同 技术。AML包括未分化型AML、极低分化型AML、髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、粒-单 核细胞性白血病W及急性红细胞性白血病和急性成巨核细胞性白血病。原发性或继发性 AML可能是在各种器官或组织（皮肤、神经节、乳腺、消化道、脾等）中形成肿瘤的原因，产生 了髓系肉瘤，亦称绿色瘤或粒细胞肉瘤。AML可表现为急性白血病，并且与恶性淋己瘤一起 提出了诊断难题。
[0007] 用阿扎胞巧治疗的MDS或AML患者对阿扎胞巧有耐药性（"AZA耐药"）或对阿扎 胞巧敏感（"AZA敏感"）。然而，甚至"AZA敏感"患者在差不多的一段时间过去后，似乎都 遭到全身性复发。
[000引换句话说，即使40%用阿扎胞巧治疗的患者立即有耐药性，且约60%的患者在最 初数月对所述治疗敏感，全部患者在短期或中期都将发生对该种治疗的耐药性。该种现象 在传统上被称为复发，是指对患者W前对之敏感的治疗产生耐药性。
[0009] 现行的预后评级系统使得可能预测和预计用低甲基化剂治疗的患者的总体生存。 该些系统基于患者亚群中所评价的预后评分。该些是由患者的核型研究和某些临床特征限 定的风险群。然而，与该些评级系统有关的结果是不可靠的反应预测因子。
[0010] MDS患者中有一半具有正常核型，并且具有相同染色体异常的患者常常在临床上 是异质的。体细胞点突变常见于MDS。基因TP53、EZ肥、ETV6、RUNX1和ASXLl的突变是MDS 患者中总体生存率低的预测因子，其独立于其它已确立的危险因子。
[0011] 然而，现有系统不提供在不给予患者所述治疗的情况下能够诊断患者对阿扎胞巧 的敏感性的合适结果。
[0012] 目前，用于测定患者是否对阿扎胞巧治疗有耐药性的唯一的已知方法是将所述治 疗给予患者至少6个月，并确定所述治疗是否有效果。
[0013] 使用该相同方法来鉴定患者的复发。实际上，目前已知的鉴定患者复发的唯一方 法是确定阿扎胞巧治疗对患者不再有效的时间。不存在在相关症状出现之前能够预测该种 复发的时间的方法。
[0014] 当被建议用于MDS和/或AML患者时，阿扎胞巧治疗是每日皮下注射至上臂、大腿 或腹部7天，接着21天的休息期。可能产生多种较严重或不太严重的不良反应，例如颇内出 血、败血症、血压变化、嗜睡、全身不适感和脱发。另外，阿扎胞巧治疗的费用相当可观。每 年治疗约为80, 000欧元。因此目前没有可靠且便宜地诊断患者对阿扎胞巧治疗是敏感还 是耐药的方法。
[0015] 另外，目前需要预测患者对阿扎胞巧治疗的耐药性W避免将阿扎胞巧给予该治疗 对其无效的患者，不论是从其给药开始无效，还是在所述患者产生耐药性的数月之后无效。 实际上，将该类治疗给予耐药患者是强制性的，对患者可能是有危险的，并且还可产生相当 大的不必要的费用。该适用于建议MDS和/或AML患者阿扎胞巧治疗的两种情况，并适用 于所有治疗性阿扎胞巧治疗。实际上，阿扎胞巧耐药性与阿扎胞巧分子有关，而非其给予的 方式。
[0016] 更快地鉴定立即产生耐药性的患者W及最初是敏感的患者的复发时间的能力也 是有利的，因为它使得可能在所述患者的临床病况恶化之前提供其它的临床试验。
[0017] 因此能够尽早诊断是必要的，不论患者将对阿扎胞巧治疗敏感，还是能够预测患 者的复发时间。
[0018] 出乎意料的是，本 申请人:能够证实取自患者的生物流体样品中B化化10蛋白质的 表达水平与该患者对阿扎胞巧治疗的敏感性之间的联系。
[0019] 在整个说明书中，通用术语B化2L10定义为相当于B化2L10基因、B化化10 RNA转 录物或B化2L10蛋白质。
[0020] B化化10基因是具有体外促调亡作用的Bcl-2家族的成员。B化化10蛋白质与 Bcl-2蛋白家族都具有BHUBH4和肌2结构域。作为Bcl-2家族促调亡因子特有的B册结 构域不存在于B化2L10蛋白质中。然而，在有关B化2L10的促调亡或抗调亡性质的文献中 仍然有相互矛盾的结果，特别是因为其在小鼠中的假定的直向同源物（Odholog)也被描 述为具有促调亡活性。
