一种用于结直肠癌中相关基因启动子甲基化的检测方法与流程

本发明涉及用于结直肠癌相关基因启动子超甲基化的新型标记物，本发明结直肠癌相关基因超甲基化状态检测技术领域，特别是涉及一种甲基化荧光PCR定性检测大肠癌技术。

背景技术：

随着人民生活水平的提高，大肠癌（包括结直肠癌）已成为我国常见恶性肿瘤之一。截至2012年，我国大肠癌死亡率已跃居各肿瘤第五位，发病率也以每年4.2%的速率递增。大肠癌及相关疾病已成为危害我国人民健康的重要因素。

由于大肠癌早期症状不明显，仅有不适、消化不良、大便潜血等等，难以引起注意，加上人们长期以来缺乏体检意识，约有34%的患者入院即诊断为中晚期，并常伴有全身转移，大大降低了治疗效果。因此，迫切需要一种能够达成早期诊断。准确率高并且无痛苦的大肠癌检测技术。

目前，市场上已有数种粪便检测试剂盒，可对粪便隐血及其中少量蛋白进行检测，但由于粪便样本数量的限制等因素，无法检测出粪便中少量DNA等分子标记物，而这类分子标记物已被证实具有高参考价值，特别是对于大肠癌等消化道肿瘤的早期诊断具有重要意义。肠镜是一种侵入性检查，可能有并发症的发生，给病人带来的痛苦让患者望而生畏。因此，改进现有技术以提高检测能力，对于提高大肠癌的早期诊断率至关重要。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测大肠癌相关基因的甲基化荧光PCR技术，包括相关引物和探针组合物。与传统检测方法相比，本方案针对性更强，能够有效避免假阳性，大大提高大肠癌早期诊断率，同时具有容易操作、经济高效的特性。

为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：

a 提取粪便中DNA；

b 对提取DNA进行甲基化修饰；

c 采用PCR引物及探针对步骤b中所述的修饰后DNA进行荧光定性检测；

d 根据荧光PCR中手机的荧光信号形成的扩增曲线，分析提取DNA中中是否存在大肠癌早期DNA

所述的荧光PCR定性检测中，采用引物及探针序列如下：

FBN1

上游引物GAGTTATAGTTGGGATAGTTGCGAGC

下游引物 AACGACGACTCCGACTCCC

探针 6FAM-CGCTACAACCACTACTCGA-MGB

SNCA

上游引物 GCGTTTTGGGCGTTTTTTTAC

下游引物 CGCTATAAACCGACGACGC

探针 6FAM-CGCTAACCTATCGTCGAA-MGB

SPG20

上游引物 GCGCGTCGTGGAACGT

下游引物 CTACGCTCGCCGAAAACC

探针 6FAM-CGCGCTTACCGTAACAA-MGB

所属的试剂盒组成包括

本发明的原理是基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点；

本发明的创新之处在于通过荧光PCR技术，检测粪便样本中大肠癌早期相关基因。相对于传统技术，本方法中基因具有特异性，准确性高达95%，操作简便，经济便捷，具有良好的临床实用价值。

附图说明

图1 荧光PCR定性检测FBN1扩增图

图2荧光PCR定性检测SNCA扩增图

图3荧光PCR定性检测SPG20扩增图

图中：包含四个样本，阳性对照A，阳性病例B，阴性对照C，阴性病D。

具体实施方式

反应体系的建立与优化

PCR反应体系

引物和探针浓度的优化

DNA甲基化方法：

1、将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

2、加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

3、42℃水浴30min； 水浴期间配制；

4、10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5、加3.6M亚硫酸氢钠520ul至上述水浴后溶液中；

6、EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；

7、加200 ul石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化；

8、50℃避光水浴16h。