[0021] B化化10可与Bcl-2家族的成员，特别是Bd-2、Bd-xL和Bax相互作用，W调节 不同情况下的细胞调亡。某些出版物例如论文"Loss of B化化10 protein expression as prognostic predictor for poor clinical outcome in gastric carcinoma(BCL2L10 蛋白质表达丧失作为胃癌中临床结局差的预后预测因子），化Stopathology 2010, 57, 814-82"提出B化化10是一种抗调亡基因。
[0022] B化化10的过量表达被描述为通过抑制由线粒体释放的细胞色素C遏制细胞调 亡。
[002引最近表明，低甲基化剂地西他滨引发细胞调亡和许多基因（包括B化2L10)的 正调节，亦称"增量调节"。现今，已表明患者对某些抗癌治疗的抗性和BCL2L10基因的 表达之间有关系，特别在专利申请JP201016203UA)中，该申请描述了该样的事实，即 B化化10基因的扩增使得能够检测对基于喜树碱的治疗有耐药性的癌细胞。同样，专利申请 US2009143236(A1)描述了通过研究某些基因（特别包括BCL2L10)的扩增来检测某些药物 耐药性获得的方法。然而，在该两项专利申请中，对其耐药性进行了评价的抗癌剂不包括阿 扎胞巧。
[0024] 专利申请US2011/0129833表明患者中Bcl-2家族基因表达的增加与将响应化疗 治疗的患者的可能性降低关联。然而，该专利申请中丝毫未提到该个结论适用于基于阿扎 胞巧的治疗。
[00巧]论文 "Role of B化2L10 methylation and TET2 mutations in M曲er risk myelodysplastic (较高危骨髓增生异常中B化2L10甲基化和TET2突变的作 用），Le址emia. 2011 Dec ;25(12)"描述了阿扎胞巧耐药性的现象。该文件描述了 B化2L10 基因启动子的甲基化和阿扎胞巧耐药性之间的关联的存在。具体地讲，B化化10基因启动子 过度甲基化与患有胃癌的患者的低生存率关联。该出版物教导了具有高甲基化的BCL2L10 启动子的患者患MDS的风险高和响应外遗传治疗（例如阿扎胞巧治疗）的机会小。然而， 该出版物丝毫未教导BCL2L10蛋白质的高水平表达能够得出相同结论。
[0026] 取而代之的是，该出版物提出正是BCL2L10表达的低水平与响应阿扎胞巧的机会 小有关。另外，即使高水平的BCL2L10甲基化确实与对阿扎胞巧治疗的耐药性有关，该个数 据也不会与BCL2L10蛋白质的表达水平相关联。实际上，基因的甲基化水平不必与产生自 所述基因的蛋白质的表达有关。特别是在BCL2L10的情况下。
[0027] 另外，鉴于上述先有技术，丝毫未提出在BCL2L10蛋白质的表达水平和阿扎胞巧 耐药性现象之间存在联系。并且更加丝毫未提出在BCL2L10蛋白质的高表达水平和阿扎胞 巧耐药性之间存在关系。


【发明内容】

[0028] 所述问题的解决办法涉及使用包含在取自所述患者的生物流体样品中的BCL2L10 蛋白质W及特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子，使得可诊断患者的阿扎胞巧治疗耐药 性的体外分析方法，其特征在于：
[0029] -从患者中取得生物流体样品；
[0030] -计算所述生物流体中表达B化化10蛋白质的总细胞的百分比；
[003。-将所述计算的百分比与参比阔值进行比较，所述阔值介于20%和60%之间；和
[003引-所述生物流体中表达B化2L10蛋白质的细胞的百分比高于所述参比值的患者被 诊断为对阿扎胞巧治疗有耐药性。
[0033] 出乎意料的是，本 申请人:表明在表达BCL2L10蛋白质的患者生物流体细胞的百分 比和阿扎胞巧耐药性之间关系的存在。
[0034] W前从未提出用于该百分比的参比阔值的测定，超出该参比阔值，便可断定患者 对阿扎胞巧耐药。
[0035] 该种方法使得可能在给予患者所述阿扎胞巧分子之前诊断出患者的阿扎胞巧耐 药性。该种方法还使得可能有利地预测之前对阿扎胞巧治疗敏感的患者的复发。
[0036] 本发明的分析方法使得可避免用阿扎胞巧对患者的任何不必要的治疗。因此就患 者的健康和适当治疗而言，W及经济观点来看，该是有利的。本发明的第二个目的涉及能够 进行本发明的体外分析方法的用于体外分析的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合从取自 患者的生物流体获取的细胞中的BCL2L10蛋白质的生物分子。
[0037] 最后，本发明的第H个目的涉及本发明的体外分析试剂盒用于实施监测阿扎胞巧 治疗W预测复发的方法中的用途。
[0038] 为了更好地理解与体外阿扎胞巧耐药性有关的机制，本发明人制备了阿扎胞巧耐 药性SKMl髓样细胞，称为AZA-R或SKM^R。相比之下，AZA-S或SKMl-S是阿扎胞巧敏感细 胞。

【专利附图】

【附图说明】
[0039] 在阅读下列有关附图给出的非限制性描述，将更好地理解本发明，其中：
[0040] 图1显示筛选获自表达Bcl-2蛋白的SKMl细胞系的细胞的结果。SKMl-S和SKM^R 细胞用1 U M阿扎胞巧处理24小时。然后进行蛋白质印迹实验W评价Bd-2、Md-l、Bd-xl 和B化2L10蛋白质的量。抗服P60抗体用作加载对照。
[0041] 图2-6显示患AML的SKMl-S和SKMl-R细胞系中B化化10蛋白质的表达。
[0042] 在图2、3和4中，通过流式细胞术，定量测定SKMl-S和SKMl-R细胞中的B化2L10 蛋白质水平。
[0043] 图5显示通过逆转录酶聚合链式反应（称为RT-PCR)进行的SKMl-S和SKMl-R细 胞的mRNA分析。
[0044] 图6显示能够观察SKM^S和SKM^R细胞中B化化10蛋白质水平的蛋白质印迹结 果。
[0045] 图7-10显示SKMl-R细胞对阿扎胞巧重新敏感，接着消除B化2L10基因表达。 B化化10基因表达的消除通常称为"敲减"，在该种情况下为B化2L10敲减。
[0046] SKMl-S 和 SK]\a-R 细胞用 W下干扰 RNA 转染；Luc siRNA、BCL2L10siRNA 或 Bd-2 siRNA。转染72小时后，细胞用I y M阿扎胞巧刺激。
[0047] 图7中，通过XTT试验（木糖耐量试验），在刺激24小时后测量细胞代谢。所示结 果等于进行了 4次的3个独立实验的平均值的平均标准误差（ + SEM)。
[0048] 图8显示在加入1 U M阿扎胞巧后24小时通过流式细胞术观察到的脫天蛋白酶-3 标记的结果。
[0049] 图9显示在加入1 U M阿扎胞巧后24小时通过流式细胞术所得的楓化丙锭（PI) 标记的结果。
[0050] 图10显示为了测定BCL2L10和Bcl-2表达的抑制在加入1 U M阿扎胞巧后24小 时进行的蛋白质印迹的结果。
[005。 图11、12和13中，显示了 B化化10的蛋白质表达在阿扎胞巧耐药患者中特异性增 加。
[0052] 图11显示通过对7名健康患者、7名阿扎胞巧敏感患者和5名阿扎胞巧耐药患者 的"新鲜"骨髓样品进行蛋白质印迹检出的B化2L10、Bcl-2和邸K蛋白质的表达。显示了 各亚群中两名患者的蛋白质印迹结果。
[0053] 图 12 显不借助 ImageJ 软件程序（ImageJ 是由 P^Jational Insti1:ute of Health(NIH)编写于化va中的用于图像处理的免费软件程序）分析的B化2L10和E服蛋白 质表达及B化2L10表达与E服表达的比率的定量测定。
[0054] 图13显示借助ImageJ软件程序分析的B化2L10和E服蛋白质表达的定量测定及 B化化10表达与E服表达的比率的定量测定。
[005引 图14-17显示阿扎胞巧耐药MDS或AML患者中，骨髓中表达B化化10蛋白质的细 胞的百分比增加的事实。
[005引图14中，在患有32名患MDS或AML并正进行阿扎胞巧治疗的患者中和在8名健 康患者（全部来自组群1)中，通过流式细胞术，定量测定表达BCL2L10蛋白质的细胞的百 分比。
[0057] 图15中，通过流式细胞术，定量测定冷冻于DMSO的样品中表达B化2L10蛋白质的 细胞的百分比，所述样品来自14名患有低危MDS的患者、31名患有高危MDS或AML且用阿 扎胞巧治疗的患者（全部来自组群2)。
[0058] 通过流式细胞术，定量测定冷冻于DMSO的样品中表达B化2L10蛋白质的细胞的百 分比，所述样品来自16名患有高危MDS的患者或诊断中的患者，如图16所示。
[0059] 通过流式细胞术，定量测定冷冻于DMSO的样品中表达B化2L10蛋白质的细胞的百 分比，所述样品来自15名全都正在进行阿扎胞巧治疗的患有高危MDS或AML的患者，如图 17所示。
[0060] 图18a和18b显示表达B化化10蛋白质的细胞的百分比和接受治疗的MDS或AML 患者的总体生存之间的相关性。
[00川按照Kaplan-Meier,检查了用AZA治疗的MDS或AML患者的具有移植 (transplantation)的总体生存的比较，W及其骨髓中表达BCL2L10的细胞的百分比。
[0062] 图19-22使得可证实通过流式细胞术进行的BCL2L10蛋白质定量技术。
[0063] 图19中，肥K293系的细胞用W下转染：并入B化2L10的Myc表位标签N端部分的 PCDNA3表达质粒或并入仅Myc表位标签的N端部分的PCDNA3表达质粒。通过流式细胞术 定量测定BCL2L10蛋白质表达水平。该实验的结果见图19。
[0064] 图20中，肥K293系的细胞用干扰SiLuc RNA或干扰Si-B化化10 RNA转染。通过 流式细胞术定量测定BCL2L10蛋白质表达水平。该实验的结果见图20。
[0065] 图21和22显示通过蛋白质印迹检测的B化化10蛋白质水平。抗服P60抗体用作 加载对照。

【具体实施方式】
[0066] 本发明涉及分析尤其通过对生物流体总细胞的BCL2L10蛋白质表达进行定量测 定能够体外诊断患者对阿扎胞巧治疗耐药性的方法。
[0067] 按照本发明，患者是人类。有利的是，该分析方法特别适于恶性血液病（例如髓系 血液病）的患者。再准确地说，患者患有AML或MDS。
[0068] 按照本发明，生物流体是从人体获得的流体。作为生物流体的非限制性实例，可提 及骨髓、血液、脑脊液和尿液。优选本发明的生物流体是骨髓。
[0069] 按照本发明，术语"总细胞"涵盖存在于所采集的生物流体中的全部细胞。如果所 采集的生物流体是骨髓，总细胞特别包括造血干细胞化SC)和骨髓间质细胞，它们是造血 细胞。
[0070] 按照本发明，特异性结合B化2L10蛋白质的生物分子是能够特异性结合B化2L10 蛋白质的分子。有利的是，该些是单克隆或多克隆抗体、可溶性受体或适配体，优选单克隆 或多克隆抗体。还优选特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子为单克隆抗体。作为特异性 结合BCL2L10蛋白质的生物分子的非限制性实例，可提及"Cell Si即aling化chnologies" 公司参考号为"#3869"的抗B化2L10蛋白质。
[OCm] 按照本发明，参比阔值，亦称"截止"值，相当于生物流体中B化2L10阳性细胞的百 分比，即表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比。
[007引当所获得的生物流体总细胞中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比值大于该"截 止"值时，受测试的患者可诊断为对阿扎胞巧耐药。相反地，当所获得的值低于该"截止"值 时，受测试的患者可诊断为对阿扎胞巧敏感。
[0073] 按照本发明，参比阔值介于20 %和60 %之间，优选介于30 %和55 %，更优选该参 比阔值等于50%。
[0074] 本发明的分析方法使得可诊断患者对阿扎胞巧治疗有耐药性。所述用阿扎胞巧治 疗的患者在其治疗期间每1、3和6个月然后在之后每3个月通常必须进行骨髓抽吸。因此， 所采集的作为阿扎胞巧治疗传统监测一部分的骨髓样品还可用于本发明的分析方法。因此 就该种对阿扎胞巧治疗有耐药性的诊断而言，不一定在患者中进行特定的骨髓抽吸。
[00巧]换句话说，鉴于所述体外分析方法能够诊断患者的阿扎胞巧耐药性，因此不必进 行在传统治疗情况下对所抽吸的骨髓样品进行的额外检查，该对患者是有利的。
[0076] 按照本发明，生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比的测量通过流式细 胞术（免疫分型）、疏水作用色谱法化IC)或定量聚合酶链式反应（qPCR)进行。优选该种 测量通过流式细胞术（免疫分型）进行。
[0077] 本发明还涉及通过检测包含在取自所述患者的生物流体样品中的BCL2L10基因 的过量表达，能够诊断患者的阿扎胞巧治疗耐药性的体外分析方法，其特征在于：
[0078] -从患者中取得生物流体样品；
[0079] -通过检测B化2L10基因的过量表达，计算所述生物流体中表达B化2L10的总细胞 的百分比；
[0080] -将所述计算的百分比与参比阔值进行比较，所述阔值介于20%和60%之间；和
[0081] -所述生物流体中表达BCL2L10的细胞的百分比大于所述参比阔值的患者被诊断 为对阿扎胞巧治疗有耐药性。
[0082] B化化10基因过量表达的检测优先通过比较基因组杂交CO!方法、流式细胞术方 法、ELISA方法、DNA芯片方法或定量聚合链式反应（quantitative polymerization chain reaction) (qPCR)进行。B化化10基因过量表达的检测更优先通过比较基因组杂交CO!方 法、DNA芯片方法或定量聚合链式反应（qPCR)进行。B化化10基因过量表达的检测还更优 先通过DNA芯片方法或定量聚合链式反应（qPCR)进行。
[0083] 本发明还涉及包含特异性结合取自患者的生物流体样品的细胞中的BCL2L10蛋 白质的生物分子的体外分析试剂盒，所述试剂盒使得可预测所述生物流体中表达BCL2L10 蛋白质的细胞的百分比大于介于20%和60%之间的参比阔值的患者对阿扎胞巧治疗有耐 药性。
[0084] 还涉及包含选自W下的至少一种试剂的体外分析试剂盒：
[00财-能够扩增B化化10片段的一对引物，和
[0086] -能够检测B化化10存在的探针，
[0087] 所述试剂盒使得可预测所述生物流体中表达BCL2L10的细胞的百分比大于介于 20%和60%之间的参比阔值的患者对阿扎胞巧治疗有耐药性。
[0088] 本发明的另一个目的涉及本发明的试剂盒或方法在实施监测阿扎胞巧治疗W预 测复发的方法中的用途。
[0089] 按照本发明的一个具体实施方案，使用本发明的试剂盒或方法还使得可根据患者 的反应修改治疗。
[0090] 按照本发明的一个具体实施方案，当患者特别是患有骨髓增生异常综合征和/或 急性髓细胞白血病的患者诊断出阿扎胞巧治疗耐药性时，将包括至少一种抗肿瘤药和/或 抗炎药在内的替代治疗给予所述患者。
[0091] 优选将选自焼化剂、抗代谢物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和抗肿瘤抗生素的 抗肿瘤化合物给予所述患者。
[0092] 作为可按照本发明使用的抗肿瘤药的非限制性实例，特别可提及阿卡地新（亦称 AICAR，为5-氨基咪哇-4-甲醜胺-1-目-D-巧喃核糖巧的简称）、阿卡地新的衍生物、放 线菌素D、安吓巧、意环类例如多柔比星或柔红霉素、阿糖胞巧（aracytin)、ATRA(全反式 维甲酸）、博来霉素、测替佐米、白消安、喜树碱的衍生物、顺笛、卡笛、苯下酸氮芥、地西他 滨、德己金（Cbpakine)、多西他赛、表鬼白毒素的衍生物、埃罗替尼、依巧泊巧、5-氣尿嚼巧 巧即)、氣达拉滨、轻基脈、异环磯醜胺、组蛋白脱己醜酶（HDAC)抑制剂、来那度胺、甲氨蝶 岭、丝裂霉素C、紫杉醇、普卡霉素、琉基嘿岭、塞替派、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。还可提 及用于不同肿瘤病理学的酪氨酸激酶抑制剂（TKI)，例如伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼和 舒尼替尼。
[0093] 可W使用的阿卡地新的衍生物、其外消旋体、对映体和非对映体及其混合物、其互 变异构体及其药学上可接受的盐优选具有W下通式：
[0094]

【权利要求】
1. 一种使用包含在取自患者的生物流体样品中的BCL2L10蛋白质以及特异性结合 BCL2L10蛋白质的生物分子，使得可诊断所述患者的阿扎胞苷治疗耐药性的体外分析方法， 其特征在于： -从患者中取得生物流体样品； -计算所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的总细胞的百分比； -将所述计算的百分比与参比阈值进行比较，所述阈值介于20%和60%之间；和 -所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比高于所述参比值的患者被诊断 为对阿扎胞苷治疗有耐药性。
2. 权利要求1的方法，其特征在于所述生物流体是骨髓。
3. 权利要求1或2之一的方法，其特征在于所述参比阈值等于50%。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质 的细胞的百分比的测量通过流式细胞术、疏水作用色谱法（HIC)或定量聚合酶链式反应 (qPCR)进行，优选通过流式细胞术进行。
5. 权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于所述特异性结合BCL2L10蛋白质的生物 分子是对BCL2L10蛋白质有特异性的抗体。
6. -种通过检测包含在取自患者的生物流体样品中的BCL2L10基因的过量表达，使得 可诊断所述患者的阿扎胞苷治疗耐药性的体外分析方法，其特征在于： -从患者中取得生物流体样品； -通过检测BCL2L10基因的过量表达，计算所述生物流体中表达BCL2L10的总细胞的百 分比； -将所述计算的百分比与参比阈值进行比较，所述阈值介于20%和60%之间；和 -所述生物流体中表达BCL2L10的细胞的百分比大于所述参比阈值的患者被诊断为对 阿扎胞苷治疗有耐药性。
7. 权利要求6的方法，其特征在于BCL2L10基因过量表达的检测通过比较基因组杂交 CGH方法、流式细胞术方法、ELISA方法、DNA芯片方法或定量聚合链式反应（qPCR)进行。
8. 权利要求7的方法，其特征在于BCL2L10基因过量表达的检测通过比较基因组杂交 CGH方法、通过DNA芯片方法或定量聚合链式反应（qPCR)进行。
9. 权利要求8的方法，其特征在于BCL2L10基因过量表达的检测通过DNA芯片方法或 定量聚合链式反应（qPCR)进行。
10. -种包含特异性结合取自患者的生物流体样品细胞中的BCL2L10蛋白质的生物分 子的体外分析试剂盒，所述试剂盒使得可预测所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞 的百分比大于介于20%和60%之间的参比阈值的患者对阿扎胞苷治疗有耐药性。
11. 权利要求6的分析试剂盒，其特征在于所述生物流体是骨髓。
12. -种包含选自以下至少一种试剂的体外分析试剂盒： -能够扩增BCL2L10片段的一对引物，和 -能够检测BCL2L10存在的探针， 所述试剂盒使得可预测所述生物流体中表达BCL2L10的细胞的百分比大于介于20% 和60 %之间的参比阈值的患者对阿扎胞苷治疗有耐药性。
13. 权利要求10、11或12的试剂盒在实施用于监测阿扎胞苷治疗以预测复发的方法中 的用途。
14. 权利要求13的试剂盒的用途，其特征在于使得能够根据所述患者的反应修改所述 治疗。
15. 权利要求13或14的用途，其特征在于所述患者患有骨髓增生异常综合征和/或急 性髓细胞白血病。
【文档编号】G01N33/50GK104321649SQ201380013105
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2012年2月28日
【发明者】托马斯·克鲁塞奥, 帕特里克·奥伯格, 基洛姆·罗伯特, 弗雷德里克·卢西亚诺 申请人:尼斯-索菲亚·安蒂波利斯大学, 尼斯大学中心医院, 国家健康和医学研究